Jenis dan Rancangan Penelitian Variabel Penelitian Variabel Definisi Operasional Skema Alur Penelitian Analisis Data

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental laboratoris dengan rancangan post test only control group design dengan melakukan uji efek ekstrak teh hijau Camellia sinensis terhadap pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis. 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2.1 Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di dua tempat, yaitu: 1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU 2. Laboratorium Pusat Penyakit Tropis UNAIR

3.2.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Oktober sampai dengan November 2013. 3.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1 Sampel Penelitian Sampel penelitian adalah koloni Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah diisolasi dan dibiakkan dalam media Tryptic Soy Agar TSA.

3.3.2 Besar Sampel Penelitian :

Penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan SOP Standard Operasional Procedure yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga: a. Penentuan nilai KHM - Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100 = 5 sampel - Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50 = 5 sampel - Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25 = 5 sampel - Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel - Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25 = 5 sampel - Kelompok VI : kontrol Mc Farland = 1 sampel - Kelompok VII: kontrol negatif ekstrak teh hijau tanpa suspensi P. gingivalis = 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel Dari masing – masing konsentrasi dilakukan dilusi pengenceran untuk mendapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. b. Penentuan nilai KBM Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra. - Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100 = 5 sampel - Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50 = 5 sampel - Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25 = 5 sampel - Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel - Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25 = 5 sampel - Kelompok VI : kontrol Mc Farland = 1 sampel - Kelompok VII: kontrol negatif ekstrak teh hijau tanpa suspensi P. gingivalis = 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel

3.4 Variabel Penelitian Variabel

bebas: Larutan ekstrak teh hijau dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Variabel tergantung: Pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis pada media Tryptic Soy Agar dengan pengukuran nilai KHM dan KBM. Variabel terkendali: ‐ Kondisi daun teh hijau ‐ Cara ekstraksi teh hijau bahan, alat, metode, tempat penyimpanan, cara penyimpanan ‐ Media tumbuh bakteri Variabel Tak Terkendali : - Tanah tumbuh teh hijau - Lama waktu teh hijau diekstraksi - Bagian tanaman teh hijau yang diambil

3.5 Definisi Operasional

- Ekstrak teh hijau adalah ekstrak daun teh hijau yang telah diperkolasi dengan pelarut etanol 70 sehingga diperoleh larutan kental ekstrak teh hijau. - Koloni Porphyromonas gingivalis adalah bakteri Porphyromonas gingivalis yang dikultur dalam media Tryptic Soy Agar TSA. - KHM Konsentrasi Hambat Minimal adalah konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada media perbenihan dengan menggunakan metode dilusi. - KBM Konsentrasi Bunuh Minimal adalah konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh bakteri 99,9-100 setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. 3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian ‐ Teh hijau sebanyak 400 gram ‐ Pelarut etanol 70 sebanyak 5 liter ‐ Suspensi Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 ‐ Media Tryptic Soy Agar TSA ‐ Media Tryptic Soy Broth TSB

3.6.2 Alat Penelitian

- Vacuum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany - Aluminium foil 1 gulungan - Erlenmeyer Pyrex, USA - Destilator - Lemari penyimpan petri - Inkubator CO 2, 37°C - Blender Panasonic, Japan - Kertas saring Whatman no. 42, England - Autoklaf Tomy, Japan - Elektronic balance Ohyo JP2 6000, Japan - Vortex whirli mixer Iwaki model TM 100, Japan - Pipet mikro dan tips Gilson, France - Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan - Ose, spiritus 3.7 Proses Pengambilan dan Sampel Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Teh Hijau Bahan baku berupa daun teh hijau sebanyak 400 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikeringkan di lemari pengering selama lebih kurang 1 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 70. Gambar 4. Teh hijau yang sudah Gambar 5. Penimbangan daun teh kering hijau Gambar 6. Proses perendaman teh hijau Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, massa diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur ≤40 o C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental teh hijau. Gambar 7. Simplisia dalam Gambar 8. Ekstrak teh perkolator hijau

3.7.2 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Tryptic Soy Agar TSA sebanyak 20 gram bubuk TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquades untuk 40 petri 20mlpetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121 o C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, maka media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin. Gambar 9. Penimbangan TSA Gambar 10. Media TSA diautoklaf

3.7.3 Pembuatan Suspensi Bakteri

Kegiatan pembuatan suspensi bakteri menggunakan Porphyromonas gingivalis yang telah dibiakkan secara murni pada media Tryptic Soy Agar TSA dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCL 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 8 CFUml. Gambar 11. Porphyromonas gingivalis yang telah dibiakkan secara murni pada media TSA

3.7.4 Pembuatan Kontrol Positif

Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.

3.7.5 Pembuatan Kontrol Negatif

Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak teh hijau tanpa suspensi bakteri. Ekstrak ini diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.

3.7.6 Penentuan KHM Bahan Coba

Bahan coba ekstrak daun teh hijau yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam pembenihan tersebut.

3.7.7 Penentuan KBM Bahan Coba

Setelah KHM didapatkan, maka penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 masing-masing divorteks dalam suasana anaerob dan diambil 50 µl lalu diteteskan ke dalam media padat Tryptic Soy Agar direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.

3.8 Skema Alur Penelitian

3.9 Analisis Data

Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan menggunakan uji statistik sebagai berikut: 1. Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak teh hijau terhadap pertumbuhan Porphyromonas gingivalis. 2. Uji Least Significant Disease LSD, untuk melihat perbedaan efek antibakteri antara masing-masing kelompok perlakuan. Pembuatan Ekstrak Teh Hijau Pembuatan Media Bakteri Pembuatan Suspensi Bakteri Pembuatan Kontrol Positif Pembuatan Kontrol Negatif Penentuan KHM Bahan Coba Penentuan KBM Bahan Coba Analisis data

BAB 4 HASIL PENELITIAN

4.1 Ekstrak Teh Hijau

Dalam penelitian ini daun teh hijau dikeringkan dan dihaluskan ±400 gram kemudian diperkolasi dengan pelarut etanol 70 sebanyak 5 liter, dihasilkan maserat cair 4 liter, diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental teh hijau yang berwarna hijau kehitaman sebanyak ±45 gram gambar 12, disimpan di dalam botol kaca tertutup dan diletakkan dalam lemari pendingin. Gambar 12. Ekstrak teh hijau

4.2 Uji Efektivitas Antibakteri

Observasi terhadap KHM adalah dengan melihat tabung yang mulai berubah menjadi jernih setelah diberi perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Dari konsentrasi 100, 50, 25,12,5 dan 6,25, kekeruhan bahan coba dalam tabung tidak berubah bila dibandingkan dengan kontrol Mc Farland