Imobilisasi Sel Saccharomyces Cerevisiae Menggunakan Alginat- Kitosan Dan Uji Stabilitasnya Untuk Produksi Etanol Dari Molase Secara Fermentasi Batch

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etanol

Etanol atau sering juga disebut dengan alkohol adalah suatu cairan transparan, mudah terbakar, tidak berwarna, mudah menguap, dengan rumus kimia C2H5OH, dapat bercampur dengan air, eter, dan kloroform, yang diperoleh melalui fermentasi karbohidrat dari ragi yang disebut juga dengan etil alkohol (Bender, 1982).

Etanol atau etil alkohol (C2H5OH) termasuk kelompok hidroksilyang memberikan polaritas pada molekul dan mengakibatkan meningkatnya ikatan hidrogen intermolekuler. Etanol memiliki massa jenis 0.7893 g/mL. Titik didih etanol pada tekanan atmosfer adalah 78.32 °C. Indeks bias dan viskositas pada temperatur 20°C adalah 1.36143 dan 1.17 cP (Kirk and Othmer, 1965). Etanol digunakan pada berbagai produk meliputi campuran bahan bakar, produk minuman, penambah rasa, industri farmasi, dan bahan-bahan kimia.

Etanol merupakan salah satu sumber energi alternatif yang dapat dijadikan sebagai energi alternatif dari bahan bakar nabati (BBN). Etanol mempunyai beberapa kelebihan dari pada bahan bakar lain seperti premium antara lain sifat etanol yang dapat diperbaharui, menghasilkan gas buangan yang ramah lingkungan karena gas CO2 yang dihasilkan rendah (Jeon, 2007).

1. Etanol untuk konsumsi umumnya dihasilkan dengan proses fermentasi atau peragian bahan makanan yang mengandung pati atau karbohidrat, seperti beras dan umbi. Etanol yang dihasilkan dari proses fermentasi biasanya berkadar rendah. Untuk mendapatkan etanol dengan kadar yang lebih tinggi diperlukan proses pemurnian melalui penyulingan ataupun destilasi. Etanol untuk keperluan industri dalam skala lebih besar dihasilkan dari fermentasi tetes tebu, yaitu hasil samping dalam industri gula tebu atau gula bit.

2. Melalui sintesis kimia melalui reaksi antara gas etilen dan uap air dengan asam sebagai katalis. Katalis yang dipakai biasanya asam fosfat. Asam sulfat juga dapat digunakan sebagai katalis, namun sangat jarang digunakan. 2008).

Etanol dapat dijadikan sebagai bahan bakar, namun harus etanol dengan kadar kemurnian yang tinggi atau terbebas oleh air. Adapun cara pemurnian etanol dapat dilakukan dengan destilasi tetapi kemurniannya hanya sampai 96% karena adanya peristiwa azeotrop antara campuran etanol dan air. Untuk dapat memperoleh etanol dengan kadar yang tinggi maka dilakukan suatu cara yaitu absorbsi fisik atau molecular sieve. Dalam penggunaan etanol sebagai bahan bakar, tidak dapat langsung digunakan pada kendaraan bermotor, namun etanol harus ditambahkan dengan bensin. Sebagai contoh sebanyak 10% etanol dari 1 liter bensin dapat digunakan sebagai bahan bakar (disebut E10). Namun haruslah berhati-hati dalam penggunaan bahan bakar ini, karena etanol yang digunakan harus benar-benar bebas dari air, dikarenakan ketersediaan air dapat menyebabkan kerusakan dan korosi pada mesin.

Etanol merupakan hasil fermentasi yang memiliki masalah pada proses fermentasi itu sendiri yakni timbulnya etanol dapat berakibat rusaknya struktur membran plasma mikroba serta terjadinya denaturasi protein penyusun dari sel tersebut. Adanya ketersediaan etanol di dalam media fermentasi dapat menjadi penghambat pertumbuhan mikroba penghasil etanol (Supriyanto, 2010)

2.2 Molase

Dalam industri gula dari tebu diperoleh suatu limbah dari sisa pengkristalan gula pasir berbentuk cairan berwarna coklat kehitaman yang disebut dengan molase. Molase adalah sirup yang mengandung glukosa dan fruktosa yang sangat sulit untuk dikristalkan. Molase merupakan produk limbah dari industri gula dimana produk ini masih banyak mengandung gula dan asam – asam organik, sehingga merupakan bahan baku yang sangat baik untuk dijadikan sebagai bahan baku pembuatan ataupun industri etanol. Bahan ini merupakan produk samping dari industri gula pasir dengan kandungan gula dari molase terutama sukrosa berkisar 40-55%

Molase dapat dikonversi menjadi etanol melalui proses fermentasi, biasanya pH molase berkisar antara 5,5-6,5. Molase yang telah diencerkan hingga 10-18% telah memberikan hasil yang memuaskan dalam menghasilkan etanol dari proses fermentasi

Molase dari tebu dapat dibedakan menjadi 3 jenis. Molase kelas 1, kelas 2 dan “black strap”. Molase kelas 1 didapatkan saat pertama kali jus tebu dikristalisasi. Saat dikristalisasi terdapat sisa jus yang tidak mengkristal dan berwarna bening. Maka sisa jus ini langsung diambil sebagai molase kelas 1. Kemudian molase kelas 2 atau biasa disebut dengan “Dark” diperoleh saat proses kristalisasi kedua. Warnanya agak kecoklatan sehingga sering disebut dengan istilah “Dark”. Dan molase kelas terakhir yaitu “Black Strap” diperoleh dari kristalisasi terakhir. Warna “Black Strap” ini memang mendekati hitam (coklat tua)

Tabel 2.1. Komposisi kimia molase black strap

Komposisi Presentase (%)

Bahan Kering

Total Gula sebagai Gula invert

- N

- P2O5

- CaO

- MgO

- K2O

Total Abu

77-84 52-67 0,4-1,5 0,6-2,0 0,1-1,1 0,03-0,1

2,6-5,0 7-11

2.3 Sel Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir sejati tergolong eukariot yang secara morfologi hanya membentuk blastospora berbentuk bulat lonjong, silindris, oval atau bulat telur yang dipengaruhi oleh strainnya. Dapat berkembangbiak dengan membelah diri melalui "budding cell" . Reproduksinya dapat dipengaruhi oleh keadaan lingkungan serta jumlah nutrisi yang tersedia bagi pertumbuhan sel . Penampilan makroskopik mempunyai koloni berbentuk bulat, warna kuning muda, permukaan berkilau, licin, tekstur lunak dan memiliki sel bulat dengan askospora 1-8 buah (Nikon et al, 2004) .

Taksonomi Saccharomyces cerevisiae menurut Sanger (2004), sebagai berikut:

Super kingdom : Eukaryota

Phylum : Fungi

Subphylum : Ascomycota Class : Saccharomycetes Order : Saccharomycetales Family : Saccharomycetaceae

Genus : Saccharomyces

Species : Saccharomyces cerevisiae

Khamir dapat berkembang biak dalam gula sederhana seperti glukosa, maupun gula kompleks disakarida yaitu sukrosa (Marx, 1991). Selain itu untuk menunjang kebutuhan hidup diperlukan oksigen, karbohidrat, dan nitrogen. Pada uji fermentasi gula – gula mempunyai reaksi positif pada gula dekstrosa, galaktosa, sukrosa, maltosa, raffinosa, trehalosa, dan negatif pada gula laktosa (Lodder, 1970). Gambar 2.3 menunjukkan bentuk sel Saccharomyces cerevisiae dengan bentuk blastospora bulat lonjong yang dilihat menggunakan mikroskop cahaya.

Gambar 2.3 Sel Saccharomyces cerevisiae dengan perbesaran 10 x 40

Komposisi kimia S. cerevisiae dapat di lihat dalam tabel 2.2 Tabel 2.2 Kandungan kimia S. cerevisiae

Komposisi senyawa Presentasi (%)

Protein Karbohidrat Lemak Mineral lain

50-52 30-37 4-5 7-8

Suriawiria (1990) melaporkan komposisi kimia sel khamir yang hampir sama pada Tabel 2.3 dan kandungan asam aminonya Tabel 2.4.

Tabel 2.3 Komposisi sel Saccharomyces cerevisiae

Komposisi senyawa Presentase (%)

Abu Asam Nukleat Lemak Nitrogen 5,0-9,5 6,0-12,0 2,0-6,0 7,5-8,5 (Suriawiria, 1990)

Tabel 2.4 Kandungan asam amino dalam Saccharomyces cerevisiae

Komposisi senyawa Presentase (%)

Fenilalanin Isoleusin Lisin Leusin Metionin Sistin Treonin Triptofan Valin 4,1-4,8 4,6-5,3 7,7-7,8 7,0-7,8 1,6-1,7 0,9 4,8-5,4 1,1-1,3 5,3-5,8 (Suriawiria, 1990)

Penggunaan sel Saccharomyces cerevisiae dalam produksi etanol didasarkan pada beberapa faktor yaitu mudahnya diperoleh sel Saccharomyces cerevisiae di sekitar kita, dan juga didasarkan pada jenis karbohidrat yang digunakan sebagai medium. Untuk

memproduksi etanol dari molase yang sebagian besar merupakan sukrosa maka sel

Saccharomyces cerevisiae adalah sel yang tepat. Hal ini dikarenakan sel ini mampu tumbuh dan berkembang dengan cepat dan mempunyai toleransi terhadap konsentrasi gula (sukrosa) yang tinggi, selain itu etanol yang dihasilkan dapat ditoleransi oleh sel ini (Sa’id, 1987).

Menurut Fraenkel (1982), temperatur pertumbuhan yang optimum untuk sel

Saccharomyces cerevisiae adalah 28 – 36o C dan pH optimum untuk pertumbuhan adalah 4,5 – 5,5 ( Moat and Foster, 1998)

2.3.1 Sumber Energi

Sel Saccharomyces cerevisiae dapat hidupnya memperoleh energi dari bahan – bahan organik dan anorganik. Sel ini mendapatkan energi dari ikatan karbon, hal ini digunakannya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya yang seluruhnya diperoleh dari molekul glukosa, sukrosa, asam organik ataupun alkohol yang telah diubah menjadi senyawa kompleks seperti protein, polisakarida, lemak dan lignin (Gattaway and evans, 1984).

Menurut Buckle (1987) karbon dan energi yang diperlukan oleh sel Saccharomyces cerevisiae diperoleh dari gula dan karbohidrat lain seperti glukosa. Karbohidrat merupakan sumber karbon paling banyak yang digunakan dalam fermentasi oleh sel ini.

Dalam industri etanol digunakan khamir jenis Saccharomyces cerevisiae yang sering juga disebut khamir permukaan (top yeast), yaitu khamir yang bersifat fermentatif kuat dan tumbuh dengan cepat pada suhu 20oC. Khamir permukaan ini tumbuh secara bergerombol dan melepaskan karbon dioksida dengan cepat, yang mengakibatkan sel terapung pada permukaan (Fardiaz, 1992).

Kemampuan untuk menkonversi gula menjadi etanol ini disebabkan oleh adanya peran dari enzim zimase dan invertase. Enzim zimase adalah enzim yang berperan sebagai pemecah sukrosa dari gula menjadi monosakarida-monosakaridanya (glukosa dan fruktosa), selanjutnya terdapat enzim invertase yang mengubah glukosa menjadi etanol. Konsentrasi gula yang umumnya dibuat untuk pembuatan etanol berkisar 14-20 persen. Jika konsentrasi lebih tinggi akan menghambat aktivitas dari khamir dikarenakan menurunnya oksigen terlarut yang diperlukan khamir. Lama dari fermentasi sekitar 30 – 70 jam dengan kondisi anaerob (Judoamidjojo et al. 1992)

Jika pemberian O2 berlebihan (kondisi aerob), sel S.cerevisiae akan melakukan respirasi secara aerobik, dalam keadaan ini enzim khamir dapat memecah senyawa gula lebih sempurna, dan akan dihasilkan karbondioksida dan air.

2.3.2 Pertumbuhan sel Saccharomyces cerevisiae

Pertumbuhan sel merupakan puncak aktivitas fisiologi yang saling mempengaruhi secara berurutan. Proses pertumbuhan ini sangat kompleks meliputi pemasukan nutrien dasar dari lingkungan ke dalam sel, konversi bahan-bahan nutrien menjadi energi dan berbagai

constituen vital cell serta perkembangbiakan. Pertumbuhan mikrobial ditandai dengan peningkatan jumlah dan massa sel serta kecepatan pertumbuhan tergantung pada lingkungan fisik dan kimia (Anonymous, 2008).

Adapun kurva pertumbuhan mikroba secara umum dapat dilihat pada Gambar 2.4. .

Pada dasarnya pertumbuhan sel Saccharomyces cerevisiae dapat berlangsung tanpa batas, akan tetapi karena pertumbuhan sel Saccharomyces cerevisiae berlangsung dengan mengkonsumsi nutrien sekaligus mengeluarkankan produk-produk metabolisme yang terbentuk maka setelah waktu tertentu laju pertumbuhan akan menurun dan akhirnya pertumbuhan berhenti sama sekali. Berhentinya pertumbuhan dapat disebabkan karena berkurangnya beberapa nutrien esensial dalam medium atau karena terjadinya akumulasi

aututuksin dalam medium atau kombinasi dari keduanya (Ansori, 1989).

Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae pada umumnya berada dalam kultur murni. Ragi yang beredar dipasaran biasanya mengandung mikroba jenis yeast. Didalam ragi Saccharomyces cerevisiae dicampur dengan tepung beras dan dikeringkan, biasanya berbentuk agak bulat dengan diameter 3 cm serta berwarna putih.

2.4 Alginat

Asam alginat adalah senyawa komplek yang termasuk karbohidrat koloidal hidrofilik hasil polimerisasi D-asam mannuronat dengan rumus kimianya (C6H8O6)n dimana harga n diantara 80 sampai 83. Ada dua jenis monomer penyusun asam alginat yaitu asam D-mannuronat dan asam L-guloronat. Berikut struktur kimia penyusun alginat seperti gambar 2.5 (painter et al, 1986).

Gambar 2.5 Struktur dasar penyusun alginat

Sifat-sifat alginat sebagian besar tergantung pada tingkat polimerisasi dan perbandingan komposisi guluronat dan mannuronat dalam molekul. Asam alginat tidak larut dalam air dan mengendap pada pH < 3,5 sedangkan garam alginat dapat larut dalam air dingin atau air panas dan mampu membentuk larutan yang stabil. Natrium alginat tidak dapat larut dalam pelarut organik tetapi dapat mengendap dengan alkohol. Alginat sangat stabil pada pH 5 – 10, sedangkan pada pH yang lebih tinggi viskositasnya sangat kecil akibat adanya degradasi ß- eliminatif. Ikatan glikosidik antara asam mannuronat dan guluronat kurang stabil terhadap hidrolisis asam dibandingkan ikatan dua asam mannuronat atau dua asam guluronat. Kemampuan alginat membentuk gel terutama berkaitan dengan proporsi L-guluronat (An Ullman’s, 1998).

Asam alginat diproduksi dengan cara ekstraksi alga coklat (Phaeophyceae) dan banyak digunakan sebagai bahan pembentuk gel dan pengental yang bersifat thermoreversibel dalam berbagai bidang industri, juga dipakai sebagai suspending emulsifying, dan stabilizing agent.

Alginat memiliki sifat hidrofilik sehingga banyak dimanfaatkan dalam industri pembekuan makanan karena alginat dapat mengikat air. Sifat mengikat air ini juga

dimanfaatkan dalam industri kosmetik karena dengan adanya alginat, kosmetik dapat menempel dengan erat di jaringan kulit dengan kelembapan yang tetap terjaga.

Alginat memiliki sifat koloid, dapat membentuk gel dan hidrofilik, selain digunakan di berbagai industri diatas, kemampuan alginat tersebut dapat digunakan dalam proses imobilisasi. Dari penelitian yang telah banyak dilakukan, alginat merupakan matrix

imobilisasi yang paling baik, karena efisien, mudah digunakan, dapat dimodifikasi, dan tidak bersifat toksik. Sifat-sifat alginat sebagian besar tergantung pada tingkat polimerisasi dan perbandingan komposisi guluronat dan mannuronat dalam molekul.

Alginat tidak stabil terhadap panas, oksigen, ion logam, dan sebagainya. Dalam keadaan demikian, alginat akan mengalami degradasi. Selama penyimpanan, alginat cepat mengalami degradasi dengan adanya oksigen, terutama dengan naiknya kelembaban udara. Alginat dengan visositas tinggi lebih cepat terdegradasi dibandingkan alginat dengan viskositas sedang atau rendah. Urutan stabilitas alginat selama penyimpanan adalah natrium alginat > ammonium alginat > asam alginat (Sembiring, 2010)

Kemampuan alginat membentuk gel juga ditentukan oleh kadar asam guluronat yang menyusun struktur alginat. Kekuatan gel ditentukan oleh ukuran molekul dan komposisi struktur yang menyusun alginat. Tinggi kandungan asam guluronat di dalam alginat akan menyebabkan alginat dapat mengikat ion divalent lebih baik dibandingkan dengan alginat yang memiliki sedikit asam guluronat.

Kekakuan strukutur alginat dalam aplikasi imobilisasi ditentukan oleh adanya ion divalent. Kekakuan strukutur alginat akan bertambah secara umum seiring dengan bertambahnya afinitas terhadap ion – ion divalent. Berikut urutan ion yang dapat membuat

kekakuan dari alginat berdasarkan urutan afinitasnya, Mn>Co>Zn>Cd>Ni>Cu>Pb>Ca>Sr>Ba. Namun tidak semua ion-ion ini dapat diaplikasikan dalam imobilisasi sel. Ion Ca2+ adalah ion yang paling umum digunakan untuk tujuan imobilisasi sel karena toksisitasnya yang paling rendah (Betha, 2009)

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, rantai asam guluronat melengkung sedangkan rantai asam mannuronat merata. Hal ini menyebabkan keduanya mempunyai perbedaan dalam berikatan dengan ion Ca2+. Penambahan Ca2+ pada asam guluronat menjadikannya bentuk gel, seperti Ca2+ masuk kedalam egg box antar unit monomer (Sembiring, 2010), seperti yang di tunjukkan dalam gambar 2.6.

Gambar 2.6 Proses terbentuknya egg box dari alginat

2.5 Kitosan

Kitosan adalah poli – (2,6– amino – 2 – deoksi - β -(1 – 4) – D – glukopiranosa dengan rumus molekul (C6H11NO4)n yang dapat diperoleh dari deasetilasi kitin. Kitosan juga dijumpai secara alamiah dibeberapa organisme. Proses kimiawi menggunakan basa, misalnya NaOH, dan dapat menghasilkan kitosan dengan derajat deasetilasi yang tinggi, yaitu mencapai 85 – 93% (Sugita et al, 2009).

Kitosan mempunyai nama lain selain kitin yaitu Kitosan Askorbat, N-karboksibutill kitosan. Kitosan berbentuk lembaran tipis , tidak berbau, berwarna putih, dan terdiri dari dua jenis polimer yaitu poli asetilamin-2-glukosa) dan poli (2-deoksi-2-aminoglukosa) yang berikatan secara beta (1,4). Adapun struktur kitosan dapat dilihat pada gambar 2.7.

Gambar 2.7 Struktur dasar Penyusun dari Kitosan

Karena adanya gugus amino, kitosan merupakan polielektrolit kationik (pKa = 6,5) hal yang sangat jarang terjadi secara alamiah. Sifat yang basa ini menjadikan kitosan:

a. Dapat larut dalam media asam encer membentuk larutan yang kental sehingga dapat digunakan dalam pembuata gel. Dalam beberapa variasi konfigurasi seperti butiran, membran, pelapis kapsul, serat dan spons.

b. Membentuk kompleks yang tidak larut dengan air dengan polianion yang dapat juga digunakan untuk pembuatan butiran gel, kapsul, dan membran.

c. Dapat digunakan sebagai pengkhelat ion logam berat dimana gelnya menyediakan sistem produksi terhadap efek dekstruksi dari ion (Meriaty, 2002)

2.6 Imobilisasi Sel

Proses produksi etanol dapat dilakukan dengan cara fermentasi. Teknik fermentasi konvensional yang biasa dilakukan adalah dengan mencampur sel ragi yang mengandung

Saccharomyces cerevisiae dengan substrat yang mengandung glukosa. Namun teknik ini memiliki beberapa kelemahan antara lain sulitnya proses isolasi produk hasil fermentasi dan sel ragi yang digunakan tidak dapat diperoleh kembali sehingga ragi yang digunakan hanya dapat digunakan sekali saja. Teknik ini juga memiliki kekurangan antara lain sel ragi yang digunakan dapat mati diakibatkan oleh faktor inhibisi dari produk hasil fermentasi yaitu etanol yang merupakan senyawa yang dapat memecah sel ragi tersebut sehingga ketersediaan etanol sebenarnya menyebabkan kematian ragi semakin cepat. Kadar etanol yang dapat ditoleransi oleh sel S.cerevisiae sebesar 14%. sel S.cerevisiae juga tidak dapat mentoleransi dari perubahan lingkungan seperti pH dan suhu dari lingkungan medianya.

Untuk dapat mengeliminasi kelemahan-kelemahan tersebut maka dilakukan imobilisasi sel Sacchaomyces cerevisiae tersebut. Dengan demikian sel yang diperoleh lebih tahan terhadap inhibisi dari etanol yang dihasilkan. Sel terimobil ini juga dapat menahan perubahan lingkungan yang terjadi di sekelilingnya seperti perubahan pH dan suhu, dan tentunya dapat digunakan lagi berulang-ulang setelah mengkatalisis suatu reaksi sintesis tertentu (Chibata, 1978).

Sel terimobilisasi dapat didefenisikan sebagai sel yang secara fisik ditempatkan dalam suatu ruang tertentu yang sudah di atur dengan kondisi tertentu dan tetap memiliki aktifitas katalitiknya dan dapat digunakan secara berulang-ulang ataupun secara berlanjut (Chibata, 1978).

Imobilisasi sel juga merupakan salah satu usaha untuk mempermudah proses pemisahan produk hasil fermentasi molase yaitu etanol dengan sel Saccharomyces cerevisiae selama reaksi berlangsung dengan menggunakan sistem dua fase, yaitu satu fase mengandung sel dan fase lainnya mengandung produk, sehingga tidak terjadi proses kontaminasi dari produk terhadap sel yang digunakan (Chaplin, 1990).

Imobilisasi juga diartikan sebagai suatu modifikasi tempat sel untuk hidup dengan meniru keadaan dari tempat berkembangnya sel sehingga sel tetap dapat berkembang dan bekerja dalam proses katalisis suatu reaksi yang berkesinambungan (Zaborsky, 1973).

2.6.1 Metode Imobilisasi

Metode untuk imobilisasi enzim dapat dibagi atas 3 kategori dasar, yaitu: 1. Metode Carrier-binding

Metode ini dibagi menjadi tiga berdasarkan cara pengikatan enzimnya, yaitu adsorpsi fisika, pengikatan ionik, dan pengikatan kovalen.

Metode ini berdasarkan pada adsorpsi fisika dari protein enzim pada permukaan pembawa yang tidak larut dalam air. Kelemahan dari metode ini dimana enzim yang diserap dapat bocor selama pemakaian karena gaya ikat antara protein enzim dan pembawa lemah.

b. Metode pengikatan ionik

Metode pengikatan ionik berdasarkan pengikatan ionik dari protein enzim pada pembawa yang tidak larut dalam air yang mengandung residu penukar ion. Kelemahan metode ini dimana kebocoran dapat terjadi dimana dalam larutan substrat dengan kekuatan ionik yang tinggi atau pada variasi pH.

c. Metode pengikatan kovalen

Pada metode ini diperlukan kondisi reaksi yang sulit dan biasanya dilakukan tidak dalam keadaan kamar. Dalam beberapa kasus, ditemukan bahwa ikatan kovalen mengubah bentuk konformasi dan pusat aktif enzim yang mengakibatkan kehilangan aktivitas atau perubahan spesifitas aktivitas.

2.Metode Ikat Silang

Metode ini berdasarkan pembentukan ikatan kimia seperti dalam metode ikat kovalen,namun pembawa yang digunakan tidak larut dalam air. Imobilisasi enzim dilakukan dengan pembentukan ikat silang intermolekuler diantara molekul enzim dengan penambahan reagent bi-atau multifungsional.

3. Metode Penjebakan

Metode penjebakan berdasarkan pengikatan enzim dalam kisi matriks polimer atau melingkupi enzim dalam membran semipermiabel dan dibagi menjadi tipe kisi dan mikrokapsul.

a. Tipe kisi (lattice type)

Metode penjebakan tipe kisi meliputi penjebakan enzim dalam bidang batas (intersititial space) dari suatu ikat – silang yang tidak larut dalam air misalnya gel matriks.

b. Mikrokapsul

Penjebakan dengan cara mikrokapsul melibatkan pelingkupan enzim dengan membran polimer semipermiabel.Prosedur untuk mikroenkapsulasi enzim dapat dibagi kedalam tiga kategori (Chibata,1978) yaitu :

1. Polimerisasi interfasial

2. Pengeringan cair (liquid drying) 3. Pemisahan fase (phase separation)

Teknik penjebakan yang umum untuk mikroorganisme dalam butiran adalah pembentukan gel ionotropik dari makromolekul dengan kation multivalensi. Penjebakan dapat terjadi dengan mencampurkan mikroorganisme dengan polimer anionik dan kemudian diikatsilang larutan tersebut dengan kation multivalensi sehingga membentuk struktur yang menjebak mikroorganisme tersebut. (Liouni,2007).

Dalam penelitian kali ini dilakukan teknik mikrokapsul. Dasar dari penggunaan teknik mikrokapsul didasarkan pada kestabilan yang lebih tinggi pada proses fermentasi, sederhana dalam pembuatan dan penggunaan, terjadi interaksi yang kuat, mudah dalam pemisahan produk dan juga mudah dalam modifikasi (Mosbach, 1976).

2.7 Fermentasi

2.7.1 Pengertian Fermentasi

Fermentasi berasal dari bahasa latin ferfere yang artinya mendidihkan, yaitu berdasarkan ilmu kimia terbentuknya gas-gas dari suatu cairan kimia yang pengertiannya berbeda dengan air mendidih. Gas yang terbentuk tersebut di antaranya karbondioksida (CO2) (Afrianti,2004).

Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam kondisi anaerob (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan

tetapi definisi yang lebih jelas mengatakan bahwa fermentasi diartikan sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor electron eksternal (Darmanto, 2006). Fermentasi juga dapat diartikan sebagai perubahan gradual oleh enzim, bakteri, khamir dan jamur. Contoh fermentasi yang ada di kehidupan sehari – hari antara lain pengasaman susu, perubahan gula menjadi alkohol serta oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat et al, 2006).

2.7.2 Pembagian Fermentasi

Menurut Afrianti (2004) fermentasi berdasarkan kebutuhan O2, dapat dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Ferementasi aerob (proses respirasi)

Fermentasi aerob yaitu disimilasi bahan-bahan yang disertai dengan pengambilan oksigen. Semua organisme untuk hidupnya memerlukan sumber energi yang diperoleh dari hasil metabolisme bahan pangan, dimana organisme itu berada. Bahan energi yang paling banyak digunakan mikroorganisme untuk tumbuh adalah glukosa. Dengan adanya oksigen maka mikroorganisme dapat mencerna glukosa menghasilkan air, karbondioksida dan sejumlah besar energi. Contoh : fermentasi asam asetat, asam nitrat, dan sebagainya.

2. Fermentasi anaerob

Fermentasi anaerob yaitu fermentasi yang tidak membutuhkan adanya oksigen, Beberapa mikroorganisme dapat mencerna bahan energinya tanpa adanya oksigen. Jadi hanya sebagian bahan energi itu dipecah, yang dihasilkan adalah sebagian dari energi, karbondioksida dan air, termasuk sejumlah asam laktat, asetat, etanol, asam volatil, alkohol dan ester. Biasanya dalam fermentasi ini menggunkan mikroba yeast, jamur dan bakteri. Fermentasi tipe anaerob menghasilkan sejumlah kecil energi, karbondioksida, air, dan produk akhir metabolik organik lain, seperti asam laktat, asam asetat, dan etanol serta sejumlah kecil asam organik volatil lainnya, alkohol dan ester (Buckle et.al, 1985). Pada

proses fermentasi anaerob mula-mula glukosa dipecah menjadi asam piruvat yang melalui lintasan Embden Meyerhoff Pamas (EMP). Setelah itu terjadi dekarboksilasidehida asam piruvat menjadi asetaldehida. asetaldehida tereduksi menjadi etanol yaitu menerima elektron hasil oksidasi asam gliseraldehida 3- phosphat. Melalui proses fermentasi anaerob ini 90% glukosa akan dirubah menjadi etanol dan CO2 (Ansori, 1989).

Reaksi pada Gambar 2.8 asetaldehida bertindak sebagai penerima hidrogen dalam fermentasi, dimana hasil reduksinya oleh NADH2 menghasilkan etanol, dan NAD yang teoksidasi kemudian dapat digunakan lagi untuk menangkap hidrogen (Fardiaz,1992)

Gambar 2.6 Proses fermentasi glukosa

Gambar 2.8 Proses pembentukan etanol dari glukosa

2.7.3 Mekanisme fermentasi

Didalam fermentasi , kapasitas mikroba untuk mengoksidasi tergantung dari jumlah akseptor elektron terakhir yang dapat dipakai. Sel – sel melakukan fermentasi menggunakan enzim-enzim yang akan mengubah hasil dari reaksi oksidasi , dalam hal ini yaitu asam menjadi senyawa yang memiliki muatan positif, sehingga dapat menangkap elektron terakhir dan menghasilkan energi (Fardiaz, 1990)

Untuk memperoleh hasil fermentasi yang optimum, terdapat hal – hal yang harus dipenuhi untuk pertumbuhan dari sel (Winarno, 1980) yaitu :

- pH dari Reaksi yang berlangsung - Konsentrasi substrat yang digunakan - Temperatur selama fermentasi dan - Kemurnian dari Sel yang digunakan.

Jika tumbuh dalam keadaaan anaerobik, sel Saccharomyces cerevisiae lebih cenderung memfermentasi substrat karbohdirat untuk menghasilkan etanol bersama sedikit produk akhir, sesuai dengan jalur glikolisis menurut Buckle, (1987).

2.8Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan senyawa organik yang mudah menguap. Senyawa yang dapat dipisahkan dengan kromatografi gas sangat banyak, namun ada batasan-batasannya. Senyawa tersebut harus mudah menguap dan stabil pada temperatur pengujian. Temperatur ini berkisar 50-300oC. Jika senyawa yang diuji tidak dapat menguap dan stabil pada temperatur pengujian, maka senyawa tersebut bisa diderivatisasi agar dapat dianalisis dengan kromatografi gas (Mardoni et al, 2007).

Penentuan kadar etanol yang terdapat dalam sampel dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi gas (GC). Metode ini dapat digunakan karena metode ini mampu memisahkan zat-zat organik (berupa cairan komplek), waktu analisis relatif singkat, jumlah sampel yang dibutuhkan untuk analisis relatif kecil, dan kepekaan tinggi (Munson, 1981).

Kromatografi gas, fase geraknya berupa gas inert, sedangkan fase diamnya dapat berupa zat padat atau zat cair. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya (Khopkar, 2003).

2.9Mikroskop cahaya

Mikroskop cahaya merupakan jenis mikroskop yang menggunakan cahaya matahari atau lampu sebagai sumber cahaya. Pada dasarnya mikroskop cahaya bekerja sebagai suatu alat pembesar tingkat dua. Suatu lensa objektif melakukan pembesaran awal, dan suatu lensa okuler ditempatkan sedemikian rupa sehingga memperbesar bayangan pertama untuk kedua kalinya. Pembesaran seluruhnya diperoleh dengan mengalikan kekuatan pembesaran lensa objektif dan lensa okuler.

Untuk dapat melihat bagaimana interaksi dari penyusun bead, dapat dilakukan menggunakan mikroskop cahaya, hal ini berlandaskan bahwa pada setiap penyusun dari

bead memiliki bentuk permukaan yang berbeda. Melalui mikroskop cahaya masing-masing penyusun dapat dilihat dari bentuk permukaan yang berbeda-beda sehingga dapat ditentukan komponen penyusun dari bead.

Liouni (2007) menggunakan mikroskop cahaya sebagai alat untuk melihat jumlah

bead yang rusak dari pengujian stabilitas mekanik dari bead. Mikroskop cahaya dapat digunakan sebagai alat untuk melihat permukaan dari bead dikarenakan perbesaran hingga 1000x sehingga dapat dijadikan cara untuk melihat pori dan permukaan dari benda. Bead

yang terbentuk dan yang digunakan dalam fermentasi juga dianalisis menggunakan mikroskop cahaya dikarenakan mikroskop cahaya mudah dalam penggunaan, biaya operasional relatif murah dan menghasilkan gambar yang jelas.

Metode ini berdasarkan pada adsorpsi fisika dari protein enzim pada permukaan pembawa yang tidak larut dalam air. Kelemahan dari metode ini dimana enzim yang diserap dapat bocor selama pemakaian karena gaya ikat antara protein enzim dan pembawa lemah.

b. Metode pengikatan ionik

Metode pengikatan ionik berdasarkan pengikatan ionik dari protein enzim pada pembawa yang tidak larut dalam air yang mengandung residu penukar ion. Kelemahan metode ini dimana kebocoran dapat terjadi dimana dalam larutan substrat dengan kekuatan ionik yang tinggi atau pada variasi pH.

c. Metode pengikatan kovalen

Pada metode ini diperlukan kondisi reaksi yang sulit dan biasanya dilakukan tidak dalam keadaan kamar. Dalam beberapa kasus, ditemukan bahwa ikatan kovalen mengubah bentuk konformasi dan pusat aktif enzim yang mengakibatkan kehilangan aktivitas atau perubahan spesifitas aktivitas.

2.Metode Ikat Silang

Metode ini berdasarkan pembentukan ikatan kimia seperti dalam metode ikat kovalen,namun pembawa yang digunakan tidak larut dalam air. Imobilisasi enzim dilakukan dengan pembentukan ikat silang intermolekuler diantara molekul enzim dengan penambahan reagent bi-atau multifungsional.

3. Metode Penjebakan

Metode penjebakan berdasarkan pengikatan enzim dalam kisi matriks polimer atau melingkupi enzim dalam membran semipermiabel dan dibagi menjadi tipe kisi dan mikrokapsul.

a. Tipe kisi (lattice type)

Metode penjebakan tipe kisi meliputi penjebakan enzim dalam bidang batas (intersititial space) dari suatu ikat – silang yang tidak larut dalam air misalnya gel matriks.

b. Mikrokapsul

Penjebakan dengan cara mikrokapsul melibatkan pelingkupan enzim dengan membran polimer semipermiabel.Prosedur untuk mikroenkapsulasi enzim dapat dibagi kedalam tiga kategori (Chibata,1978) yaitu :

1. Polimerisasi interfasial

2. Pengeringan cair (liquid drying) 3. Pemisahan fase (phase separation)

Teknik penjebakan yang umum untuk mikroorganisme dalam butiran adalah pembentukan gel ionotropik dari makromolekul dengan kation multivalensi. Penjebakan dapat terjadi dengan mencampurkan mikroorganisme dengan polimer anionik dan kemudian diikatsilang larutan tersebut dengan kation multivalensi sehingga membentuk struktur yang menjebak mikroorganisme tersebut. (Liouni,2007).

Dalam penelitian kali ini dilakukan teknik mikrokapsul. Dasar dari penggunaan teknik mikrokapsul didasarkan pada kestabilan yang lebih tinggi pada proses fermentasi, sederhana dalam pembuatan dan penggunaan, terjadi interaksi yang kuat, mudah dalam pemisahan produk dan juga mudah dalam modifikasi (Mosbach, 1976).

2.7 Fermentasi

2.7.1 Pengertian Fermentasi

Fermentasi berasal dari bahasa latin ferfere yang artinya mendidihkan, yaitu berdasarkan ilmu kimia terbentuknya gas-gas dari suatu cairan kimia yang pengertiannya berbeda dengan air mendidih. Gas yang terbentuk tersebut di antaranya karbondioksida (CO2) (Afrianti,2004).

Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam kondisi anaerob (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan

tetapi definisi yang lebih jelas mengatakan bahwa fermentasi diartikan sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor electron eksternal (Darmanto, 2006). Fermentasi juga dapat diartikan sebagai perubahan gradual oleh enzim, bakteri, khamir dan jamur. Contoh fermentasi yang ada di kehidupan sehari – hari antara lain pengasaman susu, perubahan gula menjadi alkohol serta oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat et al, 2006).

2.7.2 Pembagian Fermentasi

Menurut Afrianti (2004) fermentasi berdasarkan kebutuhan O2, dapat dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Ferementasi aerob (proses respirasi)

Fermentasi aerob yaitu disimilasi bahan-bahan yang disertai dengan pengambilan oksigen. Semua organisme untuk hidupnya memerlukan sumber energi yang diperoleh dari hasil metabolisme bahan pangan, dimana organisme itu berada. Bahan energi yang paling banyak digunakan mikroorganisme untuk tumbuh adalah glukosa. Dengan adanya oksigen maka mikroorganisme dapat mencerna glukosa menghasilkan air, karbondioksida dan sejumlah besar energi. Contoh : fermentasi asam asetat, asam nitrat, dan sebagainya.

2. Fermentasi anaerob

Fermentasi anaerob yaitu fermentasi yang tidak membutuhkan adanya oksigen, Beberapa mikroorganisme dapat mencerna bahan energinya tanpa adanya oksigen. Jadi hanya sebagian bahan energi itu dipecah, yang dihasilkan adalah sebagian dari energi, karbondioksida dan air, termasuk sejumlah asam laktat, asetat, etanol, asam volatil, alkohol dan ester. Biasanya dalam fermentasi ini menggunkan mikroba yeast, jamur dan bakteri. Fermentasi tipe anaerob menghasilkan sejumlah kecil energi, karbondioksida, air, dan produk akhir metabolik organik lain, seperti asam laktat, asam asetat, dan etanol serta sejumlah kecil asam organik volatil lainnya, alkohol dan ester (Buckle et.al, 1985). Pada

proses fermentasi anaerob mula-mula glukosa dipecah menjadi asam piruvat yang melalui lintasan Embden Meyerhoff Pamas (EMP). Setelah itu terjadi dekarboksilasidehida asam piruvat menjadi asetaldehida. asetaldehida tereduksi menjadi etanol yaitu menerima elektron hasil oksidasi asam gliseraldehida 3- phosphat. Melalui proses fermentasi anaerob ini 90% glukosa akan dirubah menjadi etanol dan CO2 (Ansori, 1989).

Reaksi pada Gambar 2.8 asetaldehida bertindak sebagai penerima hidrogen dalam fermentasi, dimana hasil reduksinya oleh NADH2 menghasilkan etanol, dan NAD yang teoksidasi kemudian dapat digunakan lagi untuk menangkap hidrogen (Fardiaz,1992)

Gambar 2.6 Proses fermentasi glukosa

Gambar 2.8 Proses pembentukan etanol dari glukosa

2.7.3 Mekanisme fermentasi

Didalam fermentasi , kapasitas mikroba untuk mengoksidasi tergantung dari jumlah akseptor elektron terakhir yang dapat dipakai. Sel – sel melakukan fermentasi menggunakan enzim-enzim yang akan mengubah hasil dari reaksi oksidasi , dalam hal ini yaitu asam menjadi senyawa yang memiliki muatan positif, sehingga dapat menangkap elektron terakhir dan menghasilkan energi (Fardiaz, 1990)

Untuk memperoleh hasil fermentasi yang optimum, terdapat hal – hal yang harus dipenuhi untuk pertumbuhan dari sel (Winarno, 1980) yaitu :

- pH dari Reaksi yang berlangsung

- Konsentrasi substrat yang digunakan

- Temperatur selama fermentasi dan

- Kemurnian dari Sel yang digunakan.

Jika tumbuh dalam keadaaan anaerobik, sel Saccharomyces cerevisiae lebih cenderung memfermentasi substrat karbohdirat untuk menghasilkan etanol bersama sedikit produk akhir, sesuai dengan jalur glikolisis menurut Buckle, (1987).

2.8Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan senyawa organik yang mudah menguap. Senyawa yang dapat dipisahkan dengan kromatografi gas sangat banyak, namun ada batasan-batasannya. Senyawa tersebut harus mudah menguap dan stabil pada temperatur pengujian. Temperatur ini berkisar 50-300oC. Jika senyawa yang diuji tidak dapat menguap dan stabil pada temperatur pengujian, maka senyawa tersebut bisa diderivatisasi agar dapat dianalisis dengan kromatografi gas (Mardoni et al, 2007).

Penentuan kadar etanol yang terdapat dalam sampel dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi gas (GC). Metode ini dapat digunakan karena metode ini mampu memisahkan zat-zat organik (berupa cairan komplek), waktu analisis relatif singkat, jumlah sampel yang dibutuhkan untuk analisis relatif kecil, dan kepekaan tinggi (Munson, 1981).

Kromatografi gas, fase geraknya berupa gas inert, sedangkan fase diamnya dapat berupa zat padat atau zat cair. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya (Khopkar, 2003).

2.9Mikroskop cahaya

Mikroskop cahaya merupakan jenis mikroskop yang menggunakan cahaya matahari atau lampu sebagai sumber cahaya. Pada dasarnya mikroskop cahaya bekerja sebagai suatu alat pembesar tingkat dua. Suatu lensa objektif melakukan pembesaran awal, dan suatu lensa okuler ditempatkan sedemikian rupa sehingga memperbesar bayangan pertama untuk kedua kalinya. Pembesaran seluruhnya diperoleh dengan mengalikan kekuatan pembesaran lensa objektif dan lensa okuler.

Untuk dapat melihat bagaimana interaksi dari penyusun bead, dapat dilakukan menggunakan mikroskop cahaya, hal ini berlandaskan bahwa pada setiap penyusun dari bead memiliki bentuk permukaan yang berbeda. Melalui mikroskop cahaya masing-masing penyusun dapat dilihat dari bentuk permukaan yang berbeda-beda sehingga dapat ditentukan komponen penyusun dari bead.

Liouni (2007) menggunakan mikroskop cahaya sebagai alat untuk melihat jumlah bead yang rusak dari pengujian stabilitas mekanik dari bead. Mikroskop cahaya dapat digunakan sebagai alat untuk melihat permukaan dari bead dikarenakan perbesaran hingga 1000x sehingga dapat dijadikan cara untuk melihat pori dan permukaan dari benda. Bead yang terbentuk dan yang digunakan dalam fermentasi juga dianalisis menggunakan mikroskop cahaya dikarenakan mikroskop cahaya mudah dalam penggunaan, biaya operasional relatif murah dan menghasilkan gambar yang jelas.