3. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai Oktober 2007,
bertempat di Laboratorium Organoleptik Hasil Perikanan, Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium
Mutu dan Keamanan Pangan II, SEAFAST CENTER; Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor di Taman Kencana, Bogor; serta Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Pascapanen Pertanian di Cimanggu, Bogor. 3.2. Bahan dan Alat
Bahan baku utama yang digunakan adalah 10 spesies ikan laut dalam, yaitu Antigonia capros
, Antigonia rubicunda, Caelorinchus smithi, Coryphaenoides sp., Diretmoides pauciradiatus
, Diretmoides veriginae, Lamprogrammus niger, Neoscopelus microchir
, Setarches guentheri, dan Zenopsis conchifer yang diperoleh dari Balai Riset Perikanan Laut BRPL di Muara Baru, Jakarta Utara.
Ikan laut dalam ditangkap pihak BRPL di perairan barat Sumatera dan selatan Jawa dari bulan Mei-Juli 2005 menggunakan trawl dasar laut dalam Rough
Bottom trawl .
Bahan lainnya yang diperlukan adalah es batu, bahan untuk ekstraksi, bahan untuk analisis steroid, dan bahan untuk analisis taurin. Bahan untuk ekstraksi
terdiri dari pelarut kloroform, etil asetat, metanol; bahan kimia untuk analisis steroid, yaitu sterol standar SIGMA, testosteron standar SIGMA, kloroform,
asam asetat anhidrat CH
3
CO
2
O, H
2
SO
4
pekat, air, dan Na
2
SO
4
anhidrat; dan bahan kimia untuk analisis taurin terdiri dari taurin standar SIGMA, HCl 6 N,
metanol, pikoiotisianat C
6
H
5
CH
2
CH
2
NCS, trietilamin,
Na-asetat, asetonitril 60 , dan buffer fosfat 0,1 M.
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah cool box, freezer, timbangan analitik Precisa tipe XT 120A, timbangan digital Hitachi, mortar,
blender Toshiba, shaker HT, evaporator vacum Ogawa Seiki CO, Freeze
dryer Labconco, kain blacu, kertas saring, erlenmeyer, gelas ukur, gelas kimia,
corong, sudip, pipet, High Performance Liquid Chromatography HPLC
Water 2487 Dual λ Absorbance Detector dan Fourier Transform Infra Red
FT-IR Tensor 37 Bruker. 3.3. Metode Penelitian
Metode penelitian ini meliputi 3 tahap, yaitu 1 preparasi sampel merupakan persiapan dan penanganan sampel sebelum dilakukan pengujian
meliputi pengukuran panjang dan berat total ikan serta penentuan rendemen daging beserta kulit ikan laut dalam; 2 uji steroid meliputi ekstraksi senyawa
bioaktif dalam daging beserta kulit ikan laut dalam, analisis kimia steroid Uji Liebermann-Burchard
, analisis steroid dengan HPLC, dan analisis steroid dengan FT-IR; 3 uji taurin dengan HPLC.
3.3.1. Preparasi Sampel Ikan laut dalam yang ditangkap pihak BRPL sebelumnya telah dibersihkan
dan disimpan pada ruang pendingin dengan sistem Air blast freezer dalam kapal pada suhu -40 ºC. Kemudian ikan dibawa ke BRPL dan disimpan dalam freezer
pada suhu -20 ºC. Ikan dari BRPL dibawa ke IPB dengan coolbox dan kemudian disimpan dalam freezer bersuhu -10 ºC sampai -18 ºC di Laboratorium Bahan
Baku Perikanan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Sebelum dilakukan penelitian, sampel ikan laut dalam dipreparasi
dengan cara ikan dikeluarkan dari freezer dan dithawing terlebih dahulu dalam air karena ikan dalam keadaan beku. Proses thawing dilakukan dengan tujuan untuk
memudahkan pemisahan jenis ikan yang satu dengan yang lainnya dan agar tekstur daging ikan tidak mengeras karena pembekuan, serta tekstur daging
kembali seperti semula sebelum ikan dibekukan. Pada saat thawing diusahakan ikan yang masih terbungkus dalam plastik tidak dibuka sehingga air tidak masuk
dalam jaringan daging ikan. Masing-masing ikan diukur panjang total, lebar dan berat total tubuhnya. Selanjutnya ikan difillet bagian daging beserta kulitnya,
sedangkan rangka kepala, rangka tubuh dan rangka ekor serta jeroan dipisahkan, dibungkus dalam plastik, dan dimasukkan kembali dalam freezer.
Gambar 8. Diagram alir penelitian
Thawing Preparasi sampel
Uji taurin Uji steroid
Analisis HPLC Ekstraksi bahan aktif
Analisis Kualitatif Sampel ikan laut dalam yang
masih beku
uji Liebermann-Burchard Analisis Kuantitatif
Analisis HPLC Spesies ikan laut dalam yang
mengandung steroid
Uji penguatan struktur steroid dengan analisis infrared IR Pemfilletan
Daging dan kulit ikan laut dalam
Ekstrak komponen bioaktif Daging dan kulit ikan
3.3.1.1. Pengukuran panjang total dan lebar ikan Pengukuran panjang total dan lebar ikan laut dalam digunakan untuk
melihat ukuran dari ikan yang diteliti. Panjang total dan lebar diukur dengan menggunakan penggaris.
3.3.1.2. Perhitungan rendemen daging beserta kulit ikan Perhitungan rendemen dilakukan untuk mengetahui persentase bagian dari
ikan yang dapat dimanfaatkan. Ikan laut dalam diukur berat total tubuhnya menggunakan timbangan begitu juga dengan daging beserta kulit ikan yang sudah
difillet. Bagian daging beserta kulit tersebut kemudian dibagi dengan berat total tubuh ikan dikalikan dengan 100 sehingga akan diperoleh rendemen daging
beserta kulit ikan laut dalam. Daging yang sudah difillet kemudian dianalisis steroid dan taurinnya. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 8.
3.3.2. Uji Steroid Pengujian steroid ini meliputi ekstraksi senyawa bioaktif Quinn 1988
diacu dalam Fanany 2005 yang dimodifikasi, analisis kimia steroid Cook 1958, analisis steroid dengan HPLC AOAC 1997 dan analisis steroid dengan Infrared
IR Nur dan Adijuwana 1989. 3.3.2.1. Ekstraksi senyawa bioaktif Quinn 1988 diacu dalam Fanany 2005 yang
dimodifikasi Daging ikan laut dalam dihomogenisasi lalu ditimbang. Hancuran ikan
dilarutkan dalam pelarut kloroform dengan perbandingan sampel dan kloroform 1:2, kemudian dimaserasi menggunakan shaker selama 24 jam untuk memastikan
senyawa bioaktif yang terkandung dalam ikan terlarut dalam pelarut. Ekstrak yang dihasilkan disaring dua kali, yaitu dengan kain blacu lalu dengan kertas
saring. Ampas hasil penyaringan dimaserasi lagi dengan cara yang sama seperti pada maserasi pertama kemudian disaring kembali. Filtrat yang dihasilkan dari
keduanya dikumpulkan sehingga diperoleh filtrat kloroform. Selanjutnya ampas dilarutkan dalam pelarut etil asetat dengan perbandingan sampel dan etil asetat 1:2
dan dilakukan maserasi pertama selama 24 jam, disaring dan dilanjutkan maserasi kedua dengan cara yang sama dengan maserasi pertama kemudian disaring.
Filtrat yang dihasilkan dari keduanya dikumpulkan sehingga diperoleh filtrat etil asetat. Kemudian ampas hasil penyaringan dilarutkan dalam pelarut metanol
dengan perbandingan yang sama kemudian dimaserasi dengan cara yang sama sehingga diperoleh filtrat metanol.
Ketiga filtrat yang dihasilkan dari masing-masing pelarut kloroform untuk pelarut non polar, etil asetat untuk pelarut semi polar dan metanol untuk pelarut
polar kemudian dievaporasi dengan evaporator vacum pada suhu 30 °C berkecepatan 200 rpm sehingga diperoleh hasil akhir berupa ekstrak daging
beserta kulit dengan pelarut kloroform, ekstrak daging beserta kulit dengan pelarut etil asetat, dan ekstrak daging beserta kulit dengan pelarut metanol.
Ekstrak ini digunakan untuk uji kimia. Diagram alir keseluruhan proses ekstraksi ikan laut dalam disajikan pada Gambar 9.
3.3.2.2. Analisis kualitatif steroid Cook 1958 Analisis kimia steroid digunakan untuk mengidentifikasi adanya senyawa
steroid dalam sampel secara kualitatif. Uji kualitatif senyawa steroid ini menggunakan uji Liebermann-Burchard. Sampel yang digunakan pada penelitian
ini berupa ekstrak daging ikan laut dalam dengan pelarut kloroform, etil asetat, dan metanol.
Ekstrak sebanyak 100 µl dimasukkan dalam botol berukuran 4 ml dan ditambah 0,5 ml kloroform CHCl
3
. Kemudian ditambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat CH
3
CO
2
O dan satu tetes asam sulfat H
2
SO
4
pekat sambil diaduk-aduk. Timbulnya warna hijau menunjukkan bahwa ekstrak
tersebut diduga mengandung steroid. Untuk
mengetahui konsentrasi
steroid, dilakukan
ujji dengan
High Performance Liquid Chromatography HPLC menggunakan pembanding
standar steroid. 3.3.2.3. Analisis steroid dengan HPLC AOAC 1997
Sampel yang digunakan pada analisis steroid dengan HPLC, yaitu daging dari jenis ikan laut dalam yang diduga positif mangandung senyawa steroid
berdasarkan uji Liebermann-Burchard. Analisis HPLC digunakan untuk
mengetahui kadar senyawa steroid dalam sampel. Analisis HPLC bertujuan untuk
mengetahui jumlah komponen atau senyawa dalam sampel.
Gambar 9. Diagram alir proses ekstraksi metode Quinn 1988 diacu dalam Fanany 2005 yang dimodifikasi.
Maserasi selama 1x24 jam Penyaringan
Ampas filtrat
Ditambah etil asetat Evaporasi
Maserasi selama 1x24 jam Ekstrak pelarut kloroform
Penyaringan Ampas
filtrat Evaporasi
Ekstrak pelarut etil asetat Ditambah metanol
Maserasi selama 1x24 jam Penyaringan
Ampas filtrat
Evaporasi Ekstrak pelarut metanol
2 kali ekstraksi 2 kali ekstraksi
2 kali ekstraksi Ditambah kloroform
Sampel ikan laut dalam
Sebelum digunakan alat HPLC distabilkan dan kolomnya dialirkan terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Setelah itu persiapan
sampel sebelum diinjeksikan pada HPLC sebagai berikut: sampel berupa daging dihomogenisasi dan ditimbang sebanyak 0,5-2 g kemudian dimasukkan ke tabung
reaksi tertutup dan ditambahkan 10 ml air serta 25 ml CHCl
3.
Sampel dikocok selama 5 menit dalam suhu ruang, lalu sampel disaring dengan kertas saring serta
ditambahkan 30 g Na
2
SO
4
anhidrat. Selanjutnya ditambah 25 ml CHCl
3
dan disaring kembali. Sampel dievaporasi dengan Freeze dryer sampai kering.
Sampel ditambahkan dengan 10 ml fase gerak lalu diinjeksikan ke HPLC. Histogram HPLC steroid golongan sterol dapat dilihat pada Lampiran 5 dan
contoh perhitungan kadar sterol pada Lampiran 8. Untuk perhitungan kadar steroid golongan testosteron dapat dilihat pada Lampiran 6 dan contoh
perhitungan kadar taurin dapat dilihat pada Lampiran 9. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis steroid :
Temperatur :
27
o
C suhu ruang Jenis kolom
: Bondafac C-18 column Kecepatan alir eluen : 1 ml menit
Tekanan : 3000 psi
Fase gerak : CHCl
3
kloroform Detektor :
UV-Vis Panjang gelombang : 380 nm
Derivatisasi :
Pre-column derivatization Tipe injeksi
: On column injection tanpa septum Program :
isokratik Perhitungan kadar steroid dalam 1g daging ikan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan : V akhir = Volume akhir 10 ml [std] = Konsentrasi standar sterol 5 ppm dan
standar testosteron 25 ppm Kadar steroid ppm =
[ ]
sampel bobot
akhir V
x std
x standar
area luas
contoh area
luas
3.3.2.4. Analisis steroid dengan FT-IR Nur dan Adijuwana 1989 Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa ekstrak daging ikan laut
dalam yang diduga positif mengandung senyawa steroid, yaitu ekstrak daging dengan pelarut metanol. Preparasi sampel berbentuk cairan, yaitu menempatkan
sampel dalam sel sampel tersebut sebagai film atau lapisan tipis diantara dua keping NaCl sel IR. Kepingan NaCl murni yang harus transparan resisten
terhadap radiasi infra merah. Sel IR kemudian diletakkan pada FT-IR Tensor 37 yang dilengkapi perangkat lunak OPUS versi 4.2 yang digunakan untuk
mengontrol kerja spektrometer pada kisaran bilangan gelombang 4000-400 cm
-1
. Spektrum yang dihasilkan lalu disimpan dalam format OPUS. Hasil spektrum
berupa grafik FT-IR. 3.3.3 Uji Taurin AACC 1994
Taurin merupakan salah satu jenis asam amino nonesensial yang mengandung gugus sulfur. Kandungan taurin ditentukan dengan menggunakan
High Performance Liquid Chromatography HPLC. Sebelum digunakan, kolom
HPLC harus dibilas dahulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan
aquades. Dalam analisis taurin dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu pembuatan hidrolisat protein, pengeringan, tahap derivatisasi dan injeksi,
serta analisis taurin. 1 Pembuatan Hidrolisat Protein
Pada preparasi sampel, yaitu tahap pembuatan hidrolisat protein, diambil sampel daging sebanyak 0,2-0,5 g dan dihancurkan. Kemudian sampel
ditambahkan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml dan dipanaskan dalam oven pada suhu 100 °C selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara
yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan. Selain itu, pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah
pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan menggunakan millipore berukuran 45 mikron.
2 Pengeringan Hasil saringan diambil sebanyak 30 µl dan ditambahkan dengan 30 µl
larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara larutan
metanol, pikoiotisianat
dan trietilamin
dengan perbandingan
3:3:4 300 ml: 300 ml: 400 ml, kemudian dikeringkan menggunakan gas nitrogen N
2
, tujuannya adalah untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi.
3 Derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan.
Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara metanol, Na-Asetat dan trietilamin dengan perbandingan 2:2:1 200 ml:200 ml:100 ml. Proses
derivatisasi dilakukan agar masing-masing komponen terpisah secara homogen sehingga detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel.
Selanjutnya dilakukan
pengenceran dengan
cara menambahkan
1 ml asetonitril 60 atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali dengan kertas saring millipore 45.
4 Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 20 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC.
Untuk penghitungan konsentrasi taurin yang ada pada bahan, dilakukan pembuatan kurva standar dengan menggunakan taurin yang telah siap pakai yang
mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Histogram HPLC standar dan sampel taurin dapat dilihat pada Lampiran 7 dan contoh perhitungan kandungan
taurin dapat dilihat pada Lampiran 10. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis taurin :
Temperatur : 27 °C Suhu ruang
Jenis Kolom : Pico tag amino acid 3,9 x 150 nm column
Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan
: 3000 psi Fase gerak
: Asetonitril 60 Buffer Fosfat 0,1 M
Detektor : UV
Panjang gelombang : 272 nm Derivatisasi
: Pre-column derivatization
Tipe injeksi : On column injection tanpa septum
Program : Gradien menggunakan dua pompa
Perhitungan kadar taurin dalam 100 g daging ikan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan: C = Konsentrasi standar taurin 2,5 µmolml FP = Faktor pengenceran 1 ml
BM = Bobot molekul taurin 181,1 µgµmol Kadar taurin mg100 g =
g sampel
bobot 100
x BM
x FP
x C
x standar
area luas
sampel area
luas μ
4. HASIL DAN PEMBAHASAN