SKRIPSI SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA
SKRIPSI
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK
ASAM 10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL
HELA
AHMAD FATIH JAUHARI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
DEPARTEMEN KIMIA FARMASI
SURABAYA
2015
SKRIPSI
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK
ASAM 10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL
HELA
AHMAD FATIH JAUHARI
051111078
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
DEPARTEMEN KIMIA FARMASI
SURABAYA
2015
LEMBAR PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH
Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N-
(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA
untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Airlangga untuk kepentingan akademik sebatas sesuai Undang-Undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.
Surabaya, September 2015 Ahmad Fatih Jauhari
NIM: 051111078
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini, Nama : Ahmad Fatih Jauhari NIM : 051111078 Fakultas : Farmasi menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis dengan judul :
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N-
(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA
adalah benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri. Apabila dikemudian hari diketahui bahwa skripsi ini merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sangsi berupa pembatalan kelulusan dan atau pencabutan gelar yang saya peroleh. Demikian surat pernyataan ini saya buat untuk digunakan sebagaimana mestinya.
Surabaya, September 2015
Ahmad Fatih Jauhari NIM : 051111078
Lembar Pengesahan
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM
10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA
SKRIPSI
Dibuat untuk memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi pada
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
2015
Oleh :
AHMAD FATIH JAUHARI
NIM : 051111078
Skripsi ini telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama Pembimbing SertaProf. Dr. Siswandono, MS.,Apt. Dr. Suko Hardjono, MS.,Apt.
NIP. 19521002 198002 1 001 NIP. 19520928 198103 1 001
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan Rahmat-Nya kepada kita semua sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Sintesis dan uji aktivitas sitotoksik asam 10-N-
(benzoil) folat pada sel hela” sebagai prasyarat untuk mencapai gelar
sarjana farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.Skripsi ini dapat selesai berkat bantuan berbagai pihak, oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih dan apresiasi sedalam-dalamnya kepada:
1. Prof. Dr. Fasich, Apt. selaku Rektor Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
2. Dr. Umi Athijah, MS., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
3. Prof. Dr. Siswandono, MS., Apt. selaku dosen pembimbing utama saya, yang tidak mengenal lelah membantu memberikan saran, arahan, nasehat, masukan dari awal penelitian dan memberikan semangat baru dalam menghadapi skripsi ini.
4. Dr. Suko Hardjono, MS., Apt. selaku selaku dosen wali saya, sekaligus pembimbing serta, yang tidak hentinya memberikan semangat dalam penyelesaian skripsi ini serta naeshat akademik dari awal masuk perkuliahan sampai kapanpun.
5. Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, Apt. dan Dra. Suzana, M.Si., Apt. serta Drs. Achmad Toto Poernomo, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan evaluasi saran, masukan dan nasehat dalam perbaikan naskah skripsi ini.
6. Laboratorium Kimia Medisinal, Analisis, Sintesis, TDC dan Laboratorium Parasitologi FK UGM beserta seluruh stafnya terutama Pak Tukijo, Pak Yanto yang sering membantu preparasi alat, Pak Sunar, Pak Kosairi, Bu Yayuk, Pak Iwan, Bu Juana, Mas Tegar, Mbak Helen .
7. Ayahanda Muhammad Furqon dan Ibunda Eni Purwati yang selalu mendoakan, membangkitkan semangat penulis serta Muhammad
Nu’man Elfakhri dan Muhammad Alfan Nasrullah yang selalu menemani penulis di rumah.
8. Para Kyai dan guru-guru di Darul Ulum beserta ustadz dan santrinya yang bersedia memberikan ilmu, meluangkan waktu untuk bertukar pikiran dan mendoakan penulis.
9. Seluruh teman satu lab tim proyek asam folat yang dipromotori oleh Didy Yoga beserta anggota Erwin, Aldi, Faris dan Nindya yang tiada pernah putus semangat dalam menyelesaikan proyek ini.
10. Spesial terimakasih pada seluruh angkatan Farmasi Unair 2011 beserta komponennya dari kelas A hingga kelas D, teman-teman yang pernah menjadi komting kelas Hajir, Edy, Ananto, Raihan, Primadi, Aldi, Arie yang sudah menjalankan tugas dengan maksimal dan memperjuangkan angkatan hingga saat ini.
11. Segenap teman-teman Rep. PHP Management Ayu Ratnasari, Febrianti, Meira dan Nadiyah yang selalu menemani, memberikan motivasi dan inspirasi bagi penulis.
12. Teman-teman kontrakan sehidup serumah Nana Setyawan, Zainul Amrullah, Khanzul, Rojikin, Arya Putra, Faris S, Faris K, Raihan, Aldi, Ustad Alfi, Mas Febi, Mas Riki, Mas Dhoan dan Mas Cipto dan komponen tambahan Rohman Hadi yang mengisi hari-hari selama ini dengan pengalaman baru.
13. Serta seluruh teman-teman, kakak dan adik kelas yang berada di BEM FF, ISMAFARSI, DKI dan UKMKI serta Mas Asset, Haqqum, Kresma Okky yang turut bersama berjuang, memberi bimbingan, masukan, pengalaman dan semangat baru pada penulis .
14. Serta berbagai pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu dalam lembaran kertas ini.
Dengan segala keterbatasan, penulis belum dapat membalas kebaikan dari seluruh pihak yang terlibat baik secara langsung maupun tidak langsung, semoga Allah SWT yang membalas seluruh kebaikan kalian. Penulis menyadari dalam penyusunan skripsi ini banyak terdapat kekurangan, maka dari itu segala kritik dan saran yang membangun penulis harapkan dari berbagai pihak.
Surabaya, September 2015 Penulis
RINGKASAN
SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM
10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA
Ahmad Fatih Jauhari Terkait pengobatan kanker diketahui bahwa salah satunya adalah golongan anti metabolit folat. Asam folat dengan nama asam N - [ 4 - [ [ (10
- – amino - 1,4 – dihidro – 4 – oxo – 6 - pteridinil) metil] amino] benzoil] -L - glutamat dan metabolitnya (dikenal dengan folat) merupakan koenzim dari banyak transformasi biokimia esensial. Dalam rangka meningkatkan aktivitas biologis dari suatu struktur senyawa maka dilakukan modifikasi molekul atau struktur dari senyawa penuntun. Modifikasi asam folat menjadi antimetabolit folat diawali dengan membuat rancangan senyawa dimana asam folat ditambahkan gugus-gugus yang memiliki sifat lipofilik, elektronik, dan sterik tertentu. Kemudian dilakukan uji in silico , melakukan sintesis senyawa tersebut dengan metode reaksi subtitusi asil nukleofilik. Sintesis turunan asam folat pada gugus amin sekunder pernah dilakukan sebelumnya dengan subtituen trifluoroasetil. Senyawa hasil sintesis kemudian dilihat aktivitas biologisnya dengan menguji aktivitas sitotoksiknya secara in vitro pada sel HeLa dengan menggunakan metode MTT.
Tujuan penelitian ini untuk membandingkan aktivitas sitotoksik secara in silico dari senyawa asam 10-N-(benzoil)folat dengan metotreksat, memperoleh senyawa asam 10-N-(benzoil)folat melalui hasil reaksi antara asam folat dan benzoil klorida dan membandingkan aktivitas sitotoksiknya dengan metotreksat secara in vitro dengan metode MTT terhadap kultur sel HeLa.
Uji in silico secara komputerisasi dilakukan untuk memprediksi apakah senyawa asam 10-N-(benzoil)folat memiliki aktivitas sitotoksik yang lebih besar daripada metotreksat menggunakan program Molegro Virtual
Docker (MVD). Dari hasil doking melalui reseptor DHFR dengan kode
1DDS didapatkan nilai rerank score yang lebih rendahdari metotreksat.Sehingga energi ikatan antara senyawa dan dengan reseptor akan semakin interaktif, dan diprediksi aktivitasnya akan meningkat.
Hasil sintesis memperoleh cairan minyak kuning. Yang selanjutnya dicuci menggunakan benzen dan eter untuk menghilangkan sisa subtituen benzoil klorida yang tersisa. Lalu fase minyak di pisahkan menggunakan corong pisah dan diuapkan untuk mendapatkan senyawa asam 10-N- (benzoil)folat.
Uji kemurnian dilakukan metode KLT dengan 3 sistem eluen. Dari uji kemurnian senyawa asam 10-N-(benzoil)folat yang dieluasi dengan metanol: air (7:3), metanol : air (1 :1) yang dilakukan pada plat KLT RP dan acetonitril : air (3:1) pada plat KLT fase normal dihasilkan satu noda yang berbeda Rf nya dengan noda asam folat.
Uji konfirmasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri
1
inframerah dan H-NMR. Dari hasil analisis dengan spektrofotometri inframerah tidak didapatkan data yang mendukung bahwa senyawa target adalah asam 10-N-(benzoil)folat. sedangkan dari hasil analisis dengan
1
spektrofotometri H-NMR dapat disimpulkan ada 2 benzena yang menunjukkan senyawa yang diuji adalah asam 10-N-(benzoil)folat.
Uji sitotoksik mendapatkan dari data absorbansi dan dikonversikan menjadi % sel hidup, menunjukkan bahwa baik perlakuan dengan senyawa asam 10-N-(benzoil)folat maupun dengan kontrol positif metotreksat tidak menyebabkan adanya kematian sel yang signifikan. Hal ini dapat disebabkan oleh penggunaan metode ataupun pengaruh bahan dan komposisi bahan pada pengujian aktivitas sitotoksik dari senyawa hasil sintesis dan kontrol positif yang tidak sesuai, sehingga hasil yang diperoleh tidak dapat mendeskripsikan aktivitas sitotoksik dari senyawa hasil sintesis maupun kontrol positif.
Ketiga tahap yang telah dilakukan, yaitu uji in silico, sintesis senyawa, dan uji aktivitas in vitro MTT menjelaskan bahwa uji in vitro dapat mengurangi percobaan trial and error sehingga dapat mengurangi waktu dan biaya yang dibutuhkan dalam pengembangan obat baru. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar pengembangan senyawa asam 10-N- (benzoil)folat sebagai calon obat antikanker. Namun, masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terkait analisis untuk metode spektrofotometri inframerah dengan pelet KBr dan uji in vitro untuk senyawa yang bekerja sebagai antifolat. Selain itu, perlu dilakukan studi lebih lanjut terkait aktivitas asam 10-N-(benzoil)folat secara in vitro dengan sel kanker lain dan studi in vivo untuk memprediksikan toksisitas dan pengaruh metabolisme terhadap keberadaan obat di dalam tubuh .
ABSTRACT
Synthesis and cytotoxic activity test of 10-N- (benzoyl) folic acid on
HeLa cells
In Indonesia, each year approximately 15,000 new cases of cervical cancer and 7,500 of them lead to death. In cancer cells was found that excess folic acid needs. Have been many analog of folic acid (antifolate) is used as the analog cancer chemotherapy but still have considerable side effects. So it is necessary to modify the folic acid molecule to produce another analog that is expected to provide an optimal activity but have low toxicity. Folic acid modification begins with drafting a compound where folic acid is added the groups which have lipophilic properties, electronic and steric certain. Then tested in silico to predict bond strength analogous to receptors. Then do the synthesis of these compounds with acylation method and the its analog results tested the activity with in vitro assays in HeLa cells that compared to the positive control (methotrexate) with MTT assay method. Results from in
silico test shows modified compounds have lower scores rerank (potent).
Results compound from synthesis is 10-N- (benzoyl)folic acid with 60% yield
1
and proved by TLC and H-NMR spectrophotometric test. Then results compound from synthesis tested with MTT assay test against HeLa cell culture that compared with methotrexate at a level of 5000 ppm until 10 ppm. The result from MTT assay test can not be analyzed because the method does not show the good hindrance between 10-N- (benzoyl) folic acid and methotrexate. This research resulted in 10-N- (benzoyl)folic acid as antifolate.
Keyword: Cancer, folic acid, in silico, acylation, 10-N- (benzoyl)folic acid, MTT assay, HeLa cell.
DAFTAR ISI
Halaman
BAB I PENDAHULUAN
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
BAB III KERANGKA KONSEPTUAL
1 NMR...................................................17
2.5.2.4 Spektroskopi H
2.5.2.3 Spektroskopi Inframerah.................................................15
2.5.2.2 Kromofor.........................................................................15
2.5.2.1 Prinsip Dasar Spektroskopi Absorbsi.............................14
BAB V HASIL PENGAMATAN
DAFTAR TABEL
Halaman
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1.1 Senyawa AM dan MTX (Avendano & Menendez, 2008) ... 3Gambar 1.2 Struktur (a)asam folat; (b)metotreksat; (c)asam 10-N-Gambar 1.3 Struktur asam 10-N-(trifluoroasetil)folat yang pernah disentesis. ............................................................................ 5Gambar 2.1 Siklus Sel dalam Tubuh (Bolsover, et al., 2004) ................. 9Gambar 2.2 Interaksi folat dengan reseptor ...........................................10Gambar 2.3 Substitusi Asil Nukleofilik .................................................13Gambar 2.4 Mekanisme Reaksi Substitusi Asil Nukleofilik pada Asam
Gambar 2.5 Skema Spektra Absorbsi .....................................................15Gambar 2.6 Daerah inframerah dari spektra elektromagnetik ................15Gambar 2.7 Absorbsi IR dari Beberapa Gugus Fungsi ...........................16Gambar 3.1 Skema Kerangka Konseptual ..............................................24Gambar 4.1 Kerangka Operasional Penelitian ........................................26Gambar 4.2 Gambar (a) adalah struktur reseptor dihydrofolate reductase
Gambar 4.3 Hemasitometer terdiri dari 4 kamar hitung. Setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak .................................................34Gambar 5.1 Gambar (a) adalah struktur 2D asam 10-N-(benzoil)folat, gambar (b) adalah struktur 3D dari asam 10-N-
Gambar 5.2 Reseptor DHFR dengan kode 1DDS ..................................40Gambar 5.3 Cavity pada reseptor DHFR 1DDS .........................................40Gambar 5.4 Cavity 1 reseptor 1DDS terdapat gugus farmakofor dari ligan asal reseptor dan ligan senyawa yang akan
Gambar 5.5 Gambar ikatan hidrogen (biru) senyawa metotreksat beserta jenis protein yang terikat pada saat proses doking. ............42Gambar 5.6 Gambar ikatan hidrogen (biru) senyawa asam 10-N-
Gambar 5.7 Spektrum inframerah senyawa asam folat dalam pelet
Gambar 5.8 Spektrum inframerah senyawa hasil sintesis dalam pelet
DAFTAR SINGKATAN
2D 2 dimensi
3D 3 dimensi DHFR Dihidrofolat Reduktase DMSO Dimetilsulfoksida DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FT-IR Fourier Transform Infrared
1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance
HDAC Histon Deasetilase MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-10-il)-10-5-difeniltetrazolium bromida MTX Methotrexate MVD Molegro Virtual Docker PBS Phospat Buffer Saline RNA Ribonucleic Acid RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS Sodium Dodecyl Sulfate WHO World Health Organization UV Ultraviolet