BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental laboratoris dengan rancangan post test only control group design dengan melakukan uji efek
ekstrak teh hijau Camellia sinensis terhadap pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2.1 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di dua tempat, yaitu: 1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
2. Laboratorium Pusat Penyakit Tropis UNAIR
3.2.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Oktober sampai dengan November 2013.
3.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1 Sampel Penelitian
Sampel penelitian adalah koloni Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah diisolasi dan dibiakkan dalam media Tryptic Soy Agar TSA.
3.3.2 Besar Sampel Penelitian :
Penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan SOP Standard Operasional Procedure
yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga:
a. Penentuan nilai KHM
- Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100
= 5 sampel -
Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50 = 5 sampel
- Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25
= 5 sampel -
Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel
- Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25
= 5 sampel -
Kelompok VI : kontrol Mc Farland = 1 sampel
- Kelompok VII: kontrol negatif ekstrak teh hijau tanpa suspensi P.
gingivalis = 1 sampel
Jumlah sampel = 27 sampel Dari masing – masing konsentrasi dilakukan dilusi pengenceran untuk
mendapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. b.
Penentuan nilai KBM Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang
dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra.
- Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100
= 5 sampel -
Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50 = 5 sampel
- Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25
= 5 sampel -
Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel
- Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25
= 5 sampel -
Kelompok VI : kontrol Mc Farland = 1 sampel
- Kelompok VII: kontrol negatif ekstrak teh hijau tanpa suspensi P.
gingivalis = 1 sampel
Jumlah sampel = 27 sampel
3.4 Variabel Penelitian Variabel
bebas:
Larutan ekstrak teh hijau dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25.
Variabel tergantung:
Pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis pada media Tryptic Soy Agar
dengan pengukuran nilai KHM dan KBM.
Variabel terkendali:
‐ Kondisi daun teh hijau ‐ Cara ekstraksi teh hijau bahan, alat, metode, tempat penyimpanan, cara
penyimpanan ‐ Media tumbuh bakteri
Variabel Tak Terkendali :
- Tanah tumbuh teh hijau
- Lama waktu teh hijau diekstraksi
- Bagian tanaman teh hijau yang diambil
3.5 Definisi Operasional
- Ekstrak teh hijau adalah ekstrak daun teh hijau yang telah diperkolasi dengan pelarut etanol 70 sehingga diperoleh larutan kental ekstrak teh hijau.
- Koloni Porphyromonas gingivalis adalah bakteri Porphyromonas gingivalis
yang dikultur dalam media Tryptic Soy Agar TSA. - KHM Konsentrasi Hambat Minimal adalah konsentrasi minimal bahan
coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada media perbenihan dengan
menggunakan metode dilusi. - KBM Konsentrasi Bunuh Minimal adalah konsentrasi minimal bahan
coba yang dapat membunuh bakteri 99,9-100 setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat
menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra.
3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian
‐ Teh hijau sebanyak 400 gram ‐ Pelarut etanol 70 sebanyak 5 liter
‐ Suspensi Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 ‐ Media Tryptic Soy Agar TSA
‐ Media Tryptic Soy Broth TSB
3.6.2 Alat Penelitian
- Vacuum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
- Aluminium foil 1 gulungan
- Erlenmeyer Pyrex, USA
- Destilator
- Lemari penyimpan petri
- Inkubator CO
2,
37°C -
Blender Panasonic, Japan -
Kertas saring Whatman no. 42, England -
Autoklaf Tomy, Japan -
Elektronic balance Ohyo JP2 6000, Japan -
Vortex whirli mixer Iwaki model TM 100, Japan -
Pipet mikro dan tips Gilson, France -
Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan -
Ose, spiritus
3.7 Proses Pengambilan dan Sampel Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Teh Hijau
Bahan baku berupa daun teh hijau sebanyak 400 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikeringkan di lemari pengering selama
lebih kurang 1 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk
simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 70.
Gambar 4. Teh hijau yang sudah Gambar 5. Penimbangan daun teh
kering hijau
Gambar 6. Proses perendaman
teh hijau
Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, massa diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan
aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup
merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga
disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga
dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua
perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator
pada tekanan 1 ATM dengan temperatur ≤40
o
C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental teh hijau.
Gambar 7. Simplisia dalam
Gambar 8. Ekstrak teh perkolator
hijau
3.7.2 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Tryptic Soy Agar TSA sebanyak 20 gram bubuk TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquades untuk 40 petri
20mlpetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20
menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121
o
C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, maka media
dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
Gambar 9. Penimbangan TSA Gambar 10. Media TSA
diautoklaf
3.7.3 Pembuatan Suspensi Bakteri
Kegiatan pembuatan suspensi bakteri menggunakan Porphyromonas gingivalis
yang telah dibiakkan secara murni pada media Tryptic Soy Agar TSA dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah
dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCL 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mc Farland atau
sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
Gambar 11. Porphyromonas gingivalis
yang telah
dibiakkan secara
murni pada
media TSA
3.7.4 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak
2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.5 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak teh hijau tanpa suspensi bakteri. Ekstrak ini diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.6 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak daun teh hijau yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil
sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah
dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian
divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai
tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat
pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam pembenihan tersebut.
3.7.7 Penentuan KBM Bahan Coba
Setelah KHM didapatkan, maka penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan
konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 masing-masing divorteks dalam suasana anaerob dan diambil 50 µl lalu diteteskan ke dalam media padat Tryptic
Soy Agar direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan
diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila
dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni,
bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan
faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka
faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali
dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
3.8 Skema Alur Penelitian
3.9 Analisis Data
Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan menggunakan uji statistik sebagai berikut:
1. Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek
antibakteri ekstrak teh hijau terhadap pertumbuhan Porphyromonas gingivalis. 2.
Uji Least Significant Disease LSD, untuk melihat perbedaan efek antibakteri antara masing-masing kelompok perlakuan.
Pembuatan Ekstrak Teh Hijau Pembuatan Media Bakteri
Pembuatan Suspensi Bakteri Pembuatan Kontrol Positif
Pembuatan Kontrol Negatif Penentuan KHM Bahan Coba
Penentuan KBM Bahan Coba
Analisis data
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Teh Hijau
Dalam penelitian ini daun teh hijau dikeringkan dan dihaluskan ±400 gram kemudian diperkolasi dengan pelarut etanol 70 sebanyak 5 liter,
dihasilkan maserat cair 4 liter, diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental teh hijau yang berwarna hijau kehitaman
sebanyak ±45 gram gambar 12, disimpan di dalam botol kaca tertutup dan diletakkan dalam lemari pendingin.
Gambar 12. Ekstrak teh hijau
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Observasi terhadap KHM adalah dengan melihat tabung yang mulai berubah menjadi jernih setelah diberi perlakuan dibandingkan dengan kontrol.
Dari konsentrasi 100, 50, 25,12,5 dan 6,25, kekeruhan bahan coba dalam tabung tidak berubah bila dibandingkan dengan kontrol Mc Farland