Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Beta-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI
β-GALAKTOSIDASE Lactobacillus plantarum B 123
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemurnian Parsial dan
Karakterisasi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123 adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Tema dan dana penelitian ini
merupakan bagian dari Proyek DIPA TEMATIK Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Bellen Nastitie Pamela Fury
NIM G84100046
iii
ABSTRAK
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi βGalaktosidase Lactobacillus plantarum B 123. Dibimbing oleh SYAMSUL
FALAH dan TATIK KHUSNIATI.
Intoleransi laktosa merupakan masalah yang dihadapi oleh sebagian besar
populasi di dunia. Masalah ini dapat diatasi dengan menghidrolisis laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa dengan β-galaktosidase. β-Galaktosidase
ditemukan secara luas di alam dan diproduksi oleh sejumlah mikroorganisme.
Namun, karakteristik setiap β-galaktosidase sangat berbeda dan bervariasi
berdasarkan sumber mikroorganisme. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
pemurnian dan karakterisasi β-galaktosidase L. plantarum B 123. β-Galaktosidase
diekstraksi dan dimurnikan secara parsial dengan pengendapan amonium sulfat
dan dialisis. Tahapan ini menghasilkan pemurnian 7.61 kali lipat, rendemen
10.67%, dan aktivitas spesifik 61.53 U/mg protein. Suhu dan pH optimum βgalaktosidase hasil dialisis tercapai pada suhu 50 °C dan pH 7.0. Ion-ion logam
Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+ 10 mM meningkatkan aktivitas β-galaktosidase kasar,
sedangkan ion-ion logam Cu2+, Hg2+, Ca2+ 10 mM menghambat aktivitas βgalaktosidase kasar. Nilai KM dan Vmaks β-galaktosidase hasil dialisis masingmasing sebesar 1.13 mM dan 7.25 U/mL.
Kata kunci: β-galaktosidase, Lactobacillus plantarum B 123, dialisis, karakterisasi
ABSTRACT
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY. Partial Purification and Characterization
of β-Galactosidase Lactobacillus plantarum B 123. Supervised by SYAMSUL
FALAH and TATIK KHUSNIATI.
Lactose intolerance was a problem faced by a large proportion of the
world's population. These problem could be alleviated by hydrolyzing lactose to
glucose and galactose by β-galactosidase. β-Galactosidase occurred widely in
nature and it was produced by a number of microorganisms. However, their
characteristics were very different and it varied with the source of microorganism.
The aim of this study was purification and characterization of β-galactosidase L.
plantarum B 123. β-Galactosidase was extracted and partially purified by
ammonium sulfate precipitation and dialysis. These steps resulted a purification
level of 7.61 fold, a yield of 10.67%, and a specific activity of 61.53 U/mg protein.
Optimum temperature and pH for dialyzed β-galactosidase were optimized at
50 °C and 7.0, respectively. Metal ions of Mg2+, Mn2+, Co2+, and Zn2+ in 10 mM
stimulated the activity of crude β-galactosidase, while metal ions of Cu2+, Hg2+,
and Ca2+ in 10 mM inhibited the activity of crude β-galactosidase. KM and Vmax
for this dialyzed β-galactosidase were 1.13 mM and 7.25 U/mL, respectively.
Key words: β-galactosidase, Lactobacillus plantarum B 123, dialysis,
characterization
PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI
β-GALAKTOSIDASE Lactobacillus plantarum B 123
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
v
vii
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil alamin, puji syukur yang tak terhingga kepada Allah
SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis mampu
menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini dengan sebaik-baiknya. Shalawat
dan salam senantiasa terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, serta
para sahabatnya.
Ucapan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan
kepada Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dan Prof Dr Ir Tatik Khusniati, MAppSc
selaku pembimbing I dan II yang senantiasa meluangkan waktu dan kesempatan
untuk memberikan bimbingan, saran, pengetahuan, dan inspirasi kepada penulis
dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.
Terima kasih penulis ucapkan juga kepada staf Laboratorium Biokimia
Mikroba, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI khususnya kepada
Neneng Karimayati, AMdAL dan Lusiana Kresnawati Hartono, SSi, MSi atas
segala bantuan dan dukungan selama penulis melakukan penelitian disana.
Terima kasih juga atas persahabatan dan persaudaraan yang telah terjalin
selama ini, kepada rekan mahasiswa Biokimia 47 dan para penghuni Pondok Putri
Rahmah.
Tak lupa, ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada ibunda Rieta
Purwati dan ayahanda Ir Widodo yang selalu mengajarkan akan pentingnya
pendidikan, serta kepada kakak An Nasser Bayu Ajie, SE yang selalu memberikan
dukungan serta semangat.
Atas inspirasi dan motivasi dari berbagai pihak, penulis akhirnya mampu
menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini. Kritik dan saran senantiasa penulis
harapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat, terutama untuk
pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya untuk pengembangan ilmu biokimia.
Bogor, September 2014
Bellen Nastitie Pamela Fury
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
4
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
4
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
5
PEMBAHASAN
8
Kondisi Optimum Pertumbuhan Lactobacillus plantarum B 123
8
Produksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
8
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
9
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
SIMPULAN DAN SARAN
10
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
23
ix
DAFTAR GAMBAR
1 Pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan variasi
konsentrasi amonium sulfat
2 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
3 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
4 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
5 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis
5
6
6
7
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Kurva standar oNP dalam analisis aktivitas β-galaktosidase dengan
metode Lu et al. modifikasi (2009)
3 Kurva standar protein dalam analisis protein dengan metode Bradford
(1976)
4 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase yang diukur dengan metode Lu
et al. modifikasi (2009)
5 Hasil pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan
amonium sulfat
6 Hasil pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123
7 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
8 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
9 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
10 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas β-galaktosidase L.
plantarum B 123 hasil dialisis
18
19
19
20
20
20
21
21
21
22
1
PENDAHULUAN
Intoleransi laktosa merupakan masalah yang dihadapi oleh lebih dari 70%
populasi di dunia akibat ketidakmampuan usus halus dalam mengabsorpsi laktosa.
Ketidakmampuan ini disebabkan karena adanya penurunan aktivitas βgalaktosidase yang berperan dalam menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa (Juajun et al 2011). Apabila ketersediaan β-galaktosidase di membran
mukosa usus halus rendah, laktosa tidak dapat dicerna dan akan difermentasi oleh
bakteri usus halus. Proses fermentasi ini akan menimbulkan gas yang
menyebabkan kembung dan rasa sakit di perut. Laktosa yang tidak dicerna akan
tetap berada di dalam saluran cerna, sehingga penyerapan air dari feses menjadi
terganggu. Hal inilah yang menyebabkan penderita intoleransi laktosa mengalami
diare (BPOM 2008). Menurut Kim dan Rajagopal (2000), produk hidrolisis
laktosa memiliki rasa yang lebih manis, mudah dicerna, dan mudah larut,
sehingga dapat dimanfaatkan untuk meringankan pencernaan laktosa.
Menurut Muchtadi et al. (1992), hidrolisis enzimatis memiliki beberapa
keuntungan seperti mampu bekerja secara spesifik, tidak memerlukan pH dan
temperatur ekstrim, serta pemisahan enzim di akhir proses tidak perlu dilakukan
karena konsentrasi enzim yang rendah. Cheetham (1985) juga menyatakan,
pemanfaatan enzim dalam industri pangan dapat mengurangi biaya produksi
karena penggunaannya yang relatif sedikit.
Secara umum enzim dihasilkan dari tiga sumber yaitu hewan, tumbuhan,
dan mikroorganisme. Namun, enzim yang digunakan secara luas dalam bidang
industri adalah berasal dari mikroorganisme karena memiliki beberapa kelebihan
seperti murah, stabil, jumlah enzim yang dihasilkan banyak, mudah
dikembangkan, serta prosedur untuk menghasilkan enzim lebih mudah dan aman
(Cheetham 1985). Lebih lanjut Sani et al. (1999) dan Chen et al. (2009)
mengungkapkan, enzim dari bakteri lebih dipilih karena aktivitasnya yang tinggi
dan optimum pada pH 6.0-7.0, sehingga sangat cocok untuk digunakan dalam
pengolahan produk susu yang memiliki pH 6.8.
Dekade ini, bakteri termofilik telah menjadi objek menarik untuk
menghasilkan β-galaktosidase. Aktivitas β-galaktosidase yang optimum pada suhu
45-80 °C, memberikan keuntungan yang signifikan bagi penerapan enzim
termostabil. Enzim termostabil memiliki beberapa keuntungan seperti kecepatan
reaksi yang lebih besar, risiko kontaminasi mikroba yang lebih kecil, dan enzim
mampu bertahan setengah hidup di bawah kondisi operasional (Chen et al. 2009).
Enzim yang digunakan dalam industri pangan harus memiliki beberapa
persyaratan seperti enzim harus cukup aktif pada kisaran pH, temperatur, dan
konsentrasi substrat yang umum digunakan dalam industri pangan. Enzim juga
harus terbebas dari komponen toksin, karsinogen, dan patogen, serta enzim harus
mudah diperoleh dalam keadaan murni dan stabil dengan aktivitas yang terkontrol
(Muchtadi et al. 1992). β-Galaktosidase yang digunakan pada penelitian ini
diisolasi dari Lactobacillus plantarum B 123 yang telah diakui sebagai GRAS
(Generally Recognized as Safe), sehingga dapat digunakan dalam industri pangan
karena terbebas dari endotoksin apapun. L. plantarum B 123 diisolasi dari sayuran
fermentasi tradisonal, koleksi Pusat Penelitan Biologi, LIPI dan telah dilakukan
pengujian aktivitas awal memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi.
2
Kurva pertumbuhan L. plantarum B 123 sudah diketahui sebelumnya
(Mariyani 2013), namun karakteristik β-galaktosidase L. plantarum B 123 belum
sepenuhnya terungkap. Tujuan penelitian ini adalah melakukan pemurnian parsial
dan karakterisasi β-galaktosidase L. plantarum B 123. Pemurnian β-galaktosidase
L. plantarum B 123 kemungkinan menghasilkan aktivitas β-galaktosidase yang
lebih tinggi dibandingkan dengan tanpa pemurnian (enzim kasar). Hasil penelitian
ini diharapkan dapat bermanfaat dalam pengembangan produk susu rendah laktosa
yang baik untuk dikonsumsi penderita intoleransi laktosa.
METODE
Bahan dan Alat
Media MRS (de Mann Rogosa Sharpe) yang digunakan sebagai media
produksi L. plantarum B 123 indigenous terdiri atas 1% pepton (Difco, France),
0.8% beef extract (Himidia, India), 0.4% yeast extract (Difco, France), 1% laktosa
(Difco, France), 0.1% Tween 80 (Merck, Germany), 0.5% natrium asetat (Merck,
Germany), 0.2% triamonium sitrat (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany),
0.02% magnesium sulfat monohidrat (Merck, Germany), 0.005% mangan sulfat
tetrahidrat (Merck, Germany), dan 0.2% dinatrium hidrogen fosfat dihidrat
(Merck, Germany).
Bahan kimia yang digunakan adalah bufer asetat 0.1 M, bufer fosfat 0.1 M;
0.05 M; 0.01 M, bufer Tris-HCl 0.1 M, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida atau
oNPG (Fluka, Switzerland), o-nitrofenol atau oNP (Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Germany), Na2CO3 1 M (Merck, Germany), bovine serum albumin atau BSA
(Merck, Germany), NaCl 0.15 M, pereaksi Bradford, logam CaCl2; CoCl2; CuCl2;
HgCl2; MnCl2; MgSO4; ZnSO4 10 mM (Merck, Germany), dan amonium sulfat
(Merck, Germany).
Alat yang digunakan adalah pH meter, inkubator (Isuzu, Japan), sentrifuga
(Kubota dan Eppendorf, Japan), sonikator (Ultrasonic homogenizer UH 150 SMT,
Japan), vorteks (Sibata, Japan), penangas air (Memmert, Germany dan Eyela,
Japan), pengaduk magnetik, membran dialisis selofan MWCO 6-8 kDa
(Calbiochem Novagen, Israel), dan spektrofotometer UV-Vis 1700 (Shimadzu,
Japan).
Prosedur Penelitian
Ekstraksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123 (Wang dan
Sakakibara modifikasi 1997)
Ekstraksi enzim dilakukan dengan cara: sebanyak 2% inokulum L.
plantarum B 123 (OD 0.7) dimasukkan ke dalam media produksi MRS steril
(kandungan laktosa 1% dan pH media 8), kemudian diinkubasi di dalam inkubator
dengan suhu 37 oC selama 24 jam. Selanjutnya, dilakukan pemanenan sel dengan
sentrifugasi berkecepatan 9500 rpm dengan suhu 4 oC selama 15 menit. Pelet yang
dihasilkan kemudian dicuci dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.5 (2 kali pencucian).
Pelet yang telah dicuci kemudian ditera dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.5 hingga
dicapai volume akhir 150 mL. Selanjutnya, sel (pelet) dipecah menggunakan
3
sonikator 50 kHz dengan suhu 4 oC selama 15 menit. Setelah sel pecah, dilakukan
pemisahan menggunakan sentrifugasi berkecepatan 9500 rpm dengan suhu 4 oC
selama 15 menit. Supernatan dipisahkan dari peletnya kemudian disimpan di
dalam ruang pendingin. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase L.
plantarum B 123 kasar. β-Galaktosidase kasar ini kemudian diuji aktivitas dan
kadar proteinnya sebelum dimurnikan secara parsial menggunakan pengendapan
amonium sulfat dan dialisis.
Pembuatan Kurva Standar oNP dan Penentuan Aktivitas β-Galaktosidase
(Lu et al. modifikasi 2009)
Pembuatan kurva standar oNP dilakukan dengan cara: oNP dilarutkan
dengan bufer fosfat 0.01 M pH 7.0 hingga didapatkan konsentrasi akhir 0.00-2.50
mM. Selanjutnya, ke dalam masing-masing larutan oNP berbagai konsentrasi
dimasukkan sebanyak 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 100 µL bufer fosfat
0.05 M pH 6.5. Campuran reaksi ini kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama
5 menit. Reaksi lalu dihentikan dengan 1 mL Na2CO3 1 M. Analisis dilakukan
menggunakan spektrofotometer UV Vis pada 420 nm. Hasil pembacaan aktivitas
β-galaktosidase yang dihasilkan selanjutnya diplotkan pada kurva standar. Satu
unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai sejumlah β-galaktosidase yang
mengkatalisis konversi dari 1 mol oNPG per unit dalam kondisi percobaan.
Penentuan aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara: sebanyak 100
L β-galaktosidase dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0. Setelah
itu, sebanyak 200 L oNPG 2 mg/mL ditambahkan ke dalam campuran reaksi
untuk kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit. Reaksi dihentikan
dengan 1 mL Na2CO3 1 M. Selanjutnya, analisis dilakukan menggunakan
spektrofotometer UV Vis pada 420 nm
Pembuatan Kurva Standar dan Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara: sebanyak 40 L protein
standar BSA berbagai konsentrasi (0.00-1.00 mg/mL) dimasukkan ke dalam 2 mL
pereaksi Bradford. Setelah 5 menit larutan dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV Vis pada 5λ5 nm.
Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara: sebanyak 20 L βgalaktosidase dimasukkan ke dalam 1 mL pereaksi Bradford. Setelah 5 menit,
larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada 5λ5 nm.
Pengendapan Protein dengan Amonium Sulfat (Scopes 1993)
Amonium sulfat dimasukkan ke dalam 10 mL β-galaktosidase kasar hingga
dicapai konsentrasi akhir 10%. Selama penambahan amonium sulfat, larutan βgalaktosidase kasar diaduk menggunakan pengaduk magnetik berkecepatan 60
rpm dengan suhu 4 oC. Pengadukan β-galaktosidase kasar dilanjutkan selama 20
menit untuk kemudian disimpan di dalam ruang pendingin selama 1 jam. Untuk
mendapatkan protein hasil pengendapan, dilakukan pemisahan dengan
sentrifugasi berkecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang
dihasilkan kemudian dipisahkan dari peletnya untuk digunakan pada pengendapan
bertingkat selanjutnya (pengendapan 20; 30; 40; 50; 60; dan 70%). Pelet yang
telah terpisah dari supernatan dicuci dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.05 M pH 6.5
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh diuji aktivitas β-galaktosidase dan kadar proteinnya.
3
4
Jumlah amonium sulfat (g/L) =
533(S2 - S1)
100 - (0.3 × S2)
Keterangan: S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat
S2 merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat
533 merupakan jumlah gram amonium sulfat yang dibutuhkan per
liter larutan untuk membuat larutan jenuh 100%
Dialisis
β-Galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat didialisis menggunakan
membran dialisis selofan MWCO 6-8 kDa. β-Galaktosidase yang telah
dimasukkan ke dalam membran dialisis, direndam di dalam 2 L bufer fosfat 0.01
M pH 6.5 dengan terus diaduk menggunakan pengaduk magnetik berkecepatan
100 rpm dengan suhu 4 oC. β-Galaktosidase hasil dialisis yang diperoleh
kemudian diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
Karakterisasi β-Galaktosidase
Uji Aktivitas β-Galaktosidase pada Berbagai pH. Uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan dengan cara: sebanyak 100 L β-galaktosidase
dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M variasi pH 4.5-8.5 (selang pH 0.5).
Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al.
modifikasi (2009).
Uji Aktivitas β-Galaktosidase pada Berbagai Suhu. Uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan dengan caraμ sebanyak 100 L β-galaktosidase
dimasukkan ke dalam 1 mL bufer 0.1 M pH 7.0 (pH optimum), kemudian
diinkubasi selama 5 menit pada variasi suhu 25-50 oC (selang suhu 5 oC).
Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al.
modifikasi (2009).
Uji Pengaruh Logam. Logam yang digunakan adalah CaCl2, CoCl2, CuCl2,
HgCl2, MnCl2, MgSO4, dan ZnSO4. Pengujian pengaruh logam dilakukan dengan
cara: sebanyak 100 L logam 0.01 M dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1
M pH 7.0 dan 100 L β-galaktosidase kasar. Selanjutnya, uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al. modifikasi (2009).
Uji Pengaruh Konsentrasi Substrat. Sebanyak 100 L β-galaktosidase
hasil dialisis dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0. Kemudian, ke
dalam campuran reaksi ini dimasukkan sebanyak 200 L oNPG berbagai
konsentrasi (0.01-5.00 mg/mL). Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase
dilakukan seperti metode Lu et al. modifikasi (2009).
HASIL
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Konsentrasi garam amonium sulfat 10-40% belum mampu mengendapkan
β-galaktosidase L. plantarum B 123 secara keseluruhan, dilihat dari aktivitas βgalaktosidase yang masih relatif rendah. Namun, setelah konsentrasi garam
amonium sulfat mencapai 50%, sebagian besar β-galaktosidase dapat terendapkan.
Aktivitas dan aktivitas spesifik β-galaktosidase pada konsentrasi garam amonium
sulfat 50% adalah sebesar 95.675 U dan 32.268 U/mg protein (Gambar 1).
35
120
30
100
25
80
20
60
15
40
10
5
20
0
0
10
Gambar 1
Aktivitas (U)
Aktivitas spesifik
(U/mg protein)
5
20
30
40
50
60
70
Amonium sulfat (%)
Aktivitas spesifik
Aktivitas
Pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan variasi
konsentrasi amonium sulfat
β-Galaktosidase kasar memiliki aktivitas unit dan aktivitas spesifik sebesar
2470.51 U dan 8.08 U/mg protein. Setelah β-galaktosidase kasar diendapkan
dengan amonium sulfat 50%, kemurnian β-galaktosidase meningkat 3.99 kali lipat,
dengan rendemen 38.73%, dan aktivitas spesifik sebesar 32.27 U/mg. βGalaktosidase kemudian dimurnikan lebih lanjut menggunakan membran dialisis
selofan. Kemurnian β-galaktosidase meningkat 7.61 kali lipat, dengan rendemen
10.67%, dan aktivitas spesifik sebesar 61.53 U/mg (Tabel 1).
Tabel 1 Tahapan pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123
Tahapan
β-Galaktosidase
kasar
Pengendapan
amonium
sulfat 50%
Dialisis
Aktivitas
(U)
Total
protein
(mg)
Aktivitas
spesifik
(U/mg)
2470.51
305.68
8.08
100.00
1.00
956.75
29.65
32.27
38.73
3.99
262.84
4.27
61.53
10.67
7.61
Rendemen Kemurnian
(%)
(kali)
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengaruh pH terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 diuji pada rentang pH 4.5-8.5
dengan suhu 37 °C selama 5 menit. Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis
optimum pada pH 7.0. Setelah pH optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase
hasil dialisis dipertahankan sebesar 84% dan 70% pada pH 7.5 dan 8.0. Aktivitas
kemudian menurun tajam hingga aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis
dipertahankan sebesar 18% pada pH 8.5 (Gambar 2).
5
6
Aktivitas (U/mL)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
4.5
Gambar 2
5.0
5.5
6.0
6.5
pH
7.0
7.5
8.0
8.5
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Aktivitas β-galaktosidase diuji pada rentang suhu 25-60 °C dengan pH 7.0
selama 5 menit. Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis optimum pada suhu 50 °C.
Setelah suhu optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis mampu
dipertahankan sebesar 96% pada suhu 55 °C. Aktivitas kemudian menurun pada
suhu 60 °C dengan aktivitas β-galaktosidase dipertahankan sebesar 54% (Gambar
3).
Aktivitas (U/mL)
60
50
40
30
20
10
0
25
Gambar 3
30
35
40
45
50
55
60
Suhu (°C)
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Ion-ion logam Mg2+, Mn2+, Zn2+, dan Co2+ 10 mM mampu meningkatkan
aktivitas β-galaktosidase kasar masing-masing sebesar 25%, 31%, 19%, dan 12%,
namun ion-ion logam Cu2+, Hg2+, dan Ca2+ 10 mM menghambat aktivitas βgalaktosidase kasar masing-masing sebesar 94%, 96% dan 15% (Gambar 4).
7
35
31.26
32.63
29.69
Aktivitas (U/mL)
30
25
27.98
24.71
21.56
20
15
10
5
1.38
0.89
0
Kontrol Cu2+
Kontrol
Gambar 4
Hg2+
Mg
Mg2+ Mn2+
Ion logam
Zn
Zn2+
Co
Co2+
Ca
Ca2+
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L.
plantarum B 123
Kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) dan konstanta kinetik (KM) ditentukan
berdasarkan kurva Lineweaver-Burk yang menghasilkan garis lurus. Kurva
Lineawever-Burk dihasilkan dari plot invers sederet konsentrasi substrat oNPG
(1/[S]) dengan invers kecepatan reaksi β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis (1/V) yang menghasilkan persamaan linier y = 0.1553x + 0.138 (Gambar
5). Berdasarkan persamaan ini diperoleh nilai 1/Vmaks sebesar 0.138 dan nilai
KM/Vmaks sebesar 0.1553, sehingga didapatkan nilai Vmaks sebesar 7.25 U/mL dan
KM sebesar 1.13 mM.
4.0
3.5
y = 0.1553x + 0.138
R² = 0.9765
3.0
1/V
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
1/[S]
Gambar 5 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis
7
8
PEMBAHASAN
Kondisi Optimum Pertumbuhan Lactobacillus plantarum B 123
Media yang digunakan untuk pertumbuhan L. plantarum B 123 adalah
media MRS yang merupakan media selektif untuk pertumbuhan bakteri asam
laktat. Menurut Mariyani (2013), kondisi optimum pertumbuhan L. plantarum B
123 untuk menghasilkan β-galaktosidase dengan aktivitas tertinggi adalah pada
jumlah inokulum 2%, kandungan laktosa 1%, pH media 8, waktu inkubasi 24 jam,
dan suhu inkubasi 37 °C.
Produksi enzim oleh mikroba dapat ditingkatkan dengan menambahkan
suatu zat kimia yang dapat bertindak sebagai induser atau dengan mengubah
komposisi substrat (Muchtadi et al. 1992). Zat kimia yang dapat bertindak sebagai
induser adalah substrat atau senyawa yang sekerabat dengan substrat dari reaksi
yang dikatalis oleh enzim yang bersangkutan (Pelczar dan Chan 1986). Laktosa
merupakan sumber karbon dan induser untuk menghasilkan β-galaktosidase.
Seperti dilaporkan Kim dan Rajagopal (2000) dan Isobe et al. (2013),
Lactobacillus crispatus dan Teratosphaeria acidotherma memiliki aktivitas yang
lebih tinggi pada saat ditumbuhkan di media yang mengandung sumber karbon
laktosa dibandingkan pada saat ditumbuhkan di media yang mengandung sumber
karbon lain seperti glukosa dan maltosa. Sumber karbon laktosa juga digunakan
sebagai media pertumbuhan Lactobacillus brevis (Honda dan Yajima 2012),
Bacillus sp. MTCC 3088 (Chakraborti et al. 2000), Aspergillus alliaceus (Sen et
al. 2012), dan Arthrobacter sp. (Bialkowska et al. 2009). Penggunaan substrat
kromogenik oNPG pada pengujian aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123
juga didasarkan pada penelitian sebelumnya. Chakraborti et al. (2000)
menyatakan, hidrolisis oNPG pada Bacillus sp. MTCC 3088 menghasilkan
aktivitas β-galaktosidase yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan hidrolisis
substrat kromogenik lainnya.
Produksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Jumlah volume bufer yang digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase
adalah minimal dua kali bahan awal karena semakin banyak volume bufer yang
ditambahkan, semakin banyak pula protein enzim yang terekstrak. Namun,
dengan semakin banyaknya volume bufer yang digunakan, ekstrak enzim kasar
yang diperoleh akan menjadi lebih encer (Scopes 1987). Oleh karena itu,
perbandingan volume yang digunakan pada penelitian ini adalah 1:2.5, sehingga
larutan ekstrak yang didapatkan tidak terlalu encer dan enzim yang terisolasi lebih
stabil dan mudah diisolasi.
Bufer yang digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase adalah bufer
fosfat 0.05 M pH 6.5. Bufer fosfat dipilih karena memiliki kisaran pH 5.6-8.8
yang secara umum mendekati pH fisiologis. Mariyani (2013) menyatakan,
aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 optimum pada pH 6.5, sehingga
bufer fosfat pH 6.5 digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase L. plantarum
B 123. Penggunaan bufer dengan konsentrasi rendah pun dipilih untuk
menghasilkan larutan yang memiliki tekanan osmotik rendah dan mencegah
terjadinya penurunan aktivitas katalitik (Deutscher 1990). Menurut Dennison
9
(2002), penggunaan tekanan osmotik rendah dapat membantu peristiwa lisisnya
sel dan organel, sehingga jumlah enzim yang terekstrak mampu ditingkatkan.
Selain itu, suhu 4 °C juga dipertahankan pada saat ektraksi guna mempertahankan
struktur dan fungsi dari protein.
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengendapan β-galaktosidase berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi
protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein target
dari sebagian kontaminan yang tidak dikehendaki (Scopes 1987). Penggunaan
garam amonium sulfat juga dipilih karena memiliki beberapa keuntungan seperti
mudah larut, tidak toksik, dan stabil terhadap enzim (Darwis dan Sukara 1990).
Penambahan amonium sulfat dilakukan secara perlahan agar enzim dapat
mengendap dengan baik dan terus diaduk menggunakan pengaduk magnetik untuk
menghindari penumpukan kadar elektrolit pada satu tempat dan untuk
meningkatkan kontak pengendapan dengan enzim. Munculnya buih dihindari pada
saat pengendapan amonium sulfat karena buih yang terbentuk mengindikasikan
adanya kerusakan pada protein.
Tingkat kejenuhan amonium sulfat berbeda-beda, hal ini berhubungan
dengan jumlah asam amino hidrofilik dan hidrofobik yang terdapat pada
permukaan protein enzim. Protein enzim yang memiliki lebih banyak asam amino
hidrofilik akan membutuhkan konsentrasi garam yang lebih banyak untuk
mengendapkan protein enzim. Hal ini terjadi karena permukaan protein yang
hidrofilik akan berinteraksi kuat dengan air, sehingga diperlukan ion-ion dari
garam dalam jumlah banyak untuk mengganggu interaksi tersebut. Sebaliknya,
jika protein enzim mengandung lebih banyak asam amino hidrofobik, jumlah
amonium sulfat yang diperlukan untuk mengendapkan protein enzim pun akan
lebih sedikit (Scopes 1987).
Fraksinasi bertingkat β-galaktosidase L. plantarum B 123 menunjukan,
konsentrasi garam amonium sulfat 10-40% belum mampu mengendapkan βgalaktosidase secara keseluruhan (Gambar 1). Hal ini disebabkan karena protein
masih mengalami salting in. Saat salting in, ion garam yang dihasilkan akan
melindungi dan mencegah bersatunya molekul protein, sehingga protein masih
banyak yang melarut dibandingkan dengan β-galaktosidase yang banyak terbuang
pada saat pemisahan. Namun, setelah konsentrasi garam amonium sulfat mencapai
50%, sebagian besar β-galaktosidase L. plantarum B 123 dapat terendapkan. Hal
ini terjadi karena protein mengalami salting out. Saat salting out, ion garam yang
dihasilkan akan meningkatkan muatan listrik di sekitar protein, sehingga mantel
air protein akan tertarik. Hal inilah yang menyebabkan interaksi hidrofobik dan
kelarutan protein menurun (Suhartono et al. 1992). Lebih lanjut Scopes (1987)
menyatakan, jika konsentrasi amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan
melebihi nilai optimum yang dibutuhkan untuk mengendapkan molekul protein,
kelebihan ion-ion garam ini akan menarik molekul-molekul protein, sehingga
molekul-molekul protein menjadi terlarut kembali. Hal ini yang menyebabkan
jumlah protein terendapkan menjadi lebih sedikit.
Tujuan dari fraksinasi bertingkat ini adalah mendapatkan larutan dengan
tingkat kejenuhan yang berbeda dan diharapkan dapat diperoleh beberapa fraksi
yang memiliki aktivitas optimum. β-Galaktosidase L. plantarum B 123 memiliki
9
10
aktivitas optimum pada fraksi amonium sulfat 50% seperti β-galaktosidase
Lactobacillus bulgaricus (Hartono 2013). Aktivitas β-galaktosidase yang
optimum pada fraksi amonium sulfat 50% menunjukan bahwa, β-galaktosidase L.
plantarum B 123 memiliki sifat hidrofobik karena hanya diperlukan amonium
sulfat dalam jumlah relatif sedikit untuk mengendapkan β-galaktosidase.
Pernyataan ini diperkuat dengan hasil penelitian Chen et al. (2008) yang
menyatakan, β-galaktosidase Bacillus stearothermophilus mengandung lebih
banyak asam amino leusin, isoleusin, valin, prolin, dan alanin yang merupakan
asam amino yang bersifat non polar atau hidrofobik.
Setelah pengendapan β-galaktosidase dengan amonium sulfat, dilakukan
pemurnian dengan dialisis terhadap fraksi amonium sulfat yang memiliki aktivitas
optimum. Tujuan utama dialisis adalah menghilangkan molekul garam amonium
sulfat dan ion-ion penganggu lainnya yang dapat berpengaruh terhadap kestabilan
molekul enzim. Membran dialisis selofan yang digunakan memiliki ukuran 6-8
kDa, sehingga molekul yang berukuran kurang dari 6-8 kDa akan keluar dari
membran semipermeabel. Saat dialisis, terjadi proses difusi dan osmosis yang
ditandai dengan masuknya larutan bufer ke dalam kantong dialisis menggantikan
molekul garam yang keluar (Scopes 1993). Tahapan dialisis ini menyebabkan
aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 menurun (Tabel 1). Menurut Plumer
(1979), penurunan aktivitas setelah pemurnian dengan dialisis mungkin
disebabkan karena ion-ion penting yang berfungsi untuk menstabilkan dan
mengaktivasi enzim hilang selama proses dialisis, karena selain membran dialisis
bersifat semipermeabel terhadap ion-ion garam, membran dialisis juga bersifat
semipermeabel terhadap ion-ion lainnya.
Kemurnian β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis meningkat
7.61 kali lipat dibandingkan dengan β-galaktosidase kasar (Tabel 1). Tingkat
kemurnian ini lebih tinggi dibandingkan dengan β-galaktosidase Lactobacillus
bulgaricus (3.13 kali lipat) dan Lactobacillus plantarum (7.28 kali lipat) (Hartono
2013; Mariyani 2013). Aktivitas spesifik β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis (61.53 U/mg protein) juga lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas
spesifik β-galaktosidase Lactobacillus bulgaricus (45.828 U/mg protein) (Hartono
2013). Pemurnian β-galaktosidase lebih lanjut seperti pemurnian menggunakan
metode kromatografi akan meningkatkan aktivitas β-galaktosidase seperti
ditunjukkan oleh β-galaktosidase Bifidobacterium longum (168.6 unit/mg protein),
Pseudoalteromonas sp. (251 unit/mg protein), Phaseolus vulgaris (281 unit/mg
protein), Bifidobacterium infantis (568.7 unit/mg protein), dan Thermotoga
naphtopila (1204.1 unit/mg protein), Bacillus stearothermophilus (125.2 unit/mg
protein) (Hsu et al. 2006; Fernandes et al. 2002; Biswas et al. 2003; Hung dan
Lee 2002; Honda dan Yajima 2012; Chen et al. 2008).
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengaruh pH terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Setiap enzim memiliki kisaran pH optimum, yaitu kisaran pH pada saat
enzim menunjukan aktivitas maksimum dengan stabilitas tinggi (Suhartono 1989).
Saat kadar pH terlalu rendah, kelebihan ion H+ akan berikatan dengan sisi aktif
enzim atau sisi lain enzim yang bermuatan positif, sehingga akan terjadi tolakan
muatan yang mengakibatkan struktur enzim terbuka. Terbukanya struktur enzim
11
mengakibatkan perubahan konformasi pada sisi aktif enzim. Bila sisi aktif enzim
tidak sama dengan substrat, maka reaksi tidak akan terjadi. Sama halnya pada saat
kadar pH terlalu tinggi, adanya ion OH- akan bereaksi dengan gugus karboksil
pada sisi aktif enzim, sehingga mengakibatkan aktivitas enzim menurun (Palmer
1991). Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 optimum pada pH 7.0
(Gambar 2). Seperti β-galaktosidase Bifidobacterium longum (Hsu et al. 2006)
dan Bacillus stearothermophilus (Chen et al. 2008) yang juga optimum pada pH
7.0. Meningkatnya aktivitas enzim pada pH optimum dapat dikaitkan dengan
perubahan ionisasi pada sisi aktif enzim, sehingga konformasi sisi aktif menjadi
lebih efektif dalam mengikat dan mengubah substrat menjadi produk.
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Setiap enzim memiliki kisaran suhu tertentu untuk mencapai aktivitas
optimum. Sebelum suhu optimum tercapai, aktivitas β-galaktosidase akan terus
meningkat karena adanya peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak
vibrasi, translasi, serta rotasi antara enzim dan substrat, sehingga peluang
keduanya untuk saling bertumbukan menjadi lebih besar (Hames dan Hoper 2000).
Namun setelah suhu optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase akan terus
menurun. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi, sehingga
konformasi molekul protein menjadi berubah dan enzim kehilangan sifat
alamiahnya. Menurut Lehninger (1994), jika suatu protein terdenaturasi, struktur
tiga dimensi yang bersifat khusus dari rantai polipeptida juga akan terganggu.
Rantai polipeptida yang terganggu inilah yang menyebabkan struktur protein
menjadi terbuka dan acak. Terbukanya struktur protein tidak menjadikan struktur
kerangka kovalen rusak namun menyebabkan aktivitas biologis enzim menjadi
tidak berfungsi.
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis optimum pada
suhu 50 oC (Gambar 3). Seperti β-galaktosidase Lactobacillus kerfiranofaciens K1, Lactobacillus bugaricus, Lactobacillus lactis, dan Bullera singularis (Hsu et al.
2006; Kim dan Rajagopal 2000) juga optimum pada suhu 50 oC. Aktivitas yang
optimum pada suhu 50 oC ini menunjukan bahwa, β-galaktosidase L. plantarum B
123 bekerja aktif pada suhu tinggi atau bersifat termofilik. Menurut Sadeghi et al.
(2006), protein yang bersifat termofilik memiliki karakteristik yang berbeda pada
strukturnya dibandingkan dengan protein mesofilik. Protein termofilik memiliki
lebih banyak struktur jembatan garam dan ikatan hidrogen yang berlimpah
dibandingkan dengan protein mesofilik. Selain itu, protein termofilik memiliki
lebih banyak residu asam amino yang bersifat hidrofobik, sehingga menyebabkan
titik didih protein termofilik menjadi lebih tinggi.
Pengaruh Logam terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Enzim memerlukan kofaktor untuk mengaktivasi aktivitasnya dalam
menghidrolisis substrat. Kofaktor berinteraksi dengan residu asam amino pada sisi
aktif enzim, sehingga terjadi perubahan afinitas enzim terhadap substrat berupa
peningkatan atau penurunan aktivitas enzim (Lehninger 1994). Kofaktor
merupakan senyawa anorganik, seperti ion logam. Menurut Murray et al. (2003),
ion logam memiliki fungsi beragam dalam reaksi katalisis. Ion logam dapat
bertindak sebagai elektrofil dan nukleofil dengan cara menerima atau
menyumbangkan elektronnya.
11
12
Ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ berperan sebagai aktivator sedangkan
ion logam Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ berperan sebagai inhibitor bagi β-galaktosidase L.
plantarum B 123 kasar (Gambar 4). Seperti β-galaktosidase L. plantarum B 123,
β-galaktosidase L. bulgaricus (Hartono 2013), Bacillus liceniformis (Hsu et al.
2006), dan Pseudoalteromonas sp. (Fernandes et al. 2002) juga diaktifkan oleh
ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ serta dihambat oleh ion logam Ca2+, Cu2+,
dan Hg2+.
Matthews (2005) mengungkapkan, ion logam Mg2+ berperan sebagai
penstabil reaksi katalisis antara enzim dan substrat karena ion logam Mg2+
berikatan dengan nukleofil Glu 537, sehingga sisi aktif menjadi lebih stabil dan
reaksi antara enzim dan substrat menjadi lebih mudah terjadi. Palmer (1991) juga
menyatakan, ion logam berfungsi dalam peningkatan aktivitas enzim karena ion
logam dapat berperan dalam pengikatan antara enzim dan substrat untuk
menstabilkan konformasi sisi aktif enzim.
Penambahan ion logam berat seperti Hg2+ dan Cu2+ menurunkan sebagian
besar aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar. Ion logam Hg2+
merupakan inhibitor ireversibel yang akan bereaksi membentuk ikatan kovalen
pada gugus fungsi, sehingga laju reaksi terhambat secara tetap. Lain halnya
dengan ion logam Cu2+, yang merupakan inhibitor reversibel non-kompetitif.
Ikatan yang terbentuk antara ion logam Cu2+ dan ezim tidak secara kovalen dan
ikatan yang terbentuk bukan pada sisi aktifnya, sehingga enzim dapat mengikat
substrat dan inhibitor secara bersamaan (Bintang 2010).
Penambahan 10 mM ion logam Ca2+ juga menurunkan aktivitas βgalaktosidase L. plantarum B 123 kasar. Namun, penambahan ion logam Ca2+
sampai pada batas tertentu mampu mengaktivasi aktivitas β-galaktosidase.
Penambahan 1 mM ion logam Ca2+ mampu meningkatkan aktivitas βgalaktosidase Pseudoalteromonas sp. namun penambahan 10 mM ion logam Ca2+
akan menghambat aktivitas β-galaktosidase. Seperti halnya pada β-galaktosidase
Bacillus liceniformis, penambahan 1; 2.5; dan 5 mM ion logam Ca2+ mampu
meningkatkan aktivitas β-galaktosidase, namun penambahan 10; 20; dan 25 mM
ion logam Ca2+ akan menghambat aktivitas β-galaktosidase (Chakraborti et al.
2000; Hung dan Lee 2002). Peristiwa ini didukung oleh pernyataan Palmer (1991)
yang menyatakan, beberapa enzim memerlukan ion-ion logam tertentu untuk
meningkatkan aktivitasnya. Namun, pada konsentrasi tertentu ion logam dapat
bertindak sebagai inhibitor.
Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L.
plantarum B 123
Penentuan KM dan Vmaks didasarkan pada hubungan antara konsentrasi
substrat [S] dan aktivitas enzim. Aktivitas enzim sebanding dengan kecepatan
reaksi enzim [V], yang didefinisikan sebagai kecepatan β-galaktosidase L.
plantarum B 123 dalam menghidrolisis oNPG menjadi oNP per menit. Hubungan
antara [S] dan [V] dapat dilihat pada Lampiran 13. Kecepatan enzimatis βgalaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis terus meningkat dengan
meningkatnya konsentrasi substrat, namun menjadi konstan ketika substrat terus
menerus ditingkatkan. Keadaan saat kecepatan tidak dapat meningkat lagi dengan
bertambahnya konsentrasi substrat disebut kecepatan maksimum (Vmaks). Setelah
nilai Vmaks diketahui, nilai KM dapat ditentukan. Nilai KM didefinisikan sebagai
13
suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila
kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari kecepatan maksimum
(Wiseman 1989).
Penentuan nilai KM dan Vmaks secara lebih tepat dapat ditentukan
berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk (Gambar 5). Berdasarkan persamaan ini,
diperoleh nilai Vmaks sebesar 7.25 U/mL dan KM sebesar 1.13 mM. Nilai Vmaks
sebesar 7.25 U/mL didefinisikan sebagai suatu kondisi optimum β-galaktosidase L.
plantarum B 123 untuk mengubah substrat oNPG menjadi oNP sebesar 7.25
U/mL setiap menit. Semakin tinggi Vmaks suatu enzim, semakin tinggi pula
kecepatan yang bisa dicapai oleh enzim tersebut.
β-Galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis (1.13 mM) memiliki
nilai KM yang lebih kecil dibandingkan dengan nilai KM β-galaktosidase
Thermotoga naphtophila (1.31 mM), Aspergillus niger van Tiegh (1.74 mM),
Bifidobacterium infantis (2.6 mM), Bacillus stearothermophilus (2.96 mM), L.
plantarum B 134 (3.93 mM), Bacillus liceniformis (13.7 mM), dan Bacillus sp.
MTCC 3088 (6.34 mM) (Fansi et al. 2014; Connell dan Walsh 2010; Hung dan
Lee 2002; Chen et al. 2008; Hartono 2013; Juajun et al. 2011; Chakraborti et al.
2000). Winarno (1999) menyatakan, semakin rendah nilai KM, semakin kuat
ikatan yang terbentuk antara enzim dan substrat. Selain itu, nilai KM yang rendah
juga menyebabkan energi yang diperlukan untuk memulai terjadinya reaksi
enzimatik lebih sedikit, sehingga reaksi menjadi lebih mudah terjadi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan pengendapan
amonium sulfat 50% dan dialisis mampu meningkatkan kemurnian βgalaktosidase sebesar 7.61 kali lipat, dengan rendemen 10.67%, dan aktivitas
spesifik 61.53 U/mg protein.
Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis optimum pada pH 7.0 dan suhu
50 °C. Ion-ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ mampu meningkatkan aktivitas
β-galaktosidase kasar sedangkan ion-ion logam Cu2+, Hg2+, dan Ca2+ menghambat
aktivitas β-galaktosidase kasar pada konsentrasi 10 mM. Nilai KM dan Vmaks βgalaktosidase hasil dialisis sebesar 1.13 mM dan 7.25 U/mL.
Berdasarkan pemurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase, L.
plantarum B 123 merupakan bakteri asam laktat yang baik sebagai penghasil βgalaktosidase.
Saran
Saran untuk penelitian selanjutnya adalah penentuan stabilitas βgalaktosidase L. plantarum B 123 berdasarkan kemampuan β-galaktosidase untuk
mempertahankan aktivitasnya pada kondisi pH dan suhu optimum dalam berbagai
variasi waktu. Penentuan nilai KM dan Vmaks β-galaktosidase L. plantarum B 123
juga disarankan dapat dilakukan pengujian ulang kembali guna mendapatkan nilai
KM dan Vmaks yang lebih akurat dengan menggunakan minimal 6 titik sebelum
keadaan V maks tercapai.
13
14
DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2008. Kenali Intoleransi Lebih
Lanjut. InfoPOM. 9(1):1-3.
Bialkowska AM, Cieslinski H, Nowakowska KM, Kur J, Turkiewicz M. 2009. A
new β-galactosidase with a low temperature optimum isolated from the
Antarctic Arthrobacter sp. 20B: gene cloning, purification and
characterization. Arch Microbiol. 191:825-835.doi:10.1007/s00203-0090509-4.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik penelitian. Jakarta (ID): EGC.
Biswas S, Kayastha AM, Seckler R. 2003. Purification and characterization of a
thermostable β-galactosidase from kidney beans (Phaseolus vulgaris L.) cv.
PDR14. J Plant Physiol. 160:327-337.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72:248-254.
Chakraborti S, Sani RK, Banerjee UC, Sobti RC. 2000. Purification and
characterization of a novel β-galactosidase from Bacillus sp. MTCC 3088. J
Indust Microbiol Biotechnol. 24:58-63.
Cheetham PSJ. 1985. The applications of enzyme in industry. Di dalam: Wiseman
A, editor. Handbook of Enzyme Biotechnology. Ed ke-2. New York (US): J
Wiley. hlm 274-293.
Chen W, Chen H, Xia Y, Zhao J, Tian F, Zhang H. 2008. Production, purification,
and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk
lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J Dairy Sci. 91:17511758.doi:10.3168/jds.2007-617.
Chen W, Chen H, Xia Y, Yang J, Zhao J. 2009. Immobilization of recombinant
thermostable [beta]-galactosidase from Bacillus stearothermophilus for
lactose hydrolysis in milk. J Dairy Science. 92(2):491-498.
Connell S, Walsh G. 2010. A novel acid-stable, acid-active β-galactosidase
potentially suited to the alleviation of lactose intolerance. Appl Microbiol
Biotechnol. 86:517-524.doi:10.1007/s00253-009-2270-7.
Darwis AA, Sukara E. 1990. Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Enzim. Bogor
(ID): IPB Pr.
Dennison C. 2002. A Guide to Protein Isolation. New York (US): Kluwer
Academic.
Deutscher MP. 1990. Methods in Enzimology: Guide to Protein Purification.
Volume ke-1. California (US): Academic Pr.
Fansi K, Yeqing W, Shungui C, Renjun G, Guiqiu X. 2014. Cloning, purification
and characterization of a thermostable β-galactosidase from Thermotoga
naphthophila RUK-10. Process Biochem. 49:775-782.
15
Fernandes S, Geueke B, Delgado O, Coleman J, Hatti-Kaul R. 2002. βGalactosidase from a cold-adapted bacterium: purification, characterization
and application for lactose hydrolysis. Appl Microbiol Biotechnol. 58:313321.doi:10.1007/s00253-001-0905-4.
Hames BD, Hoper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. Ed ke-2.
Hongkong (HK): Springer-Verlag.
Hartono LK. 2013. Pemurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat
bakteri asam laktat (BAL) strain B134 [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Honda H, Yajima N. 2012. Characterization of lactose utilization and βgalactosidase in Lactobacillus brevis KB290, the hetero-fermentative lactic
acid bacterium. Curr Microbiol. 65:679-685.doi:10.1007/s00284-012-02162.
Hsu CA, Yu RC, Chou CC. 2006. Purification and characterization of a sodiumstimulated β-galactosidase from Bifidobacterium longum CCRC 15708. J
Microbiol Biotechnol. 22:355-361.doi:10.1007/s11274-005-9041-0.
Hung MN, Lee BH. 2002. Purification and characterization of a recombinant βgalactosidase with transgalactosylation activity from Bifidobacterium
infantis HL96. Appl Microbiol Biotechnol. 58:439-445.doi:10.1007/s00253001-0911-6.
Isobe K, Yamashita M, Chiba S, Takahashi N, Koyama T. 2013. Characterization
of new β-galactosidase from acidophilic fungus Teratosphaeria acidotherma
AIU BGA-1. J Biosci Bioengin. 116(3):293-297.
Juajun O, Nguyen TH, Maischberger T, Iqbal S, Haltrich D, Yamabhai M. 2011.
Cloning, purification, and characterization of β-galactosidase from Bacillus
licheniformis DSM 13. Appl Microbiol Biotechnol. 89:645654.doi:10.1007/s00253-010-2862-2.
Kim JW, Rajagopal SN. 2000. Isolation and characterization of β-galactosidase
from Lactobacillus crispatus. Folia Microbiol. 45(1):29-34.
Lehninger AL. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Thenawidjaja M, penerjemah.
Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Lu LL, Xiao M, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating βgalactosidase from Enterobacter cloacae B5. Process Biochem. 44: 232-236.
Mariyani N. 2013. Potensi enzim β-galaktosidase dari Lactobacillus plantarum
strain B123 indigenous untuk hidrolisis laktosa pada susu UHT [tesis].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Matthews BW. 2005. The structure of Escherichia coli β-galactosidase. CR
Biologies. 328:529-556.
Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Bogor
(ID): PAU-IPB.
15
16
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper.
Hartono A, penerjemah; Bani AP dan Sikumbang TMN, editor. Jakarta (ID):
EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry. Ed ke-25.
Palmer T. 1991. Understanding Enzymes. Inggris (GB): Ellis Horwood.
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume ke-1.
Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta
(ID): UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Plumer DT. 1979. An Introduction to Practical Biochemistry. Ed ke-2. New Delhi
(IN): McGraw-Hill.
Sadeghi M, Manesh HN, Zarrabi M, Ranjbar B. 2006. Effective factors in
thermostability of thermophilic proteins. Biophysic Chem. 119(3):256-270.
doi:10.1016/j.bpc.2005.09.018.
Sani RK, Chakraborti S, Sobti RC, Patnaik PR, Banerjee UC. 1999.
Characterization and some reaction-engineering aspects of thermostable
extracellular β-galactosidase from a new Bacillus species. Folia Microbiol.
44(4):367-371.
Scopes RK. 1987. Protein Purification: Principles and Practice. Ed ke-2. New
York (US): Springger-Verlag.
Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York (US): RR Doneley and Sons.
Sen S, Ray L, Chattopadhyay. 2012. Production, purification, immobilization, and
characterization of a thermostable β-galactosidase from Aspergillus
alliaceus. Appl Biochem Biotechnol. 167:1938-1953.doi:10.1007/s12010012-9732-6.
Suhartono MT, Suswanto A, Widjaja H. 1992. Struktur dan Biokimiawi Protein.
Bogor (ID): PAU-IPB.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor (ID): PAU-IPB.
Wang D, Sakakibara M. 1λλ7. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in
sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem.
4:255-261.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Jakarta (ID): Gramedia.
Wiseman A. 1989. Handbook of Enzymes Biotechnology. Ed ke-2. New York
(US): Ellis Howard.
17
LAMPIRAN
17
18
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Peremajaan L. plantarum B
123
2% Inokulum, 1% Laktosa, pH media 8,
Waktu Inkubasi 24 Jam, Suhu 37 °C
Ekstraksi
Karakterisasi
Pengaruh
Logam
Pengendapan amonium sulfat
Dialisis
Karakterisasi
Aktivitas pH & Suhu, Parameter Kinetik
19
Kurva standar oNP dalam analisis aktivitas β-galaktosidase dengan
metode Lu et al. modifikasi (2009)
[oNP]
[oNP]
[oNP]
[oNP] Absorbansi
(M)
(g)
(mol)
(µmol)
(420 nm)
0.00000
0.0000000000
0.000000000
0.000
0.000
0.00005
1.599765E-05
β-GALAKTOSIDASE Lactobacillus plantarum B 123
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemurnian Parsial dan
Karakterisasi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123 adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Tema dan dana penelitian ini
merupakan bagian dari Proyek DIPA TEMATIK Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Bellen Nastitie Pamela Fury
NIM G84100046
iii
ABSTRAK
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi βGalaktosidase Lactobacillus plantarum B 123. Dibimbing oleh SYAMSUL
FALAH dan TATIK KHUSNIATI.
Intoleransi laktosa merupakan masalah yang dihadapi oleh sebagian besar
populasi di dunia. Masalah ini dapat diatasi dengan menghidrolisis laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa dengan β-galaktosidase. β-Galaktosidase
ditemukan secara luas di alam dan diproduksi oleh sejumlah mikroorganisme.
Namun, karakteristik setiap β-galaktosidase sangat berbeda dan bervariasi
berdasarkan sumber mikroorganisme. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
pemurnian dan karakterisasi β-galaktosidase L. plantarum B 123. β-Galaktosidase
diekstraksi dan dimurnikan secara parsial dengan pengendapan amonium sulfat
dan dialisis. Tahapan ini menghasilkan pemurnian 7.61 kali lipat, rendemen
10.67%, dan aktivitas spesifik 61.53 U/mg protein. Suhu dan pH optimum βgalaktosidase hasil dialisis tercapai pada suhu 50 °C dan pH 7.0. Ion-ion logam
Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+ 10 mM meningkatkan aktivitas β-galaktosidase kasar,
sedangkan ion-ion logam Cu2+, Hg2+, Ca2+ 10 mM menghambat aktivitas βgalaktosidase kasar. Nilai KM dan Vmaks β-galaktosidase hasil dialisis masingmasing sebesar 1.13 mM dan 7.25 U/mL.
Kata kunci: β-galaktosidase, Lactobacillus plantarum B 123, dialisis, karakterisasi
ABSTRACT
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY. Partial Purification and Characterization
of β-Galactosidase Lactobacillus plantarum B 123. Supervised by SYAMSUL
FALAH and TATIK KHUSNIATI.
Lactose intolerance was a problem faced by a large proportion of the
world's population. These problem could be alleviated by hydrolyzing lactose to
glucose and galactose by β-galactosidase. β-Galactosidase occurred widely in
nature and it was produced by a number of microorganisms. However, their
characteristics were very different and it varied with the source of microorganism.
The aim of this study was purification and characterization of β-galactosidase L.
plantarum B 123. β-Galactosidase was extracted and partially purified by
ammonium sulfate precipitation and dialysis. These steps resulted a purification
level of 7.61 fold, a yield of 10.67%, and a specific activity of 61.53 U/mg protein.
Optimum temperature and pH for dialyzed β-galactosidase were optimized at
50 °C and 7.0, respectively. Metal ions of Mg2+, Mn2+, Co2+, and Zn2+ in 10 mM
stimulated the activity of crude β-galactosidase, while metal ions of Cu2+, Hg2+,
and Ca2+ in 10 mM inhibited the activity of crude β-galactosidase. KM and Vmax
for this dialyzed β-galactosidase were 1.13 mM and 7.25 U/mL, respectively.
Key words: β-galactosidase, Lactobacillus plantarum B 123, dialysis,
characterization
PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI
β-GALAKTOSIDASE Lactobacillus plantarum B 123
BELLEN NASTITIE PAMELA FURY
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
v
vii
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil alamin, puji syukur yang tak terhingga kepada Allah
SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis mampu
menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini dengan sebaik-baiknya. Shalawat
dan salam senantiasa terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, serta
para sahabatnya.
Ucapan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan
kepada Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dan Prof Dr Ir Tatik Khusniati, MAppSc
selaku pembimbing I dan II yang senantiasa meluangkan waktu dan kesempatan
untuk memberikan bimbingan, saran, pengetahuan, dan inspirasi kepada penulis
dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.
Terima kasih penulis ucapkan juga kepada staf Laboratorium Biokimia
Mikroba, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI khususnya kepada
Neneng Karimayati, AMdAL dan Lusiana Kresnawati Hartono, SSi, MSi atas
segala bantuan dan dukungan selama penulis melakukan penelitian disana.
Terima kasih juga atas persahabatan dan persaudaraan yang telah terjalin
selama ini, kepada rekan mahasiswa Biokimia 47 dan para penghuni Pondok Putri
Rahmah.
Tak lupa, ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada ibunda Rieta
Purwati dan ayahanda Ir Widodo yang selalu mengajarkan akan pentingnya
pendidikan, serta kepada kakak An Nasser Bayu Ajie, SE yang selalu memberikan
dukungan serta semangat.
Atas inspirasi dan motivasi dari berbagai pihak, penulis akhirnya mampu
menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini. Kritik dan saran senantiasa penulis
harapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat, terutama untuk
pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya untuk pengembangan ilmu biokimia.
Bogor, September 2014
Bellen Nastitie Pamela Fury
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
4
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
4
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
5
PEMBAHASAN
8
Kondisi Optimum Pertumbuhan Lactobacillus plantarum B 123
8
Produksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
8
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
9
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
SIMPULAN DAN SARAN
10
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
23
ix
DAFTAR GAMBAR
1 Pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan variasi
konsentrasi amonium sulfat
2 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
3 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
4 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
5 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis
5
6
6
7
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Kurva standar oNP dalam analisis aktivitas β-galaktosidase dengan
metode Lu et al. modifikasi (2009)
3 Kurva standar protein dalam analisis protein dengan metode Bradford
(1976)
4 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase yang diukur dengan metode Lu
et al. modifikasi (2009)
5 Hasil pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan
amonium sulfat
6 Hasil pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123
7 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
8 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
9 Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
10 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas β-galaktosidase L.
plantarum B 123 hasil dialisis
18
19
19
20
20
20
21
21
21
22
1
PENDAHULUAN
Intoleransi laktosa merupakan masalah yang dihadapi oleh lebih dari 70%
populasi di dunia akibat ketidakmampuan usus halus dalam mengabsorpsi laktosa.
Ketidakmampuan ini disebabkan karena adanya penurunan aktivitas βgalaktosidase yang berperan dalam menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa (Juajun et al 2011). Apabila ketersediaan β-galaktosidase di membran
mukosa usus halus rendah, laktosa tidak dapat dicerna dan akan difermentasi oleh
bakteri usus halus. Proses fermentasi ini akan menimbulkan gas yang
menyebabkan kembung dan rasa sakit di perut. Laktosa yang tidak dicerna akan
tetap berada di dalam saluran cerna, sehingga penyerapan air dari feses menjadi
terganggu. Hal inilah yang menyebabkan penderita intoleransi laktosa mengalami
diare (BPOM 2008). Menurut Kim dan Rajagopal (2000), produk hidrolisis
laktosa memiliki rasa yang lebih manis, mudah dicerna, dan mudah larut,
sehingga dapat dimanfaatkan untuk meringankan pencernaan laktosa.
Menurut Muchtadi et al. (1992), hidrolisis enzimatis memiliki beberapa
keuntungan seperti mampu bekerja secara spesifik, tidak memerlukan pH dan
temperatur ekstrim, serta pemisahan enzim di akhir proses tidak perlu dilakukan
karena konsentrasi enzim yang rendah. Cheetham (1985) juga menyatakan,
pemanfaatan enzim dalam industri pangan dapat mengurangi biaya produksi
karena penggunaannya yang relatif sedikit.
Secara umum enzim dihasilkan dari tiga sumber yaitu hewan, tumbuhan,
dan mikroorganisme. Namun, enzim yang digunakan secara luas dalam bidang
industri adalah berasal dari mikroorganisme karena memiliki beberapa kelebihan
seperti murah, stabil, jumlah enzim yang dihasilkan banyak, mudah
dikembangkan, serta prosedur untuk menghasilkan enzim lebih mudah dan aman
(Cheetham 1985). Lebih lanjut Sani et al. (1999) dan Chen et al. (2009)
mengungkapkan, enzim dari bakteri lebih dipilih karena aktivitasnya yang tinggi
dan optimum pada pH 6.0-7.0, sehingga sangat cocok untuk digunakan dalam
pengolahan produk susu yang memiliki pH 6.8.
Dekade ini, bakteri termofilik telah menjadi objek menarik untuk
menghasilkan β-galaktosidase. Aktivitas β-galaktosidase yang optimum pada suhu
45-80 °C, memberikan keuntungan yang signifikan bagi penerapan enzim
termostabil. Enzim termostabil memiliki beberapa keuntungan seperti kecepatan
reaksi yang lebih besar, risiko kontaminasi mikroba yang lebih kecil, dan enzim
mampu bertahan setengah hidup di bawah kondisi operasional (Chen et al. 2009).
Enzim yang digunakan dalam industri pangan harus memiliki beberapa
persyaratan seperti enzim harus cukup aktif pada kisaran pH, temperatur, dan
konsentrasi substrat yang umum digunakan dalam industri pangan. Enzim juga
harus terbebas dari komponen toksin, karsinogen, dan patogen, serta enzim harus
mudah diperoleh dalam keadaan murni dan stabil dengan aktivitas yang terkontrol
(Muchtadi et al. 1992). β-Galaktosidase yang digunakan pada penelitian ini
diisolasi dari Lactobacillus plantarum B 123 yang telah diakui sebagai GRAS
(Generally Recognized as Safe), sehingga dapat digunakan dalam industri pangan
karena terbebas dari endotoksin apapun. L. plantarum B 123 diisolasi dari sayuran
fermentasi tradisonal, koleksi Pusat Penelitan Biologi, LIPI dan telah dilakukan
pengujian aktivitas awal memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi.
2
Kurva pertumbuhan L. plantarum B 123 sudah diketahui sebelumnya
(Mariyani 2013), namun karakteristik β-galaktosidase L. plantarum B 123 belum
sepenuhnya terungkap. Tujuan penelitian ini adalah melakukan pemurnian parsial
dan karakterisasi β-galaktosidase L. plantarum B 123. Pemurnian β-galaktosidase
L. plantarum B 123 kemungkinan menghasilkan aktivitas β-galaktosidase yang
lebih tinggi dibandingkan dengan tanpa pemurnian (enzim kasar). Hasil penelitian
ini diharapkan dapat bermanfaat dalam pengembangan produk susu rendah laktosa
yang baik untuk dikonsumsi penderita intoleransi laktosa.
METODE
Bahan dan Alat
Media MRS (de Mann Rogosa Sharpe) yang digunakan sebagai media
produksi L. plantarum B 123 indigenous terdiri atas 1% pepton (Difco, France),
0.8% beef extract (Himidia, India), 0.4% yeast extract (Difco, France), 1% laktosa
(Difco, France), 0.1% Tween 80 (Merck, Germany), 0.5% natrium asetat (Merck,
Germany), 0.2% triamonium sitrat (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany),
0.02% magnesium sulfat monohidrat (Merck, Germany), 0.005% mangan sulfat
tetrahidrat (Merck, Germany), dan 0.2% dinatrium hidrogen fosfat dihidrat
(Merck, Germany).
Bahan kimia yang digunakan adalah bufer asetat 0.1 M, bufer fosfat 0.1 M;
0.05 M; 0.01 M, bufer Tris-HCl 0.1 M, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida atau
oNPG (Fluka, Switzerland), o-nitrofenol atau oNP (Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Germany), Na2CO3 1 M (Merck, Germany), bovine serum albumin atau BSA
(Merck, Germany), NaCl 0.15 M, pereaksi Bradford, logam CaCl2; CoCl2; CuCl2;
HgCl2; MnCl2; MgSO4; ZnSO4 10 mM (Merck, Germany), dan amonium sulfat
(Merck, Germany).
Alat yang digunakan adalah pH meter, inkubator (Isuzu, Japan), sentrifuga
(Kubota dan Eppendorf, Japan), sonikator (Ultrasonic homogenizer UH 150 SMT,
Japan), vorteks (Sibata, Japan), penangas air (Memmert, Germany dan Eyela,
Japan), pengaduk magnetik, membran dialisis selofan MWCO 6-8 kDa
(Calbiochem Novagen, Israel), dan spektrofotometer UV-Vis 1700 (Shimadzu,
Japan).
Prosedur Penelitian
Ekstraksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123 (Wang dan
Sakakibara modifikasi 1997)
Ekstraksi enzim dilakukan dengan cara: sebanyak 2% inokulum L.
plantarum B 123 (OD 0.7) dimasukkan ke dalam media produksi MRS steril
(kandungan laktosa 1% dan pH media 8), kemudian diinkubasi di dalam inkubator
dengan suhu 37 oC selama 24 jam. Selanjutnya, dilakukan pemanenan sel dengan
sentrifugasi berkecepatan 9500 rpm dengan suhu 4 oC selama 15 menit. Pelet yang
dihasilkan kemudian dicuci dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.5 (2 kali pencucian).
Pelet yang telah dicuci kemudian ditera dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.5 hingga
dicapai volume akhir 150 mL. Selanjutnya, sel (pelet) dipecah menggunakan
3
sonikator 50 kHz dengan suhu 4 oC selama 15 menit. Setelah sel pecah, dilakukan
pemisahan menggunakan sentrifugasi berkecepatan 9500 rpm dengan suhu 4 oC
selama 15 menit. Supernatan dipisahkan dari peletnya kemudian disimpan di
dalam ruang pendingin. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase L.
plantarum B 123 kasar. β-Galaktosidase kasar ini kemudian diuji aktivitas dan
kadar proteinnya sebelum dimurnikan secara parsial menggunakan pengendapan
amonium sulfat dan dialisis.
Pembuatan Kurva Standar oNP dan Penentuan Aktivitas β-Galaktosidase
(Lu et al. modifikasi 2009)
Pembuatan kurva standar oNP dilakukan dengan cara: oNP dilarutkan
dengan bufer fosfat 0.01 M pH 7.0 hingga didapatkan konsentrasi akhir 0.00-2.50
mM. Selanjutnya, ke dalam masing-masing larutan oNP berbagai konsentrasi
dimasukkan sebanyak 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 100 µL bufer fosfat
0.05 M pH 6.5. Campuran reaksi ini kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama
5 menit. Reaksi lalu dihentikan dengan 1 mL Na2CO3 1 M. Analisis dilakukan
menggunakan spektrofotometer UV Vis pada 420 nm. Hasil pembacaan aktivitas
β-galaktosidase yang dihasilkan selanjutnya diplotkan pada kurva standar. Satu
unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai sejumlah β-galaktosidase yang
mengkatalisis konversi dari 1 mol oNPG per unit dalam kondisi percobaan.
Penentuan aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara: sebanyak 100
L β-galaktosidase dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0. Setelah
itu, sebanyak 200 L oNPG 2 mg/mL ditambahkan ke dalam campuran reaksi
untuk kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit. Reaksi dihentikan
dengan 1 mL Na2CO3 1 M. Selanjutnya, analisis dilakukan menggunakan
spektrofotometer UV Vis pada 420 nm
Pembuatan Kurva Standar dan Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara: sebanyak 40 L protein
standar BSA berbagai konsentrasi (0.00-1.00 mg/mL) dimasukkan ke dalam 2 mL
pereaksi Bradford. Setelah 5 menit larutan dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV Vis pada 5λ5 nm.
Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara: sebanyak 20 L βgalaktosidase dimasukkan ke dalam 1 mL pereaksi Bradford. Setelah 5 menit,
larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada 5λ5 nm.
Pengendapan Protein dengan Amonium Sulfat (Scopes 1993)
Amonium sulfat dimasukkan ke dalam 10 mL β-galaktosidase kasar hingga
dicapai konsentrasi akhir 10%. Selama penambahan amonium sulfat, larutan βgalaktosidase kasar diaduk menggunakan pengaduk magnetik berkecepatan 60
rpm dengan suhu 4 oC. Pengadukan β-galaktosidase kasar dilanjutkan selama 20
menit untuk kemudian disimpan di dalam ruang pendingin selama 1 jam. Untuk
mendapatkan protein hasil pengendapan, dilakukan pemisahan dengan
sentrifugasi berkecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang
dihasilkan kemudian dipisahkan dari peletnya untuk digunakan pada pengendapan
bertingkat selanjutnya (pengendapan 20; 30; 40; 50; 60; dan 70%). Pelet yang
telah terpisah dari supernatan dicuci dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.05 M pH 6.5
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh diuji aktivitas β-galaktosidase dan kadar proteinnya.
3
4
Jumlah amonium sulfat (g/L) =
533(S2 - S1)
100 - (0.3 × S2)
Keterangan: S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat
S2 merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat
533 merupakan jumlah gram amonium sulfat yang dibutuhkan per
liter larutan untuk membuat larutan jenuh 100%
Dialisis
β-Galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat didialisis menggunakan
membran dialisis selofan MWCO 6-8 kDa. β-Galaktosidase yang telah
dimasukkan ke dalam membran dialisis, direndam di dalam 2 L bufer fosfat 0.01
M pH 6.5 dengan terus diaduk menggunakan pengaduk magnetik berkecepatan
100 rpm dengan suhu 4 oC. β-Galaktosidase hasil dialisis yang diperoleh
kemudian diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
Karakterisasi β-Galaktosidase
Uji Aktivitas β-Galaktosidase pada Berbagai pH. Uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan dengan cara: sebanyak 100 L β-galaktosidase
dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M variasi pH 4.5-8.5 (selang pH 0.5).
Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al.
modifikasi (2009).
Uji Aktivitas β-Galaktosidase pada Berbagai Suhu. Uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan dengan caraμ sebanyak 100 L β-galaktosidase
dimasukkan ke dalam 1 mL bufer 0.1 M pH 7.0 (pH optimum), kemudian
diinkubasi selama 5 menit pada variasi suhu 25-50 oC (selang suhu 5 oC).
Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al.
modifikasi (2009).
Uji Pengaruh Logam. Logam yang digunakan adalah CaCl2, CoCl2, CuCl2,
HgCl2, MnCl2, MgSO4, dan ZnSO4. Pengujian pengaruh logam dilakukan dengan
cara: sebanyak 100 L logam 0.01 M dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1
M pH 7.0 dan 100 L β-galaktosidase kasar. Selanjutnya, uji aktivitas βgalaktosidase dilakukan seperti metode Lu et al. modifikasi (2009).
Uji Pengaruh Konsentrasi Substrat. Sebanyak 100 L β-galaktosidase
hasil dialisis dimasukkan ke dalam 1 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0. Kemudian, ke
dalam campuran reaksi ini dimasukkan sebanyak 200 L oNPG berbagai
konsentrasi (0.01-5.00 mg/mL). Selanjutnya, uji aktivitas β-galaktosidase
dilakukan seperti metode Lu et al. modifikasi (2009).
HASIL
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Konsentrasi garam amonium sulfat 10-40% belum mampu mengendapkan
β-galaktosidase L. plantarum B 123 secara keseluruhan, dilihat dari aktivitas βgalaktosidase yang masih relatif rendah. Namun, setelah konsentrasi garam
amonium sulfat mencapai 50%, sebagian besar β-galaktosidase dapat terendapkan.
Aktivitas dan aktivitas spesifik β-galaktosidase pada konsentrasi garam amonium
sulfat 50% adalah sebesar 95.675 U dan 32.268 U/mg protein (Gambar 1).
35
120
30
100
25
80
20
60
15
40
10
5
20
0
0
10
Gambar 1
Aktivitas (U)
Aktivitas spesifik
(U/mg protein)
5
20
30
40
50
60
70
Amonium sulfat (%)
Aktivitas spesifik
Aktivitas
Pengendapan β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan variasi
konsentrasi amonium sulfat
β-Galaktosidase kasar memiliki aktivitas unit dan aktivitas spesifik sebesar
2470.51 U dan 8.08 U/mg protein. Setelah β-galaktosidase kasar diendapkan
dengan amonium sulfat 50%, kemurnian β-galaktosidase meningkat 3.99 kali lipat,
dengan rendemen 38.73%, dan aktivitas spesifik sebesar 32.27 U/mg. βGalaktosidase kemudian dimurnikan lebih lanjut menggunakan membran dialisis
selofan. Kemurnian β-galaktosidase meningkat 7.61 kali lipat, dengan rendemen
10.67%, dan aktivitas spesifik sebesar 61.53 U/mg (Tabel 1).
Tabel 1 Tahapan pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123
Tahapan
β-Galaktosidase
kasar
Pengendapan
amonium
sulfat 50%
Dialisis
Aktivitas
(U)
Total
protein
(mg)
Aktivitas
spesifik
(U/mg)
2470.51
305.68
8.08
100.00
1.00
956.75
29.65
32.27
38.73
3.99
262.84
4.27
61.53
10.67
7.61
Rendemen Kemurnian
(%)
(kali)
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengaruh pH terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 diuji pada rentang pH 4.5-8.5
dengan suhu 37 °C selama 5 menit. Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis
optimum pada pH 7.0. Setelah pH optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase
hasil dialisis dipertahankan sebesar 84% dan 70% pada pH 7.5 dan 8.0. Aktivitas
kemudian menurun tajam hingga aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis
dipertahankan sebesar 18% pada pH 8.5 (Gambar 2).
5
6
Aktivitas (U/mL)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
4.5
Gambar 2
5.0
5.5
6.0
6.5
pH
7.0
7.5
8.0
8.5
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai pH
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Aktivitas β-galaktosidase diuji pada rentang suhu 25-60 °C dengan pH 7.0
selama 5 menit. Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis optimum pada suhu 50 °C.
Setelah suhu optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis mampu
dipertahankan sebesar 96% pada suhu 55 °C. Aktivitas kemudian menurun pada
suhu 60 °C dengan aktivitas β-galaktosidase dipertahankan sebesar 54% (Gambar
3).
Aktivitas (U/mL)
60
50
40
30
20
10
0
25
Gambar 3
30
35
40
45
50
55
60
Suhu (°C)
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis pada
berbagai suhu
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Ion-ion logam Mg2+, Mn2+, Zn2+, dan Co2+ 10 mM mampu meningkatkan
aktivitas β-galaktosidase kasar masing-masing sebesar 25%, 31%, 19%, dan 12%,
namun ion-ion logam Cu2+, Hg2+, dan Ca2+ 10 mM menghambat aktivitas βgalaktosidase kasar masing-masing sebesar 94%, 96% dan 15% (Gambar 4).
7
35
31.26
32.63
29.69
Aktivitas (U/mL)
30
25
27.98
24.71
21.56
20
15
10
5
1.38
0.89
0
Kontrol Cu2+
Kontrol
Gambar 4
Hg2+
Mg
Mg2+ Mn2+
Ion logam
Zn
Zn2+
Co
Co2+
Ca
Ca2+
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar setelah
penambahan ion logam
Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L.
plantarum B 123
Kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) dan konstanta kinetik (KM) ditentukan
berdasarkan kurva Lineweaver-Burk yang menghasilkan garis lurus. Kurva
Lineawever-Burk dihasilkan dari plot invers sederet konsentrasi substrat oNPG
(1/[S]) dengan invers kecepatan reaksi β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis (1/V) yang menghasilkan persamaan linier y = 0.1553x + 0.138 (Gambar
5). Berdasarkan persamaan ini diperoleh nilai 1/Vmaks sebesar 0.138 dan nilai
KM/Vmaks sebesar 0.1553, sehingga didapatkan nilai Vmaks sebesar 7.25 U/mL dan
KM sebesar 1.13 mM.
4.0
3.5
y = 0.1553x + 0.138
R² = 0.9765
3.0
1/V
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
1/[S]
Gambar 5 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis
7
8
PEMBAHASAN
Kondisi Optimum Pertumbuhan Lactobacillus plantarum B 123
Media yang digunakan untuk pertumbuhan L. plantarum B 123 adalah
media MRS yang merupakan media selektif untuk pertumbuhan bakteri asam
laktat. Menurut Mariyani (2013), kondisi optimum pertumbuhan L. plantarum B
123 untuk menghasilkan β-galaktosidase dengan aktivitas tertinggi adalah pada
jumlah inokulum 2%, kandungan laktosa 1%, pH media 8, waktu inkubasi 24 jam,
dan suhu inkubasi 37 °C.
Produksi enzim oleh mikroba dapat ditingkatkan dengan menambahkan
suatu zat kimia yang dapat bertindak sebagai induser atau dengan mengubah
komposisi substrat (Muchtadi et al. 1992). Zat kimia yang dapat bertindak sebagai
induser adalah substrat atau senyawa yang sekerabat dengan substrat dari reaksi
yang dikatalis oleh enzim yang bersangkutan (Pelczar dan Chan 1986). Laktosa
merupakan sumber karbon dan induser untuk menghasilkan β-galaktosidase.
Seperti dilaporkan Kim dan Rajagopal (2000) dan Isobe et al. (2013),
Lactobacillus crispatus dan Teratosphaeria acidotherma memiliki aktivitas yang
lebih tinggi pada saat ditumbuhkan di media yang mengandung sumber karbon
laktosa dibandingkan pada saat ditumbuhkan di media yang mengandung sumber
karbon lain seperti glukosa dan maltosa. Sumber karbon laktosa juga digunakan
sebagai media pertumbuhan Lactobacillus brevis (Honda dan Yajima 2012),
Bacillus sp. MTCC 3088 (Chakraborti et al. 2000), Aspergillus alliaceus (Sen et
al. 2012), dan Arthrobacter sp. (Bialkowska et al. 2009). Penggunaan substrat
kromogenik oNPG pada pengujian aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123
juga didasarkan pada penelitian sebelumnya. Chakraborti et al. (2000)
menyatakan, hidrolisis oNPG pada Bacillus sp. MTCC 3088 menghasilkan
aktivitas β-galaktosidase yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan hidrolisis
substrat kromogenik lainnya.
Produksi β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Jumlah volume bufer yang digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase
adalah minimal dua kali bahan awal karena semakin banyak volume bufer yang
ditambahkan, semakin banyak pula protein enzim yang terekstrak. Namun,
dengan semakin banyaknya volume bufer yang digunakan, ekstrak enzim kasar
yang diperoleh akan menjadi lebih encer (Scopes 1987). Oleh karena itu,
perbandingan volume yang digunakan pada penelitian ini adalah 1:2.5, sehingga
larutan ekstrak yang didapatkan tidak terlalu encer dan enzim yang terisolasi lebih
stabil dan mudah diisolasi.
Bufer yang digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase adalah bufer
fosfat 0.05 M pH 6.5. Bufer fosfat dipilih karena memiliki kisaran pH 5.6-8.8
yang secara umum mendekati pH fisiologis. Mariyani (2013) menyatakan,
aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 optimum pada pH 6.5, sehingga
bufer fosfat pH 6.5 digunakan untuk mengekstraksi β-galaktosidase L. plantarum
B 123. Penggunaan bufer dengan konsentrasi rendah pun dipilih untuk
menghasilkan larutan yang memiliki tekanan osmotik rendah dan mencegah
terjadinya penurunan aktivitas katalitik (Deutscher 1990). Menurut Dennison
9
(2002), penggunaan tekanan osmotik rendah dapat membantu peristiwa lisisnya
sel dan organel, sehingga jumlah enzim yang terekstrak mampu ditingkatkan.
Selain itu, suhu 4 °C juga dipertahankan pada saat ektraksi guna mempertahankan
struktur dan fungsi dari protein.
Pemurnian Parsial β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengendapan β-galaktosidase berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi
protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein target
dari sebagian kontaminan yang tidak dikehendaki (Scopes 1987). Penggunaan
garam amonium sulfat juga dipilih karena memiliki beberapa keuntungan seperti
mudah larut, tidak toksik, dan stabil terhadap enzim (Darwis dan Sukara 1990).
Penambahan amonium sulfat dilakukan secara perlahan agar enzim dapat
mengendap dengan baik dan terus diaduk menggunakan pengaduk magnetik untuk
menghindari penumpukan kadar elektrolit pada satu tempat dan untuk
meningkatkan kontak pengendapan dengan enzim. Munculnya buih dihindari pada
saat pengendapan amonium sulfat karena buih yang terbentuk mengindikasikan
adanya kerusakan pada protein.
Tingkat kejenuhan amonium sulfat berbeda-beda, hal ini berhubungan
dengan jumlah asam amino hidrofilik dan hidrofobik yang terdapat pada
permukaan protein enzim. Protein enzim yang memiliki lebih banyak asam amino
hidrofilik akan membutuhkan konsentrasi garam yang lebih banyak untuk
mengendapkan protein enzim. Hal ini terjadi karena permukaan protein yang
hidrofilik akan berinteraksi kuat dengan air, sehingga diperlukan ion-ion dari
garam dalam jumlah banyak untuk mengganggu interaksi tersebut. Sebaliknya,
jika protein enzim mengandung lebih banyak asam amino hidrofobik, jumlah
amonium sulfat yang diperlukan untuk mengendapkan protein enzim pun akan
lebih sedikit (Scopes 1987).
Fraksinasi bertingkat β-galaktosidase L. plantarum B 123 menunjukan,
konsentrasi garam amonium sulfat 10-40% belum mampu mengendapkan βgalaktosidase secara keseluruhan (Gambar 1). Hal ini disebabkan karena protein
masih mengalami salting in. Saat salting in, ion garam yang dihasilkan akan
melindungi dan mencegah bersatunya molekul protein, sehingga protein masih
banyak yang melarut dibandingkan dengan β-galaktosidase yang banyak terbuang
pada saat pemisahan. Namun, setelah konsentrasi garam amonium sulfat mencapai
50%, sebagian besar β-galaktosidase L. plantarum B 123 dapat terendapkan. Hal
ini terjadi karena protein mengalami salting out. Saat salting out, ion garam yang
dihasilkan akan meningkatkan muatan listrik di sekitar protein, sehingga mantel
air protein akan tertarik. Hal inilah yang menyebabkan interaksi hidrofobik dan
kelarutan protein menurun (Suhartono et al. 1992). Lebih lanjut Scopes (1987)
menyatakan, jika konsentrasi amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan
melebihi nilai optimum yang dibutuhkan untuk mengendapkan molekul protein,
kelebihan ion-ion garam ini akan menarik molekul-molekul protein, sehingga
molekul-molekul protein menjadi terlarut kembali. Hal ini yang menyebabkan
jumlah protein terendapkan menjadi lebih sedikit.
Tujuan dari fraksinasi bertingkat ini adalah mendapatkan larutan dengan
tingkat kejenuhan yang berbeda dan diharapkan dapat diperoleh beberapa fraksi
yang memiliki aktivitas optimum. β-Galaktosidase L. plantarum B 123 memiliki
9
10
aktivitas optimum pada fraksi amonium sulfat 50% seperti β-galaktosidase
Lactobacillus bulgaricus (Hartono 2013). Aktivitas β-galaktosidase yang
optimum pada fraksi amonium sulfat 50% menunjukan bahwa, β-galaktosidase L.
plantarum B 123 memiliki sifat hidrofobik karena hanya diperlukan amonium
sulfat dalam jumlah relatif sedikit untuk mengendapkan β-galaktosidase.
Pernyataan ini diperkuat dengan hasil penelitian Chen et al. (2008) yang
menyatakan, β-galaktosidase Bacillus stearothermophilus mengandung lebih
banyak asam amino leusin, isoleusin, valin, prolin, dan alanin yang merupakan
asam amino yang bersifat non polar atau hidrofobik.
Setelah pengendapan β-galaktosidase dengan amonium sulfat, dilakukan
pemurnian dengan dialisis terhadap fraksi amonium sulfat yang memiliki aktivitas
optimum. Tujuan utama dialisis adalah menghilangkan molekul garam amonium
sulfat dan ion-ion penganggu lainnya yang dapat berpengaruh terhadap kestabilan
molekul enzim. Membran dialisis selofan yang digunakan memiliki ukuran 6-8
kDa, sehingga molekul yang berukuran kurang dari 6-8 kDa akan keluar dari
membran semipermeabel. Saat dialisis, terjadi proses difusi dan osmosis yang
ditandai dengan masuknya larutan bufer ke dalam kantong dialisis menggantikan
molekul garam yang keluar (Scopes 1993). Tahapan dialisis ini menyebabkan
aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 menurun (Tabel 1). Menurut Plumer
(1979), penurunan aktivitas setelah pemurnian dengan dialisis mungkin
disebabkan karena ion-ion penting yang berfungsi untuk menstabilkan dan
mengaktivasi enzim hilang selama proses dialisis, karena selain membran dialisis
bersifat semipermeabel terhadap ion-ion garam, membran dialisis juga bersifat
semipermeabel terhadap ion-ion lainnya.
Kemurnian β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis meningkat
7.61 kali lipat dibandingkan dengan β-galaktosidase kasar (Tabel 1). Tingkat
kemurnian ini lebih tinggi dibandingkan dengan β-galaktosidase Lactobacillus
bulgaricus (3.13 kali lipat) dan Lactobacillus plantarum (7.28 kali lipat) (Hartono
2013; Mariyani 2013). Aktivitas spesifik β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil
dialisis (61.53 U/mg protein) juga lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas
spesifik β-galaktosidase Lactobacillus bulgaricus (45.828 U/mg protein) (Hartono
2013). Pemurnian β-galaktosidase lebih lanjut seperti pemurnian menggunakan
metode kromatografi akan meningkatkan aktivitas β-galaktosidase seperti
ditunjukkan oleh β-galaktosidase Bifidobacterium longum (168.6 unit/mg protein),
Pseudoalteromonas sp. (251 unit/mg protein), Phaseolus vulgaris (281 unit/mg
protein), Bifidobacterium infantis (568.7 unit/mg protein), dan Thermotoga
naphtopila (1204.1 unit/mg protein), Bacillus stearothermophilus (125.2 unit/mg
protein) (Hsu et al. 2006; Fernandes et al. 2002; Biswas et al. 2003; Hung dan
Lee 2002; Honda dan Yajima 2012; Chen et al. 2008).
Karakteristik β-Galaktosidase Lactobacillus plantarum B 123
Pengaruh pH terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Setiap enzim memiliki kisaran pH optimum, yaitu kisaran pH pada saat
enzim menunjukan aktivitas maksimum dengan stabilitas tinggi (Suhartono 1989).
Saat kadar pH terlalu rendah, kelebihan ion H+ akan berikatan dengan sisi aktif
enzim atau sisi lain enzim yang bermuatan positif, sehingga akan terjadi tolakan
muatan yang mengakibatkan struktur enzim terbuka. Terbukanya struktur enzim
11
mengakibatkan perubahan konformasi pada sisi aktif enzim. Bila sisi aktif enzim
tidak sama dengan substrat, maka reaksi tidak akan terjadi. Sama halnya pada saat
kadar pH terlalu tinggi, adanya ion OH- akan bereaksi dengan gugus karboksil
pada sisi aktif enzim, sehingga mengakibatkan aktivitas enzim menurun (Palmer
1991). Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 optimum pada pH 7.0
(Gambar 2). Seperti β-galaktosidase Bifidobacterium longum (Hsu et al. 2006)
dan Bacillus stearothermophilus (Chen et al. 2008) yang juga optimum pada pH
7.0. Meningkatnya aktivitas enzim pada pH optimum dapat dikaitkan dengan
perubahan ionisasi pada sisi aktif enzim, sehingga konformasi sisi aktif menjadi
lebih efektif dalam mengikat dan mengubah substrat menjadi produk.
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Setiap enzim memiliki kisaran suhu tertentu untuk mencapai aktivitas
optimum. Sebelum suhu optimum tercapai, aktivitas β-galaktosidase akan terus
meningkat karena adanya peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak
vibrasi, translasi, serta rotasi antara enzim dan substrat, sehingga peluang
keduanya untuk saling bertumbukan menjadi lebih besar (Hames dan Hoper 2000).
Namun setelah suhu optimum terlewati, aktivitas β-galaktosidase akan terus
menurun. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi, sehingga
konformasi molekul protein menjadi berubah dan enzim kehilangan sifat
alamiahnya. Menurut Lehninger (1994), jika suatu protein terdenaturasi, struktur
tiga dimensi yang bersifat khusus dari rantai polipeptida juga akan terganggu.
Rantai polipeptida yang terganggu inilah yang menyebabkan struktur protein
menjadi terbuka dan acak. Terbukanya struktur protein tidak menjadikan struktur
kerangka kovalen rusak namun menyebabkan aktivitas biologis enzim menjadi
tidak berfungsi.
Aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis optimum pada
suhu 50 oC (Gambar 3). Seperti β-galaktosidase Lactobacillus kerfiranofaciens K1, Lactobacillus bugaricus, Lactobacillus lactis, dan Bullera singularis (Hsu et al.
2006; Kim dan Rajagopal 2000) juga optimum pada suhu 50 oC. Aktivitas yang
optimum pada suhu 50 oC ini menunjukan bahwa, β-galaktosidase L. plantarum B
123 bekerja aktif pada suhu tinggi atau bersifat termofilik. Menurut Sadeghi et al.
(2006), protein yang bersifat termofilik memiliki karakteristik yang berbeda pada
strukturnya dibandingkan dengan protein mesofilik. Protein termofilik memiliki
lebih banyak struktur jembatan garam dan ikatan hidrogen yang berlimpah
dibandingkan dengan protein mesofilik. Selain itu, protein termofilik memiliki
lebih banyak residu asam amino yang bersifat hidrofobik, sehingga menyebabkan
titik didih protein termofilik menjadi lebih tinggi.
Pengaruh Logam terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L. plantarum B 123
Enzim memerlukan kofaktor untuk mengaktivasi aktivitasnya dalam
menghidrolisis substrat. Kofaktor berinteraksi dengan residu asam amino pada sisi
aktif enzim, sehingga terjadi perubahan afinitas enzim terhadap substrat berupa
peningkatan atau penurunan aktivitas enzim (Lehninger 1994). Kofaktor
merupakan senyawa anorganik, seperti ion logam. Menurut Murray et al. (2003),
ion logam memiliki fungsi beragam dalam reaksi katalisis. Ion logam dapat
bertindak sebagai elektrofil dan nukleofil dengan cara menerima atau
menyumbangkan elektronnya.
11
12
Ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ berperan sebagai aktivator sedangkan
ion logam Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ berperan sebagai inhibitor bagi β-galaktosidase L.
plantarum B 123 kasar (Gambar 4). Seperti β-galaktosidase L. plantarum B 123,
β-galaktosidase L. bulgaricus (Hartono 2013), Bacillus liceniformis (Hsu et al.
2006), dan Pseudoalteromonas sp. (Fernandes et al. 2002) juga diaktifkan oleh
ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ serta dihambat oleh ion logam Ca2+, Cu2+,
dan Hg2+.
Matthews (2005) mengungkapkan, ion logam Mg2+ berperan sebagai
penstabil reaksi katalisis antara enzim dan substrat karena ion logam Mg2+
berikatan dengan nukleofil Glu 537, sehingga sisi aktif menjadi lebih stabil dan
reaksi antara enzim dan substrat menjadi lebih mudah terjadi. Palmer (1991) juga
menyatakan, ion logam berfungsi dalam peningkatan aktivitas enzim karena ion
logam dapat berperan dalam pengikatan antara enzim dan substrat untuk
menstabilkan konformasi sisi aktif enzim.
Penambahan ion logam berat seperti Hg2+ dan Cu2+ menurunkan sebagian
besar aktivitas β-galaktosidase L. plantarum B 123 kasar. Ion logam Hg2+
merupakan inhibitor ireversibel yang akan bereaksi membentuk ikatan kovalen
pada gugus fungsi, sehingga laju reaksi terhambat secara tetap. Lain halnya
dengan ion logam Cu2+, yang merupakan inhibitor reversibel non-kompetitif.
Ikatan yang terbentuk antara ion logam Cu2+ dan ezim tidak secara kovalen dan
ikatan yang terbentuk bukan pada sisi aktifnya, sehingga enzim dapat mengikat
substrat dan inhibitor secara bersamaan (Bintang 2010).
Penambahan 10 mM ion logam Ca2+ juga menurunkan aktivitas βgalaktosidase L. plantarum B 123 kasar. Namun, penambahan ion logam Ca2+
sampai pada batas tertentu mampu mengaktivasi aktivitas β-galaktosidase.
Penambahan 1 mM ion logam Ca2+ mampu meningkatkan aktivitas βgalaktosidase Pseudoalteromonas sp. namun penambahan 10 mM ion logam Ca2+
akan menghambat aktivitas β-galaktosidase. Seperti halnya pada β-galaktosidase
Bacillus liceniformis, penambahan 1; 2.5; dan 5 mM ion logam Ca2+ mampu
meningkatkan aktivitas β-galaktosidase, namun penambahan 10; 20; dan 25 mM
ion logam Ca2+ akan menghambat aktivitas β-galaktosidase (Chakraborti et al.
2000; Hung dan Lee 2002). Peristiwa ini didukung oleh pernyataan Palmer (1991)
yang menyatakan, beberapa enzim memerlukan ion-ion logam tertentu untuk
meningkatkan aktivitasnya. Namun, pada konsentrasi tertentu ion logam dapat
bertindak sebagai inhibitor.
Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas β-Galaktosidase L.
plantarum B 123
Penentuan KM dan Vmaks didasarkan pada hubungan antara konsentrasi
substrat [S] dan aktivitas enzim. Aktivitas enzim sebanding dengan kecepatan
reaksi enzim [V], yang didefinisikan sebagai kecepatan β-galaktosidase L.
plantarum B 123 dalam menghidrolisis oNPG menjadi oNP per menit. Hubungan
antara [S] dan [V] dapat dilihat pada Lampiran 13. Kecepatan enzimatis βgalaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis terus meningkat dengan
meningkatnya konsentrasi substrat, namun menjadi konstan ketika substrat terus
menerus ditingkatkan. Keadaan saat kecepatan tidak dapat meningkat lagi dengan
bertambahnya konsentrasi substrat disebut kecepatan maksimum (Vmaks). Setelah
nilai Vmaks diketahui, nilai KM dapat ditentukan. Nilai KM didefinisikan sebagai
13
suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila
kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari kecepatan maksimum
(Wiseman 1989).
Penentuan nilai KM dan Vmaks secara lebih tepat dapat ditentukan
berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk (Gambar 5). Berdasarkan persamaan ini,
diperoleh nilai Vmaks sebesar 7.25 U/mL dan KM sebesar 1.13 mM. Nilai Vmaks
sebesar 7.25 U/mL didefinisikan sebagai suatu kondisi optimum β-galaktosidase L.
plantarum B 123 untuk mengubah substrat oNPG menjadi oNP sebesar 7.25
U/mL setiap menit. Semakin tinggi Vmaks suatu enzim, semakin tinggi pula
kecepatan yang bisa dicapai oleh enzim tersebut.
β-Galaktosidase L. plantarum B 123 hasil dialisis (1.13 mM) memiliki
nilai KM yang lebih kecil dibandingkan dengan nilai KM β-galaktosidase
Thermotoga naphtophila (1.31 mM), Aspergillus niger van Tiegh (1.74 mM),
Bifidobacterium infantis (2.6 mM), Bacillus stearothermophilus (2.96 mM), L.
plantarum B 134 (3.93 mM), Bacillus liceniformis (13.7 mM), dan Bacillus sp.
MTCC 3088 (6.34 mM) (Fansi et al. 2014; Connell dan Walsh 2010; Hung dan
Lee 2002; Chen et al. 2008; Hartono 2013; Juajun et al. 2011; Chakraborti et al.
2000). Winarno (1999) menyatakan, semakin rendah nilai KM, semakin kuat
ikatan yang terbentuk antara enzim dan substrat. Selain itu, nilai KM yang rendah
juga menyebabkan energi yang diperlukan untuk memulai terjadinya reaksi
enzimatik lebih sedikit, sehingga reaksi menjadi lebih mudah terjadi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pemurnian parsial β-galaktosidase L. plantarum B 123 dengan pengendapan
amonium sulfat 50% dan dialisis mampu meningkatkan kemurnian βgalaktosidase sebesar 7.61 kali lipat, dengan rendemen 10.67%, dan aktivitas
spesifik 61.53 U/mg protein.
Aktivitas β-galaktosidase hasil dialisis optimum pada pH 7.0 dan suhu
50 °C. Ion-ion logam Mg2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ mampu meningkatkan aktivitas
β-galaktosidase kasar sedangkan ion-ion logam Cu2+, Hg2+, dan Ca2+ menghambat
aktivitas β-galaktosidase kasar pada konsentrasi 10 mM. Nilai KM dan Vmaks βgalaktosidase hasil dialisis sebesar 1.13 mM dan 7.25 U/mL.
Berdasarkan pemurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase, L.
plantarum B 123 merupakan bakteri asam laktat yang baik sebagai penghasil βgalaktosidase.
Saran
Saran untuk penelitian selanjutnya adalah penentuan stabilitas βgalaktosidase L. plantarum B 123 berdasarkan kemampuan β-galaktosidase untuk
mempertahankan aktivitasnya pada kondisi pH dan suhu optimum dalam berbagai
variasi waktu. Penentuan nilai KM dan Vmaks β-galaktosidase L. plantarum B 123
juga disarankan dapat dilakukan pengujian ulang kembali guna mendapatkan nilai
KM dan Vmaks yang lebih akurat dengan menggunakan minimal 6 titik sebelum
keadaan V maks tercapai.
13
14
DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2008. Kenali Intoleransi Lebih
Lanjut. InfoPOM. 9(1):1-3.
Bialkowska AM, Cieslinski H, Nowakowska KM, Kur J, Turkiewicz M. 2009. A
new β-galactosidase with a low temperature optimum isolated from the
Antarctic Arthrobacter sp. 20B: gene cloning, purification and
characterization. Arch Microbiol. 191:825-835.doi:10.1007/s00203-0090509-4.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik penelitian. Jakarta (ID): EGC.
Biswas S, Kayastha AM, Seckler R. 2003. Purification and characterization of a
thermostable β-galactosidase from kidney beans (Phaseolus vulgaris L.) cv.
PDR14. J Plant Physiol. 160:327-337.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72:248-254.
Chakraborti S, Sani RK, Banerjee UC, Sobti RC. 2000. Purification and
characterization of a novel β-galactosidase from Bacillus sp. MTCC 3088. J
Indust Microbiol Biotechnol. 24:58-63.
Cheetham PSJ. 1985. The applications of enzyme in industry. Di dalam: Wiseman
A, editor. Handbook of Enzyme Biotechnology. Ed ke-2. New York (US): J
Wiley. hlm 274-293.
Chen W, Chen H, Xia Y, Zhao J, Tian F, Zhang H. 2008. Production, purification,
and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk
lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J Dairy Sci. 91:17511758.doi:10.3168/jds.2007-617.
Chen W, Chen H, Xia Y, Yang J, Zhao J. 2009. Immobilization of recombinant
thermostable [beta]-galactosidase from Bacillus stearothermophilus for
lactose hydrolysis in milk. J Dairy Science. 92(2):491-498.
Connell S, Walsh G. 2010. A novel acid-stable, acid-active β-galactosidase
potentially suited to the alleviation of lactose intolerance. Appl Microbiol
Biotechnol. 86:517-524.doi:10.1007/s00253-009-2270-7.
Darwis AA, Sukara E. 1990. Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Enzim. Bogor
(ID): IPB Pr.
Dennison C. 2002. A Guide to Protein Isolation. New York (US): Kluwer
Academic.
Deutscher MP. 1990. Methods in Enzimology: Guide to Protein Purification.
Volume ke-1. California (US): Academic Pr.
Fansi K, Yeqing W, Shungui C, Renjun G, Guiqiu X. 2014. Cloning, purification
and characterization of a thermostable β-galactosidase from Thermotoga
naphthophila RUK-10. Process Biochem. 49:775-782.
15
Fernandes S, Geueke B, Delgado O, Coleman J, Hatti-Kaul R. 2002. βGalactosidase from a cold-adapted bacterium: purification, characterization
and application for lactose hydrolysis. Appl Microbiol Biotechnol. 58:313321.doi:10.1007/s00253-001-0905-4.
Hames BD, Hoper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. Ed ke-2.
Hongkong (HK): Springer-Verlag.
Hartono LK. 2013. Pemurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat
bakteri asam laktat (BAL) strain B134 [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Honda H, Yajima N. 2012. Characterization of lactose utilization and βgalactosidase in Lactobacillus brevis KB290, the hetero-fermentative lactic
acid bacterium. Curr Microbiol. 65:679-685.doi:10.1007/s00284-012-02162.
Hsu CA, Yu RC, Chou CC. 2006. Purification and characterization of a sodiumstimulated β-galactosidase from Bifidobacterium longum CCRC 15708. J
Microbiol Biotechnol. 22:355-361.doi:10.1007/s11274-005-9041-0.
Hung MN, Lee BH. 2002. Purification and characterization of a recombinant βgalactosidase with transgalactosylation activity from Bifidobacterium
infantis HL96. Appl Microbiol Biotechnol. 58:439-445.doi:10.1007/s00253001-0911-6.
Isobe K, Yamashita M, Chiba S, Takahashi N, Koyama T. 2013. Characterization
of new β-galactosidase from acidophilic fungus Teratosphaeria acidotherma
AIU BGA-1. J Biosci Bioengin. 116(3):293-297.
Juajun O, Nguyen TH, Maischberger T, Iqbal S, Haltrich D, Yamabhai M. 2011.
Cloning, purification, and characterization of β-galactosidase from Bacillus
licheniformis DSM 13. Appl Microbiol Biotechnol. 89:645654.doi:10.1007/s00253-010-2862-2.
Kim JW, Rajagopal SN. 2000. Isolation and characterization of β-galactosidase
from Lactobacillus crispatus. Folia Microbiol. 45(1):29-34.
Lehninger AL. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Thenawidjaja M, penerjemah.
Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Lu LL, Xiao M, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating βgalactosidase from Enterobacter cloacae B5. Process Biochem. 44: 232-236.
Mariyani N. 2013. Potensi enzim β-galaktosidase dari Lactobacillus plantarum
strain B123 indigenous untuk hidrolisis laktosa pada susu UHT [tesis].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Matthews BW. 2005. The structure of Escherichia coli β-galactosidase. CR
Biologies. 328:529-556.
Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Bogor
(ID): PAU-IPB.
15
16
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper.
Hartono A, penerjemah; Bani AP dan Sikumbang TMN, editor. Jakarta (ID):
EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry. Ed ke-25.
Palmer T. 1991. Understanding Enzymes. Inggris (GB): Ellis Horwood.
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume ke-1.
Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta
(ID): UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Plumer DT. 1979. An Introduction to Practical Biochemistry. Ed ke-2. New Delhi
(IN): McGraw-Hill.
Sadeghi M, Manesh HN, Zarrabi M, Ranjbar B. 2006. Effective factors in
thermostability of thermophilic proteins. Biophysic Chem. 119(3):256-270.
doi:10.1016/j.bpc.2005.09.018.
Sani RK, Chakraborti S, Sobti RC, Patnaik PR, Banerjee UC. 1999.
Characterization and some reaction-engineering aspects of thermostable
extracellular β-galactosidase from a new Bacillus species. Folia Microbiol.
44(4):367-371.
Scopes RK. 1987. Protein Purification: Principles and Practice. Ed ke-2. New
York (US): Springger-Verlag.
Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York (US): RR Doneley and Sons.
Sen S, Ray L, Chattopadhyay. 2012. Production, purification, immobilization, and
characterization of a thermostable β-galactosidase from Aspergillus
alliaceus. Appl Biochem Biotechnol. 167:1938-1953.doi:10.1007/s12010012-9732-6.
Suhartono MT, Suswanto A, Widjaja H. 1992. Struktur dan Biokimiawi Protein.
Bogor (ID): PAU-IPB.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor (ID): PAU-IPB.
Wang D, Sakakibara M. 1λλ7. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in
sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem.
4:255-261.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Jakarta (ID): Gramedia.
Wiseman A. 1989. Handbook of Enzymes Biotechnology. Ed ke-2. New York
(US): Ellis Howard.
17
LAMPIRAN
17
18
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Peremajaan L. plantarum B
123
2% Inokulum, 1% Laktosa, pH media 8,
Waktu Inkubasi 24 Jam, Suhu 37 °C
Ekstraksi
Karakterisasi
Pengaruh
Logam
Pengendapan amonium sulfat
Dialisis
Karakterisasi
Aktivitas pH & Suhu, Parameter Kinetik
19
Kurva standar oNP dalam analisis aktivitas β-galaktosidase dengan
metode Lu et al. modifikasi (2009)
[oNP]
[oNP]
[oNP]
[oNP] Absorbansi
(M)
(g)
(mol)
(µmol)
(420 nm)
0.00000
0.0000000000
0.000000000
0.000
0.000
0.00005
1.599765E-05