2.6 Kromatogarafi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC High Perfomance Liquid Chromatography dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal 1970-an. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-
produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan
polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis Gandjar, 2007.
2.6.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Gandjar, 2007. Sistem kromatografi dijalankan dengan cara sebagai berikut. Fase gerak
didorong melalui kolom dengan tekanan yang dikehendaki dengan laju sesuai dengan yang diinginkan. Setelah sistem mencapai kesetimbangan, cuplikan yang
dilarutkan di dalam pelarut yang cocok disuntikkan ke dalam sistem, biasanya
Universitas Sumatera Utara
melalui katup. Linarut terbawa ke dalam kolom, dipisahkan, dan keluar dalam efluen melalui detektor Gritter, 1991.
Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, jadi memastikan
kesetimbangan yang baik antara fase. Persyaratan kedua agar pemisahan baik ialah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi sekecil-kecilnya. Untuk
memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada sebagian besar situasi kromatografi, maka penyerap atau penyangga berupa serbuk halus. Untuk
memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang terbagi pada serbuk halus harus digunakan tekanan tinggi Gritter, 1991.
2.6.2 Komponen KCKT 2.6.2.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut
bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT HPLC
grade. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Gandjar, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.6.2.2 Fase Gerak pada KCKT
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Untuk fase normal fase diam lebih polar darpada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
fase diam kurang polar daripada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut Gandjar, 2007.
Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu peubah yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai
dalam semua ragam KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang berlaku umum.
Menurut Edward dan Stevenson, 1991, fase gerak haruslah: a.
Murni, tanpa cemaran. b.
Tidak bereaksi dengan kemasan. c.
Sesuai dengan detektor. d.
Dapat melarutkan cuplikan. e.
Mempunyai viskositas yang rendah. f.
Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan.
g. Harganya wajar.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril Gandjar, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.6.2.3 Pompa pada KCKT
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mlmenit Gandjar, 2007. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT
yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan Gandjar, 2007.
2.6.2.4 Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom, diusahakan agar sesedikit mugkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.
Menurut Edward dan Stevenson 1991, ada tiga ragam utama injektor: a.
Aliran henti: aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer; sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi biasanya sistem aliran
utama tetap berada pada tekanan kerja. Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi.
b. Septum: ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan
injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tesebut dapat
Universitas Sumatera Utara
dipakai pada tekanan sampai 60-70 atmosfer. Sayang sekali, septum tidak dapat dipakai untuk semua pelarut KC. Selain itu, partikel kecil terlepas
dari septum dan cenderung menyumbat. c.
Katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang
diotomatkan. Volum yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual memakai adaptor khusus. Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan
diisi pada tekanan atmosfer. Jika katup dijalankan dibuka, cuplikan di dalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom.
2.6.2.5 Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut
Edward dan Stevenson 1991, kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a.
Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang
kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
panjang 25-100 cm.
2.6.2.6 Fase Diam pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
Universitas Sumatera Utara
benzen. Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi Gandjar, 2007.
2.6.2.7 Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka,
tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair
kecepatan tinggi modern KCKT ialah detektor UV 254 nm Edward dan
Stevenson, 1991.
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Menurut Gandjar 2007, idealnya, suatu detektor harus mempunyai
karakteristik sebagai berikut: 1.
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel 2.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
Universitas Sumatera Utara
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas 6.
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
2.6.3 Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut Putra 2007, elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam
atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama elusi.
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase
gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama
suatu analisis kromatografi berlangsung. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang
secara kuat ditahan di dalam kolom.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dan pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat KCKT. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Biofarmasi dan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan, beaker gelas, neraca analitis Baecho, pipet tetes, tabung sentrifugasi, rak tabung, gelas ukur,
alat vortex Health HVM-400, alat sentrifugasi Health HC 1120T, termos es, spuit 1 ml, spuit 3 ml, politube, mikropipet, batang pengaduk, vial 2 ml, satu unit
alat KCKT Agilent 1120 Compact LC, kolom ODS, wadah solven, injektor, syringe 50 µl, pompa vakum Gast DOA-PG04-BN, sonifikator Branson 1510,
kertas membran filter whatman cellulosa nitrate 0,45 µm, penyaring PTFE 0,2 µm, penyaring PTFE 0,5 µm. Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2
Halaman 39.
3.2 Bahan
Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu: asetonitril HPLC Grade E. Merck, NaOH p.a. E. Merck, plasma darah pasien TB, plasma
kontrol gambar dapat dilihat pada Lampiran 3 Halaman 26, Baku Etambutol Hydrochlorida BPOM Jakarta sertifikat analisis dapat dilihat pada Lampiran 14
Universitas Sumatera Utara
Kategori