Aktivitas Enzim Amilolitik, Proteolitik, dan Lipolitik

3. Aktivitas Enzim Amilolitik, Proteolitik, dan Lipolitik

Hasil pengukuran aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase yang dihasilkan oleh isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dapat dilihat pada Gambar 8 dan Lampiran 17.

Aktivitas enzim (IU/mL/menit)

Gambar 8. Aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase (IU/mL/menit) yang dihasilkan oleh isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik

Aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase yang dihasilkan (Gambar 8) memperlihatkan nilai yang seiring dengan kemampuan degradasi mikrob. Nilai aktivitas enzim amilase berkisar antara 0,58 dan 0,77 IU/mL/menit. Aktivitas tertinggi ditunjukkan enzim yang dihasilkan oleh isolat A3-a yang diikuti oleh

isolat A2-a, A1-an, A2-an, A4-a, A1-a, dan terendah oleh isolat A3-an. Aktivitas enzim protease berkisar antara 0,44 dan 0,82 IU/mL/menit. Aktivitas tertinggi diperlihatkan oleh isolat P1-an yang diikuti oleh isolat P1-a, P3-a, P5-a, P4-a, dan terendah oleh isolat P2-a. Aktivitas enzim lipase berkisar antara 0,13 dan 0,36

IU/mL/menit dengan aktivitas tertinggi pada enzim yang dihasilkan oleh isolat L1-a yang diikuti oleh isolat L1-an, L2-an, dan terendah L2-a .

Fase Pertumbuhan Mikrob

Hasil pengamatan nilai kerapatan optik (Optical Density = OD) disajikan pada Lampiran 18 dan hasil analisis jumlah koloni (cfu/mL) disajikan pada Lampiran 19. Kurva pertumbuhan yang dihasilkan selama 24 jam periode pengamatan (Gambar 9) memperlihatkan bahwa setiap isolat mempunyai pola yang bevariasi, begitu juga dengan hasil analisis waktu generasi (Tabel 3) juga memperlihatkan hasil yang berbeda.

Fase pertumbuhan awal atau lag (I) pada isolat mikrob amilolitik umumnya terjadi antara 0 dan 2 jam, kecuali pada isolat A1-an (0 sampai 6 jam); fase logaritma atau eksponensial (II) terjadi antara 2 dan 14 jam (A4-a), 2 dan 16 jam (A2-a dan A3-an), 6 dan 16 jam (A1-an), serta antara 2 dan 18 jam (A1-a, A3-a, dan A2-a); fase III adalah fase statis atau tetap tercapai antara 14 dan 18 jam (A4-a), 16 dan 20 jam (A2-a), 16 dan 22 jam (A1-an), 18 dan 20 jam (A3 -an), 18 dan 20 jam (A2-an), serta antara 18 dan 22 jam (A1-a dan A3-a), fase IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 18 jam (A4-a), 20 jam (A2-a, A3-a, dan A2-an), dan 22 jam (A1-an , A1-a, dan A3-a). Pada isolat mikrob proteolitik, fase pertumbuhan awal atau lag (I) tercapai antara 0 dan 2 jam (P2-a, P3-a, dan

P1-an) serta antara 0 dan 4 jam (P1-a, P4-a, dan P5-a); fase logaritma atau eksponensial (II) terjadi antara 2 dan 16 jam (P2-a, P1-an), 2 dan 12 jam (P3-a),

4 dan 16 jam (P4-a, P5-a), serta antara 4 dan 18 jam (P1-a); fase III adalah fase statis atau tetap, pada P1-a dan P1-an tidak ada fase III langsung fase IV, yaitu fase stationer, fase statis mikrob proteolitik yang lain tercapai antara 16 dan 20 jam (P2-a dan P4-a), 12 dan 20 jam (P3-a), serta antara 16 dan 18 jam (P5-a); fase

IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 16 jam (P1-an), 18 jam (P1-a dan P5-a), dan 20 jam (P2-a, P3-a, dan P4-a). Pada isolat mikrob lipolitik, fase pertumbuhan awal atau lag (I) yang tercapai antara 0 dan 2 (L1-a), 0 dan 4 jam (L1-an), serta 0 dan 6 jam (L2-a dan L2-an); fase logaritma atau eksponensial (II) terjadi antara 4 dan 18 jam (L1-a), 6 dan 18 jam (L2-a), 4 dan 14 jam (L1-an), serta antara 6 dan 12 jam (L2-an); fase III adalah fase statis atau tetap tercapai

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL).

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Optical Density (OD)

Jumlah koloni optical density

A2-an

Gambar 9. Kurva pertumbuhan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik

A1-an

A2-an

Jumlah koloni 1.8 optical density optical density Jumlah koloni

0.6 8.0 Optical Density (OD) Optical Density (OD)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

7.5 A3-an A3 -a n 0.4 7.5 P1-a P1 -a

Periode pengamatan (jam) Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni

optical density

Jumlah koloni 10.5 1.8 optical density

9.0 I II III IV 1.0 10.0 I II III

0.6 Optical Density (OD)

9.5 0.8 Optical Density (OD)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 8.0

0.4 Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

P2-a P2 -a

7.0 0.0 8.5 P3-a

Periode pengamatan (jam) Periode pengamatan (jam)

12.0 2.6 12.0 Jumlah koloni 2.0 optical density

2.4 Jumlah koloni optical density

9.5 0.8 Optical Density (OD)

9.5 0.6 Optical Density (OD)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

0.6 Jumlah koloni (log10 cfu/mL)

9.0 P4-a P4 -a

0.4 9.0 P5-a P5 -a

Periode pengamatan (jam)

Periode pengamatan (jam)

Gambar 9. (lanjutan)

11.0 Jumlah koloni

2.4 Jumlah koloni

optical density

optical density

0.8 Optical Density (OD)

0.8 Optical Density (OD)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 8.0 0.6 Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 9.0 0.6

P1-an P1 -a n

0.4 7.5 L1-a 8.5 L1 -a

Periode pengamatan (jam) Periode pengamatan (jam)

Jumlah koloni

Jumlah koloni

optical density

1.6 10.5 optical density

0.6 Optical Density (OD) 7.5 0.6 Optical Density (OD) Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 8.0 0.4 Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 7.0 0.4

L2-a L2 -a

L1-an L1 -a n

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Periode pengamatan (jam)

10.5 Jumlah koloni optical density

7.5 0.6 Optical Density (OD)

Jumlah koloni (log10 cfu/mL) 7.0 L2-an

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan (jam)

Gambar 9. (lanjutan)

(L1-an), serta antara 12 dan 18 jam (L2-an); fase IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 20 jam (L1-a dan L2-a), sedangkan pada L1-an dan L2- an setelah 18 jam (Gambar 9).

Waktu generasi atau waktu yang diperlukan mikrob untuk membelah menjadi 2 sel baru, pada isolat mikrob amilolitik berkisar antara 23,62 dan 45,44 menit. Waktu generasi terpendek ditunjukkan oleh isolat A3-a dan tertinggi oleh isolat A4-a. Pada isolat mikrob proteolitik, waktu generasi berkisar antara 22,93 dan 37,85 menit. Waktu generasi terendah ditunjukkan oleh isolat P3-a dan tertinggi oleh isolat P5-a. Waktu generasi isolat mikrob lipolitik berkisar antara 32,38 dan 46,35 menit. Waktu generasi terendah diperlihatkan oleh isolat L2-a dan tertinggi oleh isolat L1-an (Tabel 3).

Tabel 3. Waktu generasi mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik Isolat

Waktu generasi (menit) Aerob

Waktu generasi (menit)

Isolat

Anaerob

27,16 A2-a

A1-a

A1-an

31,40 A3-a

A2-an

39,89 A4-a

A3-an

36,35 P1-a

P1-an

- P2-a

P2-an

46,35 P3-a

L1-an

33,52 P4-a

L2-an

Keterangan: A = Mikrob amilolitik P = Mikrob proteolitik L = Mikrob lipolitik

Aktivitas Antagonistik atau Konfrontasi terhadap Mikrob Patogen

Salah satu kriteria yang diinginkan pada isolat yang terpilih sebagai kandidat probiotik adalah bahwa mikrob tersebut mampu menghasilkan antimikrob sehingga mampu menekan pertumbuhan mikrob patogen dalam saluran pencernaan ikan. Hasil pengamatan aktivitas antagonistik terhadap mikrob patogen pada ikan, yaitu dari strain Aeromonas hydrophila, Escherichia coli dan Vibrio harveyi (Tabel 4) menunjukkan bahwa dari 17 isolat yang diuji Salah satu kriteria yang diinginkan pada isolat yang terpilih sebagai kandidat probiotik adalah bahwa mikrob tersebut mampu menghasilkan antimikrob sehingga mampu menekan pertumbuhan mikrob patogen dalam saluran pencernaan ikan. Hasil pengamatan aktivitas antagonistik terhadap mikrob patogen pada ikan, yaitu dari strain Aeromonas hydrophila, Escherichia coli dan Vibrio harveyi (Tabel 4) menunjukkan bahwa dari 17 isolat yang diuji

A1-an, dan A2-an), 2 isolat dari mikrob proteolitik (P2-a dan P1-an) , dan tidak ditemukan aktivitas antagonistik pada isolat mikrob lipolitik. Isolat A4-a memperlihatkan zona penghambatan pada semua mikrob patogen uji, isolat A1-an hanya memperlihatkan zona penghambatan pada Escherichia coli, dan isolat A2-an hanya memperlihatkan zona penghambatan pada Vibrio harveyi. Zona penghambatan isolat P2-a hanya pada Escherichia coli, dan isolat P1-an memperlihatkan zona penghambatan pada 2 jenis mikrob patogen uji yaitu Escherichia coli dan Vibrio harveyi.

Tabel 4. Aktivitas antagonistik atau konfrontasi isolat mikrob amilolitik,

proteolitik, dan lipolitik terhadap mikrob patogen pada ikan Isolat Aeromonas hydrophila

Vibrio harveyi K

Escherichia coli

D D Aerob A1-a

- A2-a

- A3-a

- A4-a

10 mm 8 mm P1-a

12 mm 10 mm +

10 mm 11 mm +

- P2-a

- P3-a

12 mm 9 mm

- P4-a

- P5-a

- L1-a

- L2-a

Anaerob A1-an

- A2-an

8 mm 8 mm

12 mm 11 mm A3-an

- P1-an

16 mm 10 mm P2-an

8 mm 9 mm

- L1-an

- L2-an

- Keterangan: A = Mikrob amilolitik K = Kriteria + Ada aktivitas antagonistik P = Mikrob proteolitik

- Tidak ada aktivitas L = Lipolitik

antagonistik

D = Diameter

Vh*A2an

Gambar 10. Aktivitas antagonistik mikrob uji terhadap mikrob patogen bagi ikan (Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, dan Vibrio harveyi)

Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu

Ketahanan isolat terhadap asam lambung dan garam empedu direfleksikan dengan kemampuannya bertahan dalam media asam dan basa, yang dinyatakan dalam penurunan log jumlah isolat dalam media kontrol dan perlakuan selama periode pengamatan. Hasil pengujian ketahanan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik terhadap asam lambung dan garam empedu disajikan pada Lampiran 20. Selisih log jumlah isolat kontrol dan perlakuan setiap periode pengamatan disajikan pada Gambar 11.

Kemampuan setiap isolat di dalam media pada pH asam dan pH basa bervariasi. Sampai jam ke-8, secara umum semua isolat masih hidup, walaupun tingkat pertumbuhan pada umumnya lebih rendah dari kontrol (Gambar 11). Penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 periode pengamatan 2 jam ditunjukkan oleh isolat A1-a dan A4-a, diikuti oleh isolat A2-a, A1-an, A2-an, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat A3-a, sedangkan isolat A3-an dengan populasi lebih tinggi dari kontrol. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi mikrob diperlihatkan oleh isolat P1- an, diikuti oleh isolat P5-a, P4-a, P3-a, P2-a, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat P1-a . Pada isolat mikrob lipolitik penurunan log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L2-a, L1-an, L2-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L1-a.

Pada periode pengamatan 4 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 ditunjukkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A3-an, A3-a, A1-an, A2-an, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi mikrob diperlihatkan oleh isolat P5-a, yang diikuti oleh isolat P4-a, P1-a, P3-a, P1-an, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat P2-a . Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan

log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L2-an . Pada periode pengamatan 6 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A3an , A3-a, A1-an, A2-an, dan tertinggi ditunjukkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat diperlihatkan log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L2-an . Pada periode pengamatan 6 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A3an , A3-a, A1-an, A2-an, dan tertinggi ditunjukkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat diperlihatkan

mikrob terkecil diperlihatkan oleh isolat L2-a, L2-an, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L1-a.

Gambar 11. Selisih log (cfu/mL) antara jumlah isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dalam media dengan pH 2,5 dan pH 7,5 dengan kontrol setiap periode pengamatan

Pada periode pengamatan 8 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A2-an, A1-an, A3-a, A3-an dan tertinggi oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P1-a, yang diikuti oleh isolat P3-a, P5-a, P4-a, P1-an, dan terbesar Pada periode pengamatan 8 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A2-an, A1-an, A3-a, A3-an dan tertinggi oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P1-a, yang diikuti oleh isolat P3-a, P5-a, P4-a, P1-an, dan terbesar

L1-an dan terbesar ditunjukkan oleh isolat L1-a, adapun populasi isolat L2-an lebih besar dari kontrol. Pada periode pengamatan 4 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 ditunjukkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A4-a, A3-an, A3-a, A2-an, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P4-a, yang diikuti oleh isolat P5-a, P1-a, P2-a,

P3-an, dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P1-an. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a,

L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L2-an.

Pada periode pengamatan 6 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 diperlihatkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A2-a, A3-an, A3-a, A4-a, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P4-a, yang diikuti oleh isolat P3-a, P2-a, P1-a, dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P5-a dan P1-an. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-an,

dan terbesar oleh isolat L1-an, sedangkan isolat L2-a mempunyai log populasi isolat yang sama dengan kontrol. Pada periode pengamatan 8 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 diperlihatkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A4-a, A2-an, A3-an, A2-a dan tertinggi ditunjukkan oleh isolat A3-a.

Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P3-a, yang diikuti oleh isolat P4-a, P2-a, P1-a, P1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P5-a. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log

populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L2-an dan terbesar oleh isolat L1-an.

Uji Penempelan

Uji penempelan atau adhesi isolat mikrob didasarkan pada kemampuan mikrob membentuk biofilm, mikrob yang mampu membentuk biofilm dengan baik akan memiliki kemampuan menempel dengan baik pula. Hal ini diujikan sebagai pendekatan terhadap kemampuan menempel isolat pada substrat padat (usus). Hasil uji penempelan pada lempeng stainless steel isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng (Tabel 5 dan Lampiran 21) menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi mikrob planktonik maka populasi mikrob yang menempel semakin rendah.

Tabel 5. Hasil uji penempelan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik pada lempeng stainless steel

Populasi mikrob Populasi mikrob Isolat

Isolat

Swab Planktonik Aerob

4 10 5 A1-a 9 8,9 x 10 7,6 x 10 A1-an 7,1 x 10 8,1 x 10

4 11 4 A2-a 11 4,5 x 10 4.7 x 10 A2-an 5,0 x 10 4,2 x 10

5 8 4 A3-a 10 7,1 x 10 5,4 x 10 A3-an 8,4 x 10 9,3 x 10

4 12 5 A4-a 10 1,8 x 10 1,4 x 10 P1-an 1,6 x 10 2,8 x 10

5 P1-a 9 6,2 x 10 9,5 x 10 P2-an

4 10 5 P2-a 9 6,7 x 10 4,2 x 10 L1-an 8,5 x 10 8,5 x 10

4 11 5 P3-a 10 7,2 x 10 1,2 x 10 L2-an 1,3 x 10 2,0 x 10 P4-a

4,2 x 10 7,9 x 10

P5-a 11 4 8,2 x 10

3,5 x 10

4 L1-a 11 5,7 x 10 4,0 x 10 L2-a 10 5

2,2 x 10 3,8 x 10 Keterangan: A = Mikrob amilolitik Populasi mikrob: Swab 2 = cfu/cm

P = Mikrob proteolitik Planktonik = cfu/mL L = Mikrob lipolitik

Rekapitulasi

Rekapitulasi hasil pengujian parameter seleksi isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik hasil isolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng disajikan pada Tabel 6.

Tabel 6. Rekapitulasi data hasil pengujian beberapa parameter yang digunakan pada seleksi isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik saluran pencernaan ikan bandeng yang potensial sebagai kandidat probiotik

Parameter

Isolat

AG pH T Aerob A1-a 10 + 14 1649,24 0,66 8,4 x 10 -