3 memiliki homologi nukleotida yang sangat besar dengan vvIBD strain
Belanda, yaitu : D6948.Isolat lokal Indonesia juga telah diisolasi oleh Suwarno 2005 di beberapa daerah di Jawa timur, yaitu Lamongan dan
Kediri. Berbagai temuan vvIBD dan berkembangnya berbagai jenis vaksin di
pasaran menyebabkan evaluasi terhadap beberapa vaksin yang ada di Indonesia menjadi penting. Telah ditemukan beberapa virus tantangyang ada
di Indonesia oleh Rudd etal. 2002. Deteksi atau diagnosa IBD yang tepat dirasakan semakin penting karena akan mejadi pedoman program
pengendalian penyakit tiap-tiap peternakan. Metode histopatologi dengan pewarnaan HE merupakan metode rutin
yang telah lama digunakan di Indonesia.Disamping itu peneguhan atau pelengkap diagnosa juga telah lama dilakukan dengan menguji tingkat
kekebalan dengan mengukur titer antibodi ayam.Metode diagnosa IBD dengan menemukan langsung antigen virus dari jaringan antara lain
dilakukan dengan teknik imunohistokimia, atau mendeteksi RNA virus dengan metode PCR Polymerase Chain Reaction. Metode diagnosa inilah
yang penting untuk dievaluasi dan dikembangkan untuk identifikasi virus penyebab penyakit IBD.
Perumusan masalah
Dengan latar belakang tersebut maka berikut ini secara garis besar diambil
perumusan masalah, yaitu: 1.
Penyakit IBD telah tersebar di semua benua, walaupun ada beberapa
tingkat patogenisitasnya. Hal ini berkaitan dengan berbagai strain virus
yang menginfeksi wilayah tersebut. 2.
Upaya pengendalian infeksi pada suatu peternakan telah banyak dilakukan, antara lain dengan berbagai program vaksinasi.
3. Berbagai program vaksinasi perlu dievaluasi, karena wabah penyakit IBD
masih sering terjadi walaupun telah dilakukan vaksinasi.
4
Tujuan Penelitian
Untuk diagnosa rutin IBD biasanya dilakukan dengan histopatologi pewarnaan HE pada bursa Fabricius dan diagnosa serologi dengan
ELISA.Pada penelitian kali ini dirumuskan beberapa tujuan penelitian. Tujuan penelitian ini adalah :
1. Melakukan kajian dan evaluasi vaksinasi IBD pada broiler dengan metode ELISA untuk mempelajari antibodi hasil
vaksinasi. 2. Melakukan kajian dan evaluasi vaksinasi IBD pada broiler
dengan metode imunohistokimia untuk mengetahui keberadaan antigen pada jaringan.
3. Membandingkan respon vaksinasi dan infeksi IBD pada bursaFabricius.
TINJAUAN PUSTAKA
PenyakitInfectious Bursal Disease IBD
Infectious Bursal Disease IBD merupakan penyakit yang menyerang
ayam muda, baik broiler ataupun layer.Organ yang menjadi target adalah bursa Fabricius, yaitu organ sistem imun pada ayam muda. Sistem imun pada ayam
muda jika terkena penyakit ini akan menyebabkan menurunnya sistem pertahanan tubuh, lebih peka terhadap patogen, respon buruk terhadap vaksinasi dan kadang
menyebabkan mortalitas. Kejadian penyakit IBD telah tersebar di seluruh dunia dan menyerang
pada industri peternakan ayam.Pada tahun 1962 penyakit ini muncul dan disebut sebagai penyakit Gumboro, sesuai dengan lokasi geografik penyebaran penyakit,
yakni di area Gumboro, Amerika Serikat Muller et al. 2003. Pada tahun 1986 di Eropa telah terjadi serangan penyakit IBD yang sangat
ganas. Para ahli menamakan penyakit ini sebagai IBD strain “very virulent” vvIBD, dimana menyebabkan kematian 70 pullet. Lesi penyakit ini sangat
tipikal dengan IBD klasik.Setelah itu, penyakit IBD banyak diobservasi di Asia, Afrika dan di Amerika Selatan Muller et al. 2003. Di Indonesia, sejak tahun
1991 penyakit IBD telah mewabah di berbagai daerah, terutama daerah yang mempunyai populasi ayam tinggi serta skala usaha besar Tabbu, 2000.
Kerugian besar pada industri yang disebabkan oleh penyakit IBD ini adalah adanya efek imunosupresif.Efek ini menyebabkan ayam lebih peka
terhadap berbagai penyakit serta menurunnya kemampuan ayam dalam merespon vaksin Muller et al. 2003 dan Tabbu, 2000.
Butcher dan Miles 2009 menambahkan bahwa adanya penyakit IBD pada sebuah peternakan bisa menjadi infeksi berulang minimal selama 4 bulan.
Sekali saja sebuah kandang terkontaminasi virus IBD maka penyakit IBD akan
cenderung menyebar dan menjadi resisten pada area flok tersebut.
6
Virus Infectious Bursal Disease IBD
Virus IBD yang termasuk pada genus Avibirnavirus dan family Birnaviridae
.Virus ini mempunyai 2 segmen genom, yaitu A dan B. Virus IBD mempunyai ukuran antara 55
– 65 nm.Virus berbentuk icosahedral dan tidak mempunyai envelope.Genom virus terdiri dari 2 segmen double stranded RNA.
Virus tersusun atas 4 protein struktur, dimana VP2 dan VP3 merupakan protein sruktur dan komponen antigen dari kapsid virus Mintaet al. 2005. Sementara itu
Minta et al.2005 dan Saif 2003 menuliskan adanya 5 protein virus, yaitu VP1, VP2, VP3, VP4 dan VP5, dengan berat molekul masing-masing 90 KD, 41 KD,
32 KD, 28 KD dan 21 KD. Asam amino VP2 yang berada pada posisi 206 sampai 353 sangat penting
sebagai neutralizing antigenic site.Bagian ini dinamakan sebagai VP2-variable domain
atau vVP2, dimana sebagian besar asam amino akanberbeda diantara virus IBD yang berbeda antigenesitasnya Minta et al. 2005.Beberapa peneliti
melaporkan bahwa antigen utama yang mempunyai efek perlindungan adalah VP2Tabbu, 2000.
Sebagaimana umumnya sifat virus tanpa envelope, virus IBD sangat stabil dalam kondisi fisik dan kimiawi, antara lain resisten terhadap eter dan kloroform,
dapat diinaktivasi pada pH 12, masih tetap aktif pada suhu 56 C selama 5 jam dan akan mati pada suhu 70 selama 30 menit. Virus IBD juga peka terhadap
pelarut organik dan juga peka terhadap formalin dan kelompok iodofor.Sehubungan dengan ketahanan virus IBD terhadap pengaruh lingkungan
dan bahan kimiawi maka virus ini dapat bertahan dalam kandang ayam dan lingkungan dalam periode yang lama walaupun telah dilakukan sanitasi
desinfeksi Tabbu, 2000. Virus IBD diklasifikasikan menjadi 2 serotipe, yaitu serotipe 1 dan
serotipe 2.Kedua serotipe ini bisa dibedakan dengan virus-neutralization test VN, tetapi tidak bisa dibedakan dengan Enzim Linked Immunosorbent Assay
ELISA.Isolat serotipe 2 bisa didapatkan pada ayam dan kalkun Saif, 2003.Serotipe 1 bisa diperoleh dari ayam, bebek dan kalkun Tabbu, 2000.
7
Gambar 1
Gambar skematis virus IBD yang berbentuk icosahedral Segal, 2009
Virus IBD juga dikelompokkan berdasarkan virulensinya.Serotipe 1 menurut virulensinya dibagi menjadi 3, yaitu klasik, varian dan sangat virulen
very virulent IBDvvIBD.Virus IBD klasik pertama kali diisolasi sebagai “infectious Bursal agent” oleh Winterfield dan Hitchnerdan diidentifikasi sebagai
penyebab penyakit IBD.
Virus IBD strain varian telah dilaporkan oleh Allan pada tahun 1972, dimana infeksi virus IBD pada umur muda menyebabkan imunosupresi. Strain
varian ini tetap meletup pada ayam yang memiliki antibodi maternalpada level proteksi untuk strain IBD yang standar.Strain Eropa yang termasuk strain klasik
yaitu Faragher 5270 F5270 , sedangkan di Amerika Serikat yang termasuk strain klasik yaitu IBD strain STC Rudd et al. 2002
Virus IBD yang sangat virulen atau biasa disebut vvIBD mulai diisolasi pada akhir 1980an di Netherland. Strain ini menyebar sangat cepat di seluruh
Afrika, Asia dan Amerika latin Saif, 2003. Minta et al. 2005 menyebutkan bahwa virus Polandia yang termasuk dalam strain vvIBD antara lain adalah
91272 dan 92111. Virus Isolat asli Indonesia yang telah dikarakterisasi dan diberi nama Tasik 94 juga termasuk dalam klasifikasi vvIBD Ruddet al. 2002.
Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus IBD
Sareyyupoglu2005 melaporkan bahwa penentuan strain virus IBD sangat memerlukankarakterisasi antigenik dan virulensi virus berdasarkan
geografisnya.Metode konvensional yang sering digunakan adalah VN virus-
8 netralization
dan AC-ELISA Antigen CaptureELISA dengan menggunakan monoklonal antibodi.
Metode dengan dasar asam nukleat sangat berguna dan aman karena tidak memerlukan isolasi dan propagasi pada kultur jaringan atau telur ayam berembrio.
Beberapa peneliti melaporkankegunaan metode-metode tersebutuntuk identifikasi dan genotyping strain virus lapangan. Metode tersebut antara lain :Restriction
Enzyme Analysis REA, Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP,
Multiplex PCR, Real-Time RT- PCR, Nucleotide dandeduced amino acid
sequence analysis dan Reverse Genetics.
Peighambari et al.2008telah melakukan karakterisasi isolat virus IBDyang dikumpulkan dari Iran pada tahun 2005
– 2006 dan mengelompokkannya menjadi vvIBD dan IBD klasik. RT-PCR Reverse
Transcriptase PCR digunakan untuk mengamplifikasi fragmen gen VP2 743 bp
isolat yang diperiksa.Digesti dengan 2 macam enzim yaitu BspMI dan SacI.Dari 49 sampel bursa asal broiler dan layer yang diperiksa, 75,5 sampel positif
dengan RT-PCR.Kemudiandigestiondilakukan dengan 2 macam restriction enzyme
BspMI dan SacIdan menunjukkan kecocokan 91,9 dengan vvIBD, 8,1 dengan IBD klasik. Analisis dengan restriction enzyme telah dibandingkan
dengan isolat lain yang tersedia sequen nukleotidanya dan direferensikan oleh Genbank
. Identifikasi dan karakterisasi molekuler virus dari sebuah flok yang
terserang wabahIBD di Brazil baratdaya juga dilaporkanoleh Paula et al
.2004.Sampel bursa diperiksa dengan teknikRT-PCR untuk mengamplifikasi gen hypervariabel-region VP2.Amplikon kemudian didigesti dengan restriction
enzyme Taq I, StyI dan SspI, tetapi tidak dengan SacI.Selanjutnya analisis
sekuennukleotidamengidentifikasi adanyaalanine, leucine danisoleucinepada posisi asam amino ke 222, 256 dan 294yang umum ditemukan pada strain vvIBD.
Keberadaan genotip vvIBD pada layer yang telah divaksinasi dilaporkan terjadi di Turki oleh Ceribaci et al.2007.Sekuensing daerah hypervariabelgen
VP2menunjukkan bahwa isolat virus lapang vvIBD di Turki memiliki hubungan
9 kedekatan dengan vvIBD strain Eropa dan Asia dibanding dengan strain klasik
danbukan disebabkanoleh vvIBD strain baru.
Virus IBD di Indonesia
Virus lapangan di Indonesia telah diteliti oleh Rudd et al. pada tahun 2002. Mereka telah mendapatkan hasil berupa sekuen nukleotida yang lengkap
dari virus IBD lapangan Indonesia dan juga sekuen asam amino dari segmen genom A dan B. Isolat yang diteliti disebut sebagai isolat Tasik 94, yang mirip
dengan strain vvIBD yang beredardi Eropa, terutamamemiliki homologi nukleotida yang sangat besar 99,7 dengan vvIBD strain Belanda, yaitu :
D6948 seperti ditunjukkan pada Gambar2 berikut ini.
Gambar 2Skema karakteristik vvIBD Indonesia.Hubungan phylogenetic dari 15 strain virus IBD Serotipe I berdasarkan sequen nukleotida pada poliprotein VP2-VP4-VP3.Garis cabang
merupakan proporsi perkiraan jarak genetiknya, sedangkan garis-garis batang unit merupakan substitusi nukleotida per cabang. Rudd et al. 2002
Isolat lokal Indonesia juga telah diisolasi oleh Suwarno dan Rahardjo 2005 di beberapa daerah di Jawa Timur, yaitu Lamongan dan Kediri. Isolat ini
selanjutnya diteliti karakterisasinya, meliputi imunogenitas dan antigenesitas protein VP2, sebagai dasar pengembangan vaksin sub unit.Hasilnya menunjukkan
10 bahwa berat molekul VP2 isolat ini adalah 44 kDa, dan protein ini bersifat
imunogenik yang bisa menginduksi produksi antibodi spesifik.
Diagnosa Penyakit IBD 1.
Lesi Patologi dan Berat Relatif Bursa Index Bursa
Diagnosa penyakit IBD telah banyak dilakukan dengan berbagai metode.Islam et al. 2008 menuliskan bahwa ada hubungan antara skor lesi pada
bursa dengan tingkat kematian pada infeksi IBD. Kemudian Islam et al. 2008 juga melihat histopatologi dari bursa Fabricius dan membuat diagnosa, yaitu fokal
nekrosis, atropi folikuler dan udema interfolikuler dengan penebalan tunika serosa, lepasnya epitel serta pembentukan sistik.Indek bursa didapatkan dari berat
bursa gram dikalikan 1000 dibagi berat badan ayam gram. Seekor ayam dengan index bursa yang lebih rendah dari 0,7 dikatakan
bahwa ayam tersebut mengalami atropi bursa El-Kady et al., 2007. Index bursa juga menjadi kriteria utama untuk mengetahui adanya efek imunosupresi,
disamping index limpa Juranova et al., 2001. Juranovaet al. 2001 menggunakan index bursa untuk melihat efek
vaksinasi dari 7 macam strain vaksin IBD di Republik Czech. Selain indek bursa, Juranovaet al. 2001 juga mengukur titer antibodi dengan ELISA.
2. Titer antibodi dengan ELISA