METODOLOGI UMUM Karakterisasi bakteri asam laktat indigenus asal daging sapi sebagai probiotik dan identifikasinya dengan analisis urutan basa gen 16s rRNA

39

3. METODOLOGI UMUM

Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 – Januari 2010, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Pangan SEAFAST CENTER IPB, Laboratorium Hewan Percobaan SEAFAST CENTER IPB, Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan IPB dan Laboratory of Applied Microbiology, International Center for Biotechnology, Osaka University, Jepang. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah 28 buah isolat bakteri asam laktat yang diisolasi dari daging sapi segar bangsa Peranakan Ongole di pasar tradisional wilayah Bogor. Bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MRS broth Oxoid, MRS agar Oxoid, Nutrien Agar Difco, Nutrien Broth Difco, EMBA Eosin Methylen Blue Agar, Merck, HCl 0.1 N, garam empedu bile salt, Pronadisa, membran filter Sartorius 0.22 µ m, standar Mc Farland no 0.5, Buffer Pepton Water BPW, Phosphat Buffer Saline PBS, MHA Mueller Hinton Agar, bakteri patogen Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Eschericia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 2593 dan Escherichia coli enteropatogen EPEC koleksi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pengujian in vivo menggunakan tikus putih Albino Norway Rats galur Sprague Dawley hasil pengembangbiakan Badan POM RI. Bahan-bahan yang digunakan untuk identifikasi secara molekuler di antaranya Taq polymerase, primer, gel agarosa, etidium bromida, air destilasi dan big-dye terminator versi 3.1. Secara lengkap, bahan yang digunakan pada penelitian ini dijelaskan pada Bab 4,5 dan 6. 40 Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sebagai berikut : cawan petri, tabung reaksi, inkubator, oven, autoclave, vortex, sentrifuse dingin, mikropipet, spektrofotometer, kandang percobaan, PCR, UV transluminator, elektroforesis gel agarosa, sequencer. Secara lengkap, peralatan yang digunakan pada penelitian ini dijelaskan pada Bab 4, 5 dan 6. Tahapan Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap kajian yaitu : 1 seleksi dan karakterisasi BAL indigenus asal daging sapi sebagai kandidat probiotik secara in vitro, 2 identifikasi BAL indigenus dengan menggunakan PCR dan analisis urutan basa gen 16S rRNA dan 3 pengujian efektivitas dua galur BAL yang mempunyai sifat probiotik berdasarkan hasil kajian penelitian 1 untuk mencegah diare pada tikus yang dipapar EPEC. Secara lengkap, metode dan prosedur penelitian yang dilakukan pada setiap tahap kajian penelitian dijelaskan pada Bab 4, 5 dan 6. Tahapan kajian, aktivitas dan output penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 3.1. Persiapan dan Penyimpanan Kultur Bakteri Isolat BAL indigenus hasil isolasi dari daging sapi tersedia dalam bentuk kultur kering liofil. Isolat tersebut dipindahkan ke media MRS broth steril lalu suspensi bakteri dipipet dan dipindahkan ke tabung lain yang berisi media MRS broth 5 ml. Tabung yang berisi suspensi kultur diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam, selanjutnya kultur digoreskan dengan menggunakan ose pada media MRS agar. Kultur disimpan dalam media MRS agar miring pada refrigerator suhu 5°C. Setiap akan digunakan pada pengujian, sebanyak satu ose dari biakan miring diambil dan diinokulasikan ke dalam 10 ml MRS broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Penyegaran kultur dilakukan dengan menginokulasikan 0.1 ml kultur bakteri cair untuk dimasukkan ke dalam 9.9 ml MRS broth, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan kultur siap untuk digunakan. 41 Kultur BAL pada MRS agar miring disimpan untuk penggunaan jangka waktu selama satu bulan. Sebagai kultur stok yang digunakan dalam jangka waktu lebih lama dari satu bulan, maka dilakukan pengawetan kultur BAL pada media MRS broth yang mengandung 20 gliserol dan disimpan pada freezer suhu -30°C. Isolat bakteri patogen yang digunakan pada penelitian ini tersedia dalam biakan agar miring. Pembiakan dan penyegaran kultur bakteri patogen dilakukan seperti prosedur penyegaran BAL, namun media yang digunakan adalah Nutrient broth dan Nutrient agar. Penyimpanan kultur patogen dilakukan pada biakan agar miring dalam refrigerator suhu 5°C dan disegarkan kembali setiap satu bulan. Kajian pertama : Seleksi dan karakterisasi BAL indigenus asal daging sapi sebagai kandidat probiotik secara in vitro Aktivitas : 1. Pengujian ketahanan hidup pada kondisi pH saluran pencernaan pH 2.0, 2.5, 3.2 dan 7.2 2. Pengujian ketahanan hidup pada kondisi garam empedu 0.5 3. Pengujian aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen E.coli ATCC 25922, S.Typhimurium ATCC 14028, S.aureus ATCC 25923 dan E.coli enteropatogenEPEC 4. Pengujian koagregasi terhadap bakteri bakteri patogen E.coli ATCC 25922, S.Typhimurium ATCC 14028, S.aureus ATCC 25923 dan E.coli enteropatogenEPEC 5. Pengujian penempelan BAL pada permukaan usus Output : BAL indigenus asal daging sapi yang mempunyai sifat sebagai probiotik Kajian kedua : Identifikasi BAL indigenus asal daging sapi dengan menggunakan PCR dan analisis urutan basa gen 16S rRNA Aktivitas : 1. Ekstraksi DNA 2. PCR Polymerase Chain Reaction 3. Elektroforesis agarosa 4. Analisis urutan basa sequencing gen 16S rRNA 5. Penyusunan pohon filogenetik Output : Identitas BAL indigenus asal daging sapi genus, spesies, galur Kajian ketiga : Efektivitas BAL probiotik unggul sebagai pencegah diare pada tikus yang dipapar EPEC Aktivitas : 1. Pengujian performa tikus kadar air feses, konsumsi ransum, pertambahan bobot badan, efisiensi ransum 2. Pengujian total BAL dan E. coli pada mukosa dan isi sekum 3. Penghitungan jumlah sel limfosit Output : BAL probiotik pencegah diare yang disebabkan EPEC Gambar 3.1 Tahapan aktivitas penelitian 43

4. SELEKSI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT INDIGENUS ASAL DAGING SAPI SEBAGAI