3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari 2011 sampai dengan Juni 2011. Sampel anemon laut Stichodactyla gigantea diambil disekitar
kawasan Pulau Pramuka, Taman Nasional Kepulauan Seribu TNKS, DKI Jakarta Lampiran 1. Proses preparasi sampel dilakukan di Laboratorium
Karakteristik Bahan Baku. Analisis proksimat kadar air, abu, lemak, protein dan abu tidak larut asam dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Proses ekstraksi, analisis aktivitas antioksidan dan uji fitokimia dilakukan di Pusat
Studi Biofarmaka PSB, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada saat penelitian pendahuluan, pengambilan sampel, uji proksimat, ekstraksi dan evaporasi, uji DPPH, dan uji
komponen fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian
Tahapan Alat
Bahan 1. Pengambilan sampel
Alat snorkling Anemon laut
Palu Pahat
Plastik Cool box
Keranjang plastik 2. Uji Proksimat
Oven n-heksana p.a.
Kapas bebas lemak Akuades
Cawan porselan Kjeltab jenis selenium
Desikator H
2
SO
4
p.a. pekat Tanur pengabuan
H
3
BO
3
asam borat Labu kjehdal
Destilator Kertas saring Whatman 42
Gegep Alumunium foil
Tabel 1 Lanjutan 3. Ekstraksi
Blender Metanol
Gelas ukur Orbital shaker
Kertas saring Whatman 42 Corong kaca
Gelas piala Botol kaca
Sudip Rotar vaccum evaporator
Kapas bebas lemak 4. Uji DPPH
Tabung reaksi Ekstrak metanol anemon
Pipet mikro Etanol
Kapas bebas lemak Kristal DPPH
Elisa reader Vitamin C
Microplate Multipipette
Labu takar 5. Uji Fitokimia
Botol kaca H
2
SO
4
pekat Gelas ukur
Kloroform Kompor listrik
Serbuk magnesium Tabung reaksi
Amil alkohol Pipet
HCl 2N Sudip
Etanol 70 Gegep
Pereaksi Wagner Penangas air
Pereaksi Meyer Pereaksi Dragendroff
FeCl
3
3.3 Metode Penelitian
Rangkaian kegiatan penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi identifikasi dan pengambilan sampel anemon laut, penelitian
pendahuluan dan penelitian utama. Tahap penelitian pendahuluan meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan ukuran
tubuh yang mengandung aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
1,1- diphenyl-2-picrylhydrazil. Tahap penelitian utama berupa analisis kandungan gizi
anemon laut, uji fitokimia, dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan tingkat kesegaran yang berbeda dengan
uji antioksidan metode DPPH.
3.3.1 Identifikasi dan pengambilan sampel
Penelitian diawali dengan pengambilan sampel anemon laut pada tanggal 20 Februari 2011 pukul 16.00 WIB. Sampel anemon laut diambil menggunakan
pahat dan palu dengan cara memahat sekeliling tempat menempelnya agar anemon tidak lepas dari substratnya sehingga anemon tidak merasa terganggu.
Anemon yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam keranjang plastik untuk dibawa ke daratan. Pengambilan sampel anemon laut ini dilakukan pada
kedalaman 0,5 m – 1 m. Ukuran anemon yang diambil dibagi menjadi 3 katagori
yaitu ukuran kecil kurang dari 10 cm, berat 140-160 gram, sedang 10-25 cm, berat 200-315 gram, besar lebih dari 25 cm, berat 500-700 gram. Ukuran ini
merupakan ukuran diameter tubuh dari anemon laut. Tingkat kesegaran anemon dibedakan menjadi 2 jenis yaitu anemon segar dan anemon mati. Anemon segar
memiliki ciri-ciri yaitu tidak adanya mucus yang keluar, keadaan tentakel yang mengembang, warna yang cerah, dan kondisi mesenterial filaments yang normal,
sedangkan anemon mati memiliki ciri-ciri seperti cukup banyaknya sedang keluarnya mucus, keadaan tentakel yang mengembang, warna agak pucat, dan
abnormalnya mesenterial filaments. Spesies anemon laut ini kemudian diidentifikasi dengan melihat penampakan, bentuk tentakel, warna tubuh dan
disesuaikan dengan buku identifikasi yang berjudul Tropical Pasific Invertebrte Collin dan Arnesson 1995.
3.3.2 Penelitian pendahuluan
Tahap penelitian pendahuluan meliputi ekstrak senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan ukuran tubuh anemon laut dengan uji
antioksidan menggunakan metode DPPH. Tujuan yang ingin dicapai adalah menentukan ukuran tubuh terbaik yang menghasilkan ekstrak dengan sifat
antioksidan yang paling tinggi.
3.3.2.1 Ekstraksi senyawa bioaktif Pramadhany 2006
Ekstraksi komponen antioksidan dilakukan dengan menghasilkan ekstrak kasar terlebih dahulu. Komponen antioksidan diperoleh melalui ekstraksi tunggal
dengan menggunakan pelarut metanol. Sampel anemon laut yang berbeda ukuran kecil, sedang dan besar dan tingkat kesegaran segar dan mati, masing-masing
sebanyak 50 gram dihancurkan sampai halus dengan blender kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Pelarut metanol ditambahkan sampai terendam
dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:3 wv. Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil untuk mencegah penguapan dari pelarut. Sampel
dimaserasi dengan menggunakan orbital shaker selama 2 x 24 jam. Hasil larutan maserasi tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman 42 untuk
memisahkan filtrat dan residunya. Filtrat yang didapat dievaporasi pada suhu 37
o
C. Ekstrak kasar yang diperoleh dimasukkan ke dalam botol ekstrak yang akan digunakan untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Salazar-Aranda et al. 2009 dan uji komponen fitokimia secara kualitatif Harborne 1987. Proses esktraksi dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir proses ekstraksi anemon laut
Sumber: Pramadhany 2006 yang dimodifikasi
Ukuran
Penimbangan 50
Maserasi 2x 24 jam dengan metanol 150 ml
Penyaringan
Filtrat Residu
Evaporasi
Ekstrak Anemon laut
Tingkat kesegaran
Pencacahan
Evaporasi Maserasi 2 x 24 jam dengan
metanol 150 ml wv Penimbangan 50 g
Ekstrak kasar
3.3.2.2 Uji
aktivitas antioksidan
dengan metode
DPPH Salazar-Aranda
et al. 2009
Ekstrak kasar anemon laut dari hasil ekstraksi tunggal menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi yang berbeda. Ekstrak kasar
ukuran tubuh kecil dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 4.000, 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5, dan 31,25 ppm. Ekstrak kasar ukuran tubuh besar
dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 800, 600. 400, 200 ppm. Perhitungan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 2.
Larutan DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol 1 mM. Kemudian sampel dan pembanding dipindahkan ke
dalam microplate sebanyak 100 µl menggunakan pipet mikro dan ditambahkan 100 µl DPPH. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit,
kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan Elisa Reader. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi, yang
dihitung dengan rumus sebagai berikut: inhibisi=
absorbansi blanko-absorbansi sampel absorbansi blanko
x 100 Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu
x dan y pada persamaan regresi linier. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a digunakan untuk mencari nilai IC inhibitor concentration,
dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 .
3.3.3 Penelitian utama
Penelitian utama bertujuan untuk mengetahui kandungan gizi dari anemon laut, menentukan tingkat kesegaran terbaik yang dapat menghasilkan ekstrak
dengan sifat antioksidan yang paling tinggi dan mengetahui komponen bioaktif
dari ekstrak terbaik dengan uji fitokimia. 3.3.3.1
Analisis proksimat
Sampel anemon laut basah dihaluskan kemudian dilakukan pengujian proksimat. Analisis proksimat yang dilakukan terhadap anemon laut meliputi uji
kadar air, uji kadar abu, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein menggunakan metode kjeldahl.
1 Analisis kadar air AOAC 2005
Penentuan kadar air didasarkan pada berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan di dalam oven selama ± 30 menit pada
suhu 105
o
C, lalu dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram dimasukkan ke dalam cawan lalu
dikeringkan di dalam oven pada suhu 100-102
o
C selama 6 jam dan kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit dan selanjutnya ditimbang
kembali. Kadar air ditentukan dengan rumus: Kadar air = B - C x 100
B – A
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan anemon laut gram
C = Berat cawan dengan anemon laut setelah dikeringkan gram 2
Analisis kadar abu AOAC 2005 Cawan dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan
suhu 105
o
C, lalu dimasukkan ke dalam desikator dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram ditimbang lalu dimasukkan ke dalam cawan dan
kemudian dibakar di atas kompor listrik diarangkan sampai tidak berasap lagi dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pengabuan 600
o
C ± 6 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin lalu ditimbang. Kadar abu
ditentukan dengan rumus: Kadar abu = Berat abu x 100
Berat sampel 3
Analisis kadar lemak AOAC 2005 Anemon laut seberat 2 gram W
1
diletakkan di atas kapas bebas lemak lalu dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak,
kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat kosongnya W
2
dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut
lemak berupa n-heksana sebanyak 150 ml. Tabung ekstraksi dipasang pada alat
destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 C dengan menggunakan pemanas
listrik dan direfluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan
tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu
105 C, setelah itu labu dimasukkan ke dalam desikator hingga beratnya konstan
lalu ditimbang W
3
. Perhitungan kadar lemak pada anemon laut: Kadar Lemak =
W
3
-W
2
x 100 W
1
Keterangan : W
1
= Berat sampel anemon laut gram W
2
= Berat labu lemak tanpa lemak gram W
3
= Berat labu lemak dengan lemak gram 4
Analisis kadar protein AOAC 1980 Analisis kadar protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan
titrasi. Pengukuran ini dilakukan dengan metode kjeldahl. Sampel anemon laut ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 50 ml,
lalu ditambahkan 7 g K
2
SO
4
kjeltab 0,005 g jenis HgO, 15 ml H
2
SO
4
pekat dan 10 ml H
2
O
2
ditambahkan secara perlahan ke dalam labu dan didiamkan selama 10 menit di ruang asam. Sampel didestruksi pada suhu 410
C selama kurang lebih 2 jam atau sampai cairan berwarna hijau bening. Labu kjeldahl dicuci
dengan aquades 50 hingga 70 ml, kemudian air tersebut dimasukkan ke dalam alat destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 25 ml
asam borat H
3
BO
3
4 yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1 dan methyl red 0,1 dengan perbandingan 2:1. Destilasi dilakukan dengan
menambahkan 50 ml larutan NaOH-Na
2
S
2
O
3
ke dalam alat destilasi hingga tertampung 100-150 ml destilat di dalam erlenmeyer dengan hasil destilat
berwarna hijau. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0.2 N sampai terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya. Volume titran dibaca dan dicatat.
Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : N=
ml HCl-ml blanko ×N HCl×14,007 mg contoh×faktor koreksi alat
×100
Faktor koreksi alat = 2,5
Kadar Protein= N×faktor konversi
Faktor Konversi = 6,25
5 Analisis kadar abu tidak larut asam menurut SNI-01-3836-2000 BSN 2000 Abu bekas pengukuran kadar abu total dilarutkan dengan penambahan
25 ml HCl 10. Larutan tersebut kemudian dipanaskan selama 5 menit dan larutan disaring dengan kertas saring bebas abu. Larutan yang sudah disaring
tersebut kemudian dicuci dengan air suling sampai bebas klorida. Kertas saring lalu dikeringkan dengan oven dan setelah kering kertas saring dimasukkan ke
dalam cawan porselin yang sudah diketahui berat tetapnya. Cawan porselen berisi kertas saring tersebut kemudian dibakar dan diabukan dalam tanur listrik pada
suhu 600 C. Setelah dilakukan pengabuan sampel didinginkan di dalam desikator
dan kemudian ditimbang beratnya. Kadar abu tidak larut asam dengan rumus: Kadar abu tidak larut asam =
Berat abu g Berat sampel awal g
× 100
3.3.3.2 Uji komponen fitokimia Harborne 1987
Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar anemon laut masing-masing perlakuan. Uji fitokimia yang
dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroidtriterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon,dan tanin. Metode uji ini berdasarkan Harborne 1987.
a
Uji alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer,
dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan
endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 gram HgCl
2
dengan 0,50 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml
dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,50 gram iodin dan 2 gram KI
lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,80 gram
bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan
ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,30 volume
campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga. b
Uji steroidtriterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi.
Anhrida asetat ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid
dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c Uji flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume yang sama
dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning
atau jingga pada lapisan amil alkohol. d
Uji fenol hidrokuinon pereaksi FeCl
3
Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5. Hasil uji positif sampel mengandung fenol hidrokuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
e Tanin Sejumlah sampel ditambahkan FeCl
3
kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah pada campuran.
f Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil
selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
3.3.3.3 Uji
aktivitas antioksidan
dengan metode
DPPH Salazar-Aranda
et al. 2009
Uji antioksidan dengan metode DPPH pada penelitian pendahuluan akan menghasilkan satu ekstrak terbaik berdasarkan ukuran tubuh anemon laut. Ekstrak
terbaik tersebut kemudian dimodifikasi dengan diberi perlakuan pada tingkat
kesegaran yang berbeda yaitu kondisi segar dan mati. Ekstrak yang didapat dari tingkat kesegaran yang berbeda tersebut diuji dengan DPPH kembali. Metode
pengujian DPPH yang digunakan sama dengan pengujian pada tahap penelitian pendahuluan. Pembanding yang digunakan adalah vitamin C dengan konsentrasi
2, 4, 6, 8 ppm. Ekstrak yang mempunyai sifat antioksidan terbaik selanjutnya digunakan pada uji fitokimia untuk lebih mengetahui komponen bioaktif yang
terkandung di dalam ekstrak tersebut.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bahan Baku
Karakterisasi bahan baku dilakukan untuk mengetahui sifat dari bahan baku yang digunakan. Anemon laut merupakan salah satu anggota Kelas Anthozoa
yang bentuk tubuhnya bervariasi dengan kombinasi warna yang indah dipandang. Bentuk tubuh anemon seperti bunga sehingga juga disebut mawar laut. Hidupnya
soliter dan tidak mempunyai percabangan dan mempunyai tentakel yang berisi udara. Biasanya di sela-sela tentakel ini merupakan tempat yang ideal bagi ikan-
ikan hias Hadi dan Sumadiyo 1992. Morfologi anemon laut yang diambil dari perairan Pulau Pramuka, Taman Nasional Kepulauan Seribu TNKS, DKI Jakarta
dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Anemon laut yang diambil dari perairan Pulau Pramuka
Anemon laut yang digunakan dalam penelitian ini memiliki tentakel berwarna coklat, tentakel berukuran besar dan pendek, bentuk tubuh menyerupai
karpet, serta melekat pada substrat perairan. Keping mulut bentuknya datar, melingkar, kadang-kadang mengkerut dan dilengkapi dengan tentakel. Lubang
mulut terletak pada daerah yang lunak. Tentakel mengandung nematoksis, jumlahnya barvariasi dan umumnya menutupi oral disk. Jumlah tentakel biasanya
merupakan kelipatan dari enam dan tersusun dalam dua deret lingkaran yang paling dalam. Kelipatan yang dimaksud adalah 6 tentakel pertama paling dalam
dan paling tua, 6 bagian tentakel kedua, 12 bagian tentakel ketiga, 24 bagian tentakel keempat dan seterusnya Collin dan Arnesson 1995.
4.2 Penelitian Pendahuluan