Penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository

PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM EKSTRAK DAUN
BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :
Robertus Satrio Wibisono
NIM : 068114046

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010

i

PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM EKSTRAK DAUN

BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK

ii

Pengesahan Skripsi Berjudul

iii

HALAM AN PERSEM BAHAN

There’s no elevator to success, you have to take stairs

K itahidupdi duniayangpenuhkeindahan, pesonasertapetualangan.
D ansemuaitutidakakanpernahberakhir selamakitamencarinya
denganmataterbuka. ( J awaharlal N ehru)

Kupersembahkan Karya ini untuk:
Bapak dan Ibuku untuk segala doa, cinta dan perhatiannya.
Vincentia Octavianna, S.Farm. yang selalu ada untukku

A lmamaterku

iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama

: Robertus Satrio Wibisono

Nomor Mahasiswa

: 068114046

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM EKSTRAK DAUN
BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK”
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma

hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Yogyakarta, 8 Juni 2010

Robertus Satrio Wibisono

v

PENGANTAR

Segala pujian dan syukur senantiasa penulis haturkan kepada Tuhan Yesus
Kristus karena hanya dengan anugerah, berkat, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Penetapan
Kadar Asam Ursolat dalam Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.)
Steenis) dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik ”.
Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).
Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan
berbagai pihak yang telah membantu penulis, oleh karena itu, penulis mengucapkan
terima kasih kepada:
1.

Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

2.

Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis
dalam proses penyusunan skripsi ini.

3.

Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si.
selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan saran dan
masukan demi kesempurnaan skripsi ini.

4.

Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. yang telah memberikan dorongan,
dukungan baik secara moral maupun materi kepada penulis

vi

5.

Segenap staff dan karyawan laboratorium kimia analisis instumen dan
kimia organik, Mas Bimo, Mas Parlan dan Pak Timbul terimakasih
atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.

6.

Gayatri Kusuma Wardani teman seperjuangkanku yang telah bersamasama melalui segala sesuatunya dengan kebersamaan, suka duka, dan
canda tawa dalam proses berjalannya penelitian

7.

Seluruh teman-teman farmasi, khususnya kelas A angkatan 2006 dan
FST A 2006 yang telah banyak berbagi keceriaan dan kesedihan

8.

Para teman dan sahabat : Boim, Adit, ChoCho, Boris, Utz, Nyakpeng,
Nika, Reno, Tomplink, Celenk, Rudex, Tony, Pius, Nee, Lul, Mewry,
Lilis, Dotie, Vica, Dissa, Adi, Ius, Willy, Yusri, Kelink, Nita, Sionk,
Simbah terima kasih atas semua canda, tawa, kesedihan, dan
kenakalan yang sangat berkesan bagi penulis

9.

Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi
ini yang tidak dapat disebutkan satu-per satu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan
dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu
penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir
kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.
Yogyakarta, 8 Juni 2010

Penulis
vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini,
tidak memuat karya atau bagian orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana karya ilmiah.

Yogyakarta, 8 Juni 2010
Penulis

Robertus Satrio Wibisono

viii

INTISARI
Daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) memiliki aktivitas
sebagai antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan, antiinfasif, dan antiulcer.
Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat kandungan asam ursolat dalam
ekstrak daun binahong , dimana asam ursolat merupakan salah satu zat yang
memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan,
antiinfasif,dan antiulcer. Penelitian kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun
binahong ini menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase
terbalik.
Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian deskriptif noneksperimental.
Tahap pertama dari penelitian ini adalah pembuatan ekstrak daun binahong dari daun
binahong yang telah dikeringkan dengan menggunakan metode ekstraksi refluks.
Selanjutnya, asam ursolat dianalisis secara kuantitatif dengan menggunakan metode
KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom Kromasil 100-5 C18 dan komposisi fase
gerak metanol : ortophosphoric acid 1% (90 : 10) dengan kecepatan alir 0.6

ml/menit, serta detector UV 210nm yang telah divalidasi.
Berdasarkan analisis yang dilakukan, didapatkan hasil bahwa sampel ekstrak
daun binahong yang digunakan dalam penelitian ini mengandung asam ursolat
dengan kadar rata-rata 0,0525 ± 0,0089 %b/b.
Kata kunci : ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), asam
ursolat, ekstraksi, KCKT fase terbalik

ix

ABSTRACT
Binahong’s leaf (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) have activity as
antiinflammatory, antitumor, anticancer, antioxidant, antiinfasif, antiulcer, etc..
Results from this study indicate that there ursolic acid content in leaf extracts
binahong where ursolic acid is one substance that is known to have activity as an
antiinflammatory, antitumor, anticancer, antioxidant, antiinfasif, antiulcer, etc..
Research ursolic acid content in the leaf extract binahong uses high-performance
liquid chromatography (HPLC) reversed phase method.
This research was included in the descriptive non experimental. The first
phase of this research is making binahong’s leaf extract from binahong as dried
leaves using the reflux extraction method. Further, ursolic acid was analyzed

quantitatively by reversed phase HPLC method with a stationary phase Kromasil
100-5 C18 column and mobile phase composition of methanol: ortophosphoric acid
1% (90: 10) with a flow rate of 0.6 ml / min, and a 210nm UV detector has been
validated.
Based on the results of analysis conducted, the result shows that the leaf
extract samples binahong used in this study contains ursolic acid with an average
grade
of
0,0525
±
0,0089%
b
/
b.

Key words: leaf extract binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), ursolic acid,
extraction, reversed phase HPLC

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL.................................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.......................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN.................................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................................. iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH
UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ...................................................................v
PENGANTAR............................................................................................................ vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................................... viii
INTISARI................................................................................................................... ix
ABSTRACT.................................................................................................................. x
DAFTAR ISI............................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL...................................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR................................................................................................ xvi
DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................... xvii
BAB I. PENGANTAR
A. Latar Belakang..................................................................................... 1
B. Permasalahan............................................................................................ 2
C. Keaslian penelitian.................................................................................... 3
D. Manfaat penelitian..................................................................................... 3

xi

E. Tujuan Penelitian...................................................................................... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
A. Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis......................................... 5
B. Ekstraksi.................................................................................................... 5
C. Asam Ursolat............................................................................................ 6
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
1. Definisi KCKT..........................................................................7
2. Kromatografi Partisi Fase Terbalik...........................................8
3. Detektor.....................................................................................9
4. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif..............................9

E. Parameter Validasi Metode Analisis
1. Akurasi....................................................................................10
2. Presisi......................................................................................11
3. Spesifisitas/Selektivitas...........................................................11
4. Linearitas dan Rentang...........................................................12
5. Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitative (LOQ).12

F. Landasan Teori.........................................................................................13
G. Hipotesis.................................................................................................. 14
BAB III. METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian............................................................... 15
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.......................................... 15

xii

C. Bahan....................................................................................................... 16
D. Alat........................................................................................................... 16
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman........................................................................ 16
2. Preparasi Sampel
a. Pemilihan Sampel.............................................................17
b. Pengeringan Sampel..........................................................17
c. Ekstraksi Sampel...............................................................17
3. Pembuatan Fase Gerak....................................................................... 18
4. Pembuatan Larutan Baku Asam Ursolat
a.

Pembuatan Larutan Induk Asam Ursolat.........................18

b.

Pembuatan Larutan Intermediet Asam Ursolat................18

5. Pembuatan Kurva Baku..................................................................... 18
6. Analisis Validasi Metode KCKT
a.

Akurasi.............................................................................19

b.

Presisi...............................................................................19

c.

Linearitas..........................................................................20

d.

LOD dan LOQ..................................................................20

7. Pembuatan Larutan Sampel................................................................20
8. Penetapan recovery Sampel................................................................21
9. Penetapan Kadar Asam Ursolat..........................................................21
F. Analisis Hasil............................................................................................22
xiii

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak............................................................................ 23
B. Pembuatan Kurva Baku Asam Ursolat................................................... 24
C. Determinasi Tanaman..............................................................................27
D. Preparasi Sampel......................................................................... ............27
E. Penentuan Recovery, Kesalahan Acak dan Kesalahan Sistemik..............29
F. Penetapan Kadar Asam Ursolat...............................................................31
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan.............................................................................................. 38
B. Saran........................................................................................................ 38
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................ 39
LAMPIRAN............................................................................................................... 42
BIOGRAFI PENULIS............................................................................................. 61

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I.

Data Recovery........................................................................................11

Tabel II.

Data Kurva baku....................................................................................25

Tabel III.

Nilai recovery asam ursolat.................................................................. 30

Tabel IV.

Hasil penetapan kadar asam ursolat...................................................…36

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Struktur Asam Ursolat.............................................................................7

Gambar 2.

Instrumen KCKT.................................................................................... 8

Gambar 3.

Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Metanol Dalam Fase
Gerak………......………….……………............................…...………24

Gambar 4.

Kurva hubungan massa vs AUC kurva baku replikasi I….…...………26

Gambar 5.

Kromatogram Baku...............................................................................32

Gambar 6.

Kromatogram Sampel………………………………...........………….33

Gambar 7.

Kromatogram Hasil Pemisahan Sampel recovery................................ 34

Gambar 8.

Kromatogram hasil pemisahan sampel spiking……………………….35

xvi

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1.

Pembuatan larutan stok dan seri larutan baku asam ursolat.…...……42

Lampiran 2.

Penetapan kurva baku……………………...……………….……….46

Lampiran 3.

Perhitungan LOD dan LOQ………………………………...….……47

Lampiran 4.

Penimbangan daun binahong………………………...………….…..48

Lampiran 5.

Penimbangan rendemen ekstrak daun binahong……………...….….48

Lampiran 6.

Perhitungan recovery, kesalahan acak, dan kesalahan sistemik....….49

Lampiran 7.

Contoh perhitungan kadar asam ursolat berdasarkan parameter AUC
……………………....…………………………………………….....49

Lampiran 8.

Kromatogram Sampel……………………….………………………52

Lampiran 9.

Surat Determinasi Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)....60

xvii

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dewasa ini mulai banyak dikembangkan pembuatan sediaan obat dari bahan
alam dan telah banyak beredar di pasaran. Pengalihan cara pandang dari penggunaan
bahan kimia sintesis menjadi penggunaan bahan alam sebagai sumber pengobatan
tidak dipungkiri karena adanya efek samping yang ditimbulkan dengan penggunaan
obat dari zat-zat kimia, sehingga telah merubah cara pandang masyarakat untuk lebih
memilih obat yang berbahan dasar bahan alam dengan harapan untuk memperkecil
efek samping yang dapat ditimbulkan.
Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) merupakan tanaman
dengan banyak kandungan zat yang memiliki khasiat antioksidan terutama pada
bagian daunnya. Tanaman binahong mengandung asam askorbat dan total fenol yang
cukup tinggi (Uchida et.al., 2003). Khasiat lain pada tanaman binahong adalah
sebagai antiinflamasi, antitumor, antikanker, antioksidan, antiinfasif, antiulcer,
hepatoprotektif, gastroprotektif, dsb. (Liao, 2005). Penelitian ini ingin mengetahui
kadar salah satu kandungan dalam tanaman binahong yaitu asam ursolat. Pada
penelitian sebelumnya, asam ursolat biasa dijumpai pada tanaman ceri hitam (Prunus
serotina Ehrh.), Eriobotrya japonica, Rosmarinus officinalis, dan Glechoma
hederaceae (Cha, 1996).
Menurut Wojciak (2007), asam oleanolat, asam ursolat, dan asam betulinat
dapat dijumpai pada Folium Salviae (Salvia oficinalis L.), Folium Plantaginis
1

2

lanceolatae (Plantago lanceolata L.), dan Flos Lamii albi (Lamium album L.).
Tanaman yang mengandung asam oleanolat dimungkinkan pula mengandung asam
ursolat. Hal ini dikarenakan asam oleanolat merupakan isomer dari asam ursolat,
yang berbeda posisi gugus metilnya pada atom karbon nomor 19 dan 20.
Asam ursolat adalah salah satu zat yang dapat menimbulkan aktivitas
antiinflamasi,

antitumor,

antikanker,

antioksidan,

antiinfasif,

antiulcer,

hepatoprotektif, gastroprotektif (Liao,2005). Mengingat pentingnya manfaat asam
ursolat, maka dalam penelitian ini penulis mencoba menganalisa ada atau tidaknya
kandungan asam ursolat dalam tanaman binahong. Penelitian ini juga bertujuan untuk
menghitung kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong dengan menggunakan
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang telah memiliki
validitas yang baik, dimana nilai validitas yang baik dilihat dari nilai akurasi, presisi,
liniearitas, serta LOD dan LOQ yang memenuhi persyaratan. Alasan pemilihan
metode Kromatogafi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik adalah menilik bahwa
sampel yang digunakan adalah bahan alam murni tanpa dilakukan isolasi, sehingga
diperlukan suatu sistem kromatografi dengan sensitifitas pemisahan tinggi dan
persyaratan ini dapat diakomodasi oleh metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) fase terbalik.
B. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang diatas, maka dapat disusun permasalahan sebagai
berikut :

3

1. Apakah terdapat kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman
binahong?
2. Berapakah kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong yang
akan ditetapkan kadarnya menggunakan metode Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik yang telah tervalidasi?
C. Keaslian Penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, penelitian dengan menggunakan tanaman
binahong (sudah sering dilakukan di Indonesia, antara lain :
1.

Formulasi Gel Antiluka Ekstrak Daun Binahong (Anredera baselloides
(Ten.) Steenis) dengan Basis Carbopol (Setyaningretry,2007).

2.

Optimasi Formula Span 80 dan Tween 80 dalam cold cream Obat Luka
Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) steenis) dengan
Metode Simplex Lattice Design (Paramita, 2008).

Namun penelitian berkaitan dengan kandungan asam ursolat dalam ekstrak
daun binahong belum pernah dilakukan.
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai berikut :
1. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat mengetahui kandungan
asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong.
2. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan
prosedur penggunaan metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar
asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong.

4

E. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini
bertujuan untuk :
1. Mengetahui ada tidaknya kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun
tanaman binahong.
2. Menetapkan kadar asam ursolat yang terkandung dalam ekstrak daun
tanaman binahong menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) Fase Terbalik yang telah tervalidasi.

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Binahong
Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) termasuk dalam
family Basellaceae. Tanaman binahong merupakan tumbuhan menjalar, berumur
panjang (perenial), dan bisa mencapai panjang 5 m. Batangnya lunak, berbentuk
silindris, saling membelit, dan berwarna merah. Daun dari tanaman ini bertangkai
sangat pendek (subsessile), susunannya berseling, berwarna hijau, dan berbentuk
jantung (cordata). Bunganya majemuk berbentuk tandan, bertangkai panjang, muncul
di ketiak daun. Akarnya berbentuk rimpang, berdaging lunak (Hidayati, 2009).
Tanaman binahong mempunyai beberapa kandungan kimia, seperti asam
oleanolat, asam ursolat, asam askorbat, fenol, minyak atsiri, ancordin, dsb.
(Lazuardhi, 2009).
B. Ekstraksi
Ekstraksi adalah penyarian zat berkhasiat atau zat aktif dari bagian tanaman
obat, hewan, dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di
dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula kekebalannya,
sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu. Tujuan dari ekstraksi
bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang terdapat pada bahan alam.
Ekstraksi didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut
(Dirjen POM, 1986).

5

6

Ekstraksi digesti merupakan ekstraksi maserasi dengan menggunakan
pemanasan lemah. Cara maserasi ini hanya dapat digunakan untuk simplisia yang zat
aktifnya tahan terhadap panas (Haryono, 1986).
Keuntungan ekstraksi digesti antara lain :
1. Kekentalan pelarut berkurang yang dapat mengakibatkan berkurangnya
lapisan batas.
2. Daya melarutkan cairan meningkat karena pemanasan.
3. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu dan berbanding terbalik
dengan kekentalan sehingga peningkatan suhu berpengaruh pada kecepatan
difusi umumnya peningkatan kelarutan terjadi jika suhu juga ditingkatkan
(Haryono, 1986).
C. Asam Ursolat
Asam ursolat merupakan golongan senyawa triterpen pentasiklik (Wojciak
dan Kosior, 2007). Senyawa ini dapat ditemui pada tumbuhan apel, basil, bilberries,
cranbarries, dsb. Senyawa ini mempunyai berat molekul sebesar 456.70 g/mol
(Olszewska, 2008).
Asam ursolat dikenal mempunyai berbagai macam khasiat, seperti antiinvasif,
antiinflamasi, antiulcer, antiaterosklerosis, dan hepatoprotektif (Liao&Wei, 2005).
Selain itu, asam ursolat mempunyai khasiat sebagai anti tumor, anti-HIV,
antimikroba, antifungi, dan antihiperlipidemia (Wojciak dan Kosior, 2007).

7

CH3
CH3

O
CH3

H

CH3

C
OH

H
H

CH3

O
H3C

H
CH3

Gambar 1. Struktur asam ursolat

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
1. Definisi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi adalah suatu sistem kromatografi yang fase
geraknya dialirkan dengan cepat dengan bantuan pompa dan hasilnya dideteksi
dengan detektor (Gritter dkk., 1985). Tujuan analisis dengan KCKT yaitu didapatkan
pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat (Mulja, 1995).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) berdasarkan sistem peralatannya
termasuk kromatografi kolom karena dipakai fase diam yang ter”packing” di dalam
kolom, sedangkan berdasarkan proses pemisahannya KCKT digolongkan sebagai
kromatografi partisi dan kromatografi adsorbsi. Prinsip kromatografi partisi
didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tidak bercampur yang ada pada
fase diam dan fase gerak. Fase diam (polar atau nonpolar) disalutkan pada penyangga
dan dikemas ke dalam kolom. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri
dari dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang,
linarut akan tersebar antara dua fase menurut persamaan :

8

K

Cs
Cm

dengan K adalah koefisien distribusi, Cs dan Cm adalah konsentrasi linarut berturutturut dalam fase diam dan fase gerak (Johnson & Stevenson, 1978).

Gambar 2. Instrumen KCKT (Kazakevich and Mc.Nair, 1996).

2. Kromatografi Partisi Fase Terbalik
Prinsip kromatografi partisi didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut
yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Fase diam (polar atau
nonpolar) disalutkan pada penyangga dan dikemas ke dalam kolom. Jika linarut
ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan
keseluruhan sistem dibiarkan setimbang (Johnson & Stevenson, 1978).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi partisi
fase terbalik adalah :

9

a. Kolom. Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini ialah kemasan
fase terikat. Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase
terbalik adalah oktadesilsilan (ODS).
b. Fase gerak. Fase gerak pada KCKT sangat berpengaruh pada tambatan sampel
dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase terbalik, kandungan
utama fase geraknya adalah air (Munson, 1984).
3. Detektor
Detektor yang baik hendaknya memiliki kepekaan tinggi, rentang respon
liniernya lebar, tidak dipengaruhi suhu dan aliran, serta memberikan hasil dengan
keterulangan yang baik. Secara umum, detektor dibagi menjadi 2 kategori yaitu :
a. Bulk property detektor. Detektor jenis ini merupakan detektor yang mengukur
perubahan sifat fisik fase gerak dan solut.
b. Solute property detectors. Detektor ini merupakan detektor yang hanya
mengukur sifat fisik solut. Detektor tipe ini 1000 kali lebih sensitif dan
mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi
(Munson, 1984).
4. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif
Waktu tambat atau waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan oleh
solut mulai dari injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh
detektor dan dinyatakan sebagai tr (Mulja dan Suharman, 1995).

10

Resolusi (Rs) merupakan jarak antara dua puncak dibagi dengan rata-rata
lebar dasar puncak. Resolusi dikatakan baik apabila nilai RS ≥ 1.5 yang berarti
pemisahannya telah mencapai 99.7% (Sastrohamidjojo, 2002).
Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi
senyawa murni dan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel. Respon
yang diperoleh berupa peak atau luas area peak dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif (Noegrohati, 1994).
E. Parameter Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi
metode analisis antara lain:
1.

Akurasi
Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan

hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).
Kriteria % perolehan kembali yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada
matriks dapat dilihat pada tabel di bawah ini:

11

Tabel I. Recovery (Harmita, 2004)

2.

Presisi
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang-ulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran
yang homogen. Presisi dinyatakan dalam koefisien variasi (KV). Suatu metode dapat
dikatakan baik apabila memiliki KV < 2% (Harmita, 2004).
3.

Spesifisitas/Selektivitas
Spesifisitas atau selektivitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya

mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifisitas dapat dinyatakan sebagai
derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung
bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing

12

lainnya, dan dibandingkan dengan sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan (Harmita, 2004).
4.

Linearitas dan rentang
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu) untuk

mendapatkan hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit di
dalam sampel. Rentang adalah jarak antara level terbawah dan teratas dari metode
analisis yang telah dipakai untuk mendapatkan presisi, akurasi dan linieritas yang bisa
diterima (Anonim, 2007).
5.

Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitative (LOQ)
Limit Of Detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko.
LOD merupakan parameter uji batas. Limit Of Quantitative (LOQ) merupakan
parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam
sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).
LOD dan LOQ dapat dihitung dengan rumus:
a. Limit Of Detection

13

b. Limit Of Quantitative

dengan Sy/x adalah simpangan baku, dan Sl adalah slope atau nilai b pada
persamaan garis y = bx + a (Harmita, 2004).
F. Landasan Teori
Tanaman binahong diketahui memiliki beberapa kandungan kimia golongan
triterpenoid salah satunya adalah asam ursolat. Asam ursolat merupakan golongan
senyawa triterpen pentasiklik. Asam ursolat dikenal mempunyai berbagai macam
khasiat,

seperti

antiinvasif,

antiinflamasi,

antiulcer,

antiaterosklerosis,

dan

hepatoprotektif.
Metode KCKT fase terbalik mempunyai daya pisah yang tinggi yang bisa
memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun tanaman binahong.
Asam ursolat merupakan senyawa yang memiliki gugus polar sehingga pada metode
KCKT ini digunakan Metode KCKT fase terbalik.
Kondisi dan validitas pemisahan asam ursolat dari senyawa lain dalam ekstrak
daun tanaman binahong telah divalidkan dan dilakukan lewat penelitian Wardani
(2010).

14

G. Hipotesis
1. Terdapat kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong.
2. Kadar asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong dapat ditetapkan
menggunakan metode KCKT fase terbalik yang mempunyai validitas
metode yang baik.

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif noneksperimental.
Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena penelitian ini hanya mendeskripsikan
keadaan yang ada dan merupakan jenis penelitian noneksperimental karena tidak
dilakukan manipulasi terhadap subjek uji.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi variabel
a. Variabel bebas. Ekstak daun binahong
b. Variabel tergantung. Kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong.
c. Variabel pengacau terkendali. Variasi kadar baku asam ursolat dan kadar
sampel yang disebabkan adanya pengotor pada sistem KCKT.
2. Definisi operasional
a. Asam ursolat yang ditetapkan kadarnya adalah asam ursolat yang terkandung
dalam ekstrak daun binahong.
b. Ekstrak daun binahong didapatkan dari ekstraksi dengan menggunakan
metode refluks serta menggunakan pelarut metanol dan kloroform.
c. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT
dengan fase diam kolom reversed phase Kromasil 100-5 C18 250 x 4,6 mm
dan fase gerak campuran metanol dan ortophosphoric acid, dengan
perbandingan 90:10.
15

16

C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ortophosphoric acid
(p.a. Merck), kloroform (p.a. Merck), metanol (p.a. Merck), aquabidest (PT.
Ikapharmindo Putramas), ekstrak daun binahong, dan standar asam ursolat (Sigma).
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat KCKT yang
terdiri dari pompa merek Shimadzu LC-10 AD, detektor UV Vis merek Shimadzu
SPD 10 AV, CBM 101 merek Shimadzu, seperangkat komputer merek ACER, printer
merek Hewlett Packard Deskjet 670 C, injektor jenis katup suntik model 77251,
kolom C-18 merek Knauer 4,6 mm x 25 cm, syringe merek Hamilton Part, alat
degassing ultrasonik merek Retsch tipe T640, penyaring Whatmann anorganik dan
organik, membran filter merek Whatman, neraca analitik merek Scaltec SBC 22,
vakum merek Gast model DOA-P104-BN, Milipore ukuran pori 0,45 µm, pendingin,
labu alas bulat, penangas air, rotari evaporator, seperangkat alat gelas.
E. Tata Cara Penelitian
1.

Determinasi Tanaman Binahong
Determinasi tanaman binahong dilakukan dengan membandingkan dengan

Flora of Java. Kemudian tanaman binahong dibuat herbariumnya dalam bentuk
kering meliputi akar, batang dan daun.

17

2.

Preparasi Sampel
a. Pemilihan sampel
Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong

yang dikeringkan.

Sampel yang digunakan direplikasi sebanyak 3 kali dan dibuat triplo di setiap
replikasinya.
b. Pengeringan sampel.
Lebih kurang 100 gram daun segar tanaman binahong dibersihkan sampai
bersih dengan air mengalir. Daun segar tersebut kemudian dipotong-potong dan
dilakukan proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 60⁰C.
c.

Ekstraksi sampel
Ditimbang sebanyak 5 gram daun binahong kering kemudian diekstraksi

selama 30 menit dengan pelarut kloroform sebanyak 30 ml (ekstraksi I). Ekstrak
yang didapatkan kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring. Residu
ekstraksi I kemudian di ekstraksi kembali dengan campuran pelarut kloroform :
metanol (1:1 v/v) sebanyak 30 ml selama 30 menit (ekstraksi II). Ekstrak dari hasil
ekstraksi II kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dicampur dengan
hasil ekstraksi I yang kemudian dilakukan evaporasi ekstrak sampai pelarut
teruapkan sempurna yang ditandai dengan tinggal tersisa rendemen kering pada
labu alas bulat pada suhu 70⁰C. Rendemen hasil evaporasi kemudian dilarutkan
dengan metanol sampai 25 ml.

18

3.

Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran antara

metanol dengan ortophosphoric acid 1% dengan perbandingan 90:10 (v/v).
Ortofosforic acid 1% dibuat dengan melarutkan 0.58 ml ortophosphoric acid dalam
50.0 ml aquabidest. Campuran metanol : ortophosphoric acid 1% 90:10 (v/v) ini
kemudian disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa
vakum dan kemudian di degassing dengan menggunakan ultrasonicator selama 15
menit.
4.

Pembuatan Larutan Baku Asam Ursolat
a. Pembuatan larutan induk asam ursolat
Larutan induk asam ursolat dibuat dengan cara menimbang seksama sebanyak
0.01 gram baku asam ursolat, kemudian dilarutkan dalam campuran kloroform
metanol 1:4 (v/v) sampai 10 ml.
b. Pembuatan larutan intermediet asam ursolat
Larutan intermediet asam ursolat dibuat dengan cara mengambil 1.0 ml
larutan baku asam ursolat, kemudian ditambahkan dengan pelarut campuran
kloroform metanol 1:4 (v/v) sampai 10 ml. Asam ursolat dengan konsentrasi 94.4
µg/ml ini kemudian disaring dengan millipore dan di degassing dengan
menggunakan ultrasonicator selama 15 menit.

5.

Pembuatan Kurva Baku
Larutan intermediet asam ursolat yang dibuat dengan konsentrasi 94.4 µg/ml

dimasukkan ke dalam tray dan dibuat seri volume injek dengan volume 2.0; 4.0; 6.0;

19

8.0; dan 10.0 µl, kemudian disuntik dengan kecepatan alir fase gerak yang optimum
dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum asam ursolat. Area Under Curve
(AUC) dapat dilihat dari kromatogram pada waktu retensi yang sesuai dengan waktu
retensi asam ursolat. Dibuat kurva regresi linier yang menyatakan hubungan antara
kadar asam ursolat vs AUC, kemudian ditentukan nilai koefisien korelasinya.
6.

Analisis Validitas Metode KCKT
Parameter-parameter yang digunakan sebagai pedoman kesahihan suatu

metode analisis antara lain :
a. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dalam persen (%) perolehan kembali
recovery yang dihitung dengan cara sebagai berikut
Rumus Recovery =

x 100%
(Mulja dan Hanwar, 2003).

Metode analisis dikatakan memiliki nilai akurasi yang baik apabila nilai
recovery larutan baku asam ursolat berada pada rentang 98%-102% (Harmita,
2004)
b. Presisi
Presisi metode analisis dinilai berdasarkan koefisien variasi yang dihitung
dengan cara sebagai berikut
KV =

x 100%
(Harmita, 2004).

20

Metode analisis dikatakan baik jika nilai KV < 2% (Harmita, 2004).
c. Linearitas
Linearitas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri larutan
baku asam ursolat. Suatu metode analisis dikatakan memiliki linearitas yang
baik jika nilai r > 0.99 atau r2 > 0.997 (Chan dkk., 2004). Rentang ditentukan
dari kadar asam ursolat yang digunakan dalam analisis, mulai dari kadar
terkecil hingga paling tinggi.
d. Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitative (LOQ)
LOD dan LOQ dapat dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut.
Limit Of Detection

(Harmita, 2004).
Limit Of Quantitative

(Harmita, 2004).
7.

Pembuatan larutan sampel
Rendemen hasil evaporasi yang dilarutkan dengan metanol sampai 25 ml,

kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dilarutkan dengan campuran klorform : metanol
1:4 (v/v) sampai volume 10 ml. Larutan sampel tersebut kemudian disaring dengan
menggunakan millipore dan di degassing dengan menggunakan ultrasinicator selama

21

15 menit dan dimasukkan ke dalam tray dan di injeksikan pada sistem KCKT dengan
volume injeksi 50 µl. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan dilakukan triplo untuk
setiap replikasi.
8.

Penetapan Recovery Sampel
Satu mililiter larutan intermediet asam ursolat yang dibuat dengan konsentrasi

94.4 µg/ml ditambahkan dengan sampel ekstrak daun binahong sampai volume 10
ml, kemudian disaring dengan millipore dan di degassing dengan ultrasonicator
selama 15 menit dimasukkan ke dalam tray dan dibuat seri volume injek dengan
volume 2,0; 6,0; dan 10,0 µl, kemudian disuntik dengan 3 kali replikasi dengan
kecepatan alir fase gerak yang optimum dan dideteksi pada panjang gelombang
maksimum asam ursolat. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali sehingga diperoleh 9
data. Dari kromatogram dilihat AUC pada waktu retensi sesuai dengan dengan waktu
retensi asam oleanolat. Kadar asam ursolat dihitung dengan memasukkan harga AUC
ke persamaan kurva baku yang diperoleh.
9.

Penetapan kadar asam ursolat
Larutan sampel diinjeksikan pada sistem KCKT dengan fase diam Kromasil

100-5 C18 250 x 4.6 mm, fase gerak campuran metanol dan ortophosphoric acid
dengan perbandingan 90:10 (v/v), serta kecepatan alir 0.6 ml/menit. Injeksikan 50 µl
dengan detector yang diatur pada panjang gelombang 210 nm (Olszewska, 2008).
Nilai AUC sampel yang dimasukkan ke dalam masing-masing persamaan kurva baku
asam ursolat akan didapatkan kadar asam ursolat dalam sampel. Injeksi sampel

22

dilakukan sebanyak 3 kali dan dilakukan triplo pada masing-masing pengulangan
untuk menghitung recovery dengan rumus :
Rumus Recovery =

x 100%
(Mulja dan Hanwar, 2003).
F. Analisis Hasil

Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis kuantitatif
dengan penetapan kadar asam ursolat berdasarkan analisis data AUC sampel serta
kurva baku asam ursolat. Penelitian ini menggunakan jenis statistika deskriptif dan uji
statistika yang dipakai adalah regresi linier karena penelitian ini termasuk dalam jenis
penelitian deskriptif noneksperimental.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT ini adalah campuran
metanol dengan orthophosporic acid 1% dengan perbandingan 90:10 (v/v).
Orthophosporic 1% dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 0.58 ml orthophosporic
85% kemudian diencerkan dengan aquabidest sampai volume 50.0 ml. Fase gerak
sebelum diaplikasikan pada sistem KCKT terlebih dahulu disaring dengan
menggunakan membran fiter merek Whatman dengan bantuan pompa vakum, hal ini
bertujuan untuk menghilangkan pengotor dan partikel-partikel sebelum masuk ke
sistem KCKT, setelah disaring fase gerak di degassing selama 15 menit. Proses ini
bertujuan untuk menghilangkan gelembung. Karena seperti dikatahui adanya
gelembung dapat mengganggu kinerja sistem KCKT yaitu dapat menyumbat kolom.
Fase gerak campuran metanol dan orthophosporic ini memiliki kepolaran
yang tinggi, digunakan fase gerak yang bersifat polar dikarenakan analit asam ursolat
yang mempunyai gugus polar, sehingga nantinya asam ursolat akan mengalami
resolusi yang maksimal dengan pemilihan fase gerak yang tepat. Penggunaan fase
gerak yang bersifat polar ini ikut menentukan dalam sistem KCKT yang digunakan,
kondisi ini merupakan jenis sistem KCKT fase terbalik karena fase gerak lebih polar
dibandingkan dengan fase diamnya.

23

24

Gugus polar yang ada dalam asam ursolat akan berinteraksi dengan fase
gerak melalui ikatan hidrogen. Semakin banyak gugus polar yang dimiliki oleh suatu
senyawa, maka akan semakin banyak ikatan hidrogen yang terbentuk sehingga
afinitas antara fase gerak dengan gugus polar suatu senyawa semakin besar dan akan
semakin cepat terelusi karena konsentrasi linarut dalam fase gerak lebih besar.
CH3
CH3

OCH3
H
O

CH3

CH3

H

C

CH3
H

O
H

O
H

O
H

CH3

H
CH3

CH3

O

H

H

O

CH3

H

CH3

OCH3

Gambar 3. Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Metanol Dalam Fase
Gerak

B. Pembuatan Kurva Baku Asam Ursolat
Pembuatan kurva baku bertujuan untuk memperoleh persaman regresi linier
yang selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar asam ursolat dalam sampel
ekstrak daun binahong. Linieritas suatu kurva baku menunjukkan bahwa kenaikan

25

respon yang terjadi dikarenakan deteksi instrumen sebanding dengan kenaikan
konsentrasi baku yang digunakan. Parameter linieritas suatu kurva ditentukan dengan
nilai koefisien korelasi (r) lebih besar dari 0,999 (Snyder et al., 1997).
Lima variasi konsentrasi injeksi dibuat untuk menentukan persamaan kurva
baku yakni 2.0; 4.0; 6.0; 8.0; dan 10.0 µl baku asam ursolat yang kemudian
diinjeksikan ke sistem instrumen KCKT dan dibaca oleh detektor pada panjang
gelombang overlapping asam ursolat yaitu 210 nm. Dilakukan tiga kali replikasi
untuk setiap seri konsentrasi dengan tujuan untuk mencari nilai koefisien korelasi (r)
yang terbaik yakni lebih besar dari 0.999.
Persamaan regresi linier yang didapatkan merupakan hubungan antara massa
asam ursolat vs AUC. Hasil dari penetapan kurva baku dapat dilihat pada tabel
dibawah ini
Tabel II. Data kurva baku
Volume
Injek
(µl)
2
4
6
8
10

Persamaan
Kurva
Baku

Replikasi I
Massa
Baku
AUC
(µg)
0.1888
124308
0.3776
250582
0.5664
378897
0.7552
506832
0.9440
635246
A = -4264.8
B = 676973.5169
r = 0.999995

Replikasi II
Massa
Baku
AUC
(µg)
0.1998
129600
0.3996
265904
0.5994
396144
0.7992
531983
0.9990
664154
A = -2999.1
B = 668261.7618
r = 0.999979

Replikasi III
Massa
Baku
AUC
(µg)
0.1930
124712
0.3860
253685
0.5790
382119
0.7720
510732
0.9650
637376
A = -2987.7
B = 664443.0052
r = 0.999994

y = 676973.5169x 4264.8

y = 668261.7618x 2999.1

y = 664443.0052x 2987.7

26

Dari data diatas dapat dilihat semua kurva baku memiliki nilai r > 0.999.
Persamaan seperti ini menunjukkan nilai linearitas yang baik. Persamaan kurva baku
dengan nilai koefisien korelasi terbesar digunakan untuk menetapkan kadar asam
ursolat dalam sampel ekstrak daun binahong. Persamaan kurva baku yang digunakan
untuk perhitungan kadar adalah persamaan replikasi I dengan nilai koefisien korelasi
sebesar 0.999995.
Asam ursolat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan persamaan kurva
baku replikasi I dan hubungan antara massa asam ursolat vs AUC dapat dilihat pada
gambar berikut.
700000
600000
500000

AUC

400000
300000
200000
100000
0
1

2

3

4

5

Gambar 4. Kurva hubungan massa vs AUC kurva baku replikasi I

27

C. Determinasi Tanaman
Tanaman binahong telah dideterminasi oleh Laboratorium Kebun Obat
Fakultas Farmasi Sanata Dharma. Determinasi dilakukan dengan mengacu pada buku
Flora of java. Tanaman binahong termasuk dalam family Basellaceae.
D. Preparasi Sampel
Penyiapan sampel dimulai dari pemilihan daun segar binahong (yang
kemudian dipotong-potong dan dikeringkan dalam oven pada suhu 60ºC.
Pengeringan daun binahong merupakan proses penting yang bertujuan untuk menjaga
stabilitas daun binahong dari pertumbuhan mikroba. Resiko pertumbuhan mikroba
pada daun kering jauh lebih kecil daripada daun segar, hal ini dikarenakan kandungan
air yang cukup tinggi pada daun segar. Proses pengeringan juga berujuan untuk
membuat matinya sel pada daun, dengan penghilangan kadar air dalam daun yang
merupakan kebutuhan bagi kehidupan sel daun maka akan menyebabkan matinya sel
daun. Matinya sel daun akan menyebabkan membran sel yang merupakan bagian
daun yang mengatur keluar masuknya zat dari dan menuju sel akan rusak sehingga
kandungan zat yang terdapat dalam sel akan lebih mudah diambil sehingga akan
didapatkan kadar asam ursolat yang lebih banyak.
Zat yang boleh diinjeksikan dalam sistem KCKT adalah cair oleh karena itu
daun kering masih harus diproses lebih lanjut yaitu dengan proses ekstraksi. Ekstraksi
untuk daun binahong menggunakan digesti. Digesti merupakan salah satu cara
ekstraksi yang dalam prosesnya dilakukan dengan langkah-lanhkah sebagai berikut,
bahan yang akan diekstraksi direndam dengan cairan penyari dalam labu alas bulat

28

yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak, lalu dipanaskan sampai mendidih.
Cairan penyari akan menguap, uap tersebut akan diembunkan dengan pendingin tegak
dan akan kembali menyari zat aktif dalam simplisia tersebut. Ekstraksi dilakukan
dengan menggunakan daun kering sebanyak 5 gram.
Ekstraksi asam ursolat pada daun binahong menggunakan sistem dua kali
ekstraksi. Ekstraksi pertama menggunakan pelarut kloroform sebanyak 30 ml selama
30 menit pada suhu 70ºC. Residu dari ekstraksi pertama kemudian diekstraksi
kembali dengan menggunakan pelarut campuran antara metanol dan kloroform
sebanyak 30 ml dengan perbandingan 1:1 (v/v) selama 30 menit pada suhu 70ºC.
Proses ekstraksi pada penelitian ini menggunakan dua pelarut dikarenakan asam
ursolat memiliki gugus polar dan gugus nonpolar sehingga dilakukan ekstraksi
dengan dua pelarut yang bersifat polar dan nonpolar yaitu metanol sebagai pelarut
polar dan kloroform sebagai pelarut nonpolarnya. Hasil ekstraksi pertama dan kedua
dicampur untuk kemudian di evaporasi menggunakan rotari evaporator. Metode dua
kali ekstraksi juga digunakan dalam proses ini yang bertujuan untuk meningkatkan
efektifitas ekstraksi sehingga diharapkan seluruh kandungan asam ursolat pada daun
binahong dapat tertarik pada pelarut.
Evaporasi dilakukan dengan tujuan untuk mengeringkan ekstrak daun
binahong. Sistem ini bekerja dengan prinsip menarik pelarut sehingga didapatkan
rendemen. Rendemen ini kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol sampai
mencapai volume 25 ml. Penetapan kadar asam ursolat pada ekstrak daun binahong
dilakukan dengan replikasi sebanyak tiga kali, yaitu dengan mengambil 1 ml ekstrak

29

daun binahong sebanyak tiga kali kemudian dilarutkan dengan metanol sampai
volume 10 ml.
Untuk mendapatkan larutan yang jernih, maka dibutuhkan penyaringan
larutan sampel dengan menggunakan millipore, fungsi millipore sebagai membran
filter adalah untuk menghilangkan semua partikel yang tak larut dalam fase gerak.
Semakin kecil ukuran pori membran filter maka filtrat yang dihasilkan akan semakin
jernih. Pada penelitian digunakan millipore dengan ukuran pori 0,45 µm, oleh sebab
itu maka yang akan dihilangkan adalah partikel yang berukuran > 0,45 µm. Partikel
harus dihilangkan sebelum injeksi sebab partikel akan menyumbat inlet kolom,
sehingga akan merusak kolom yang pada akhirnya akan mengurangi umur normal
kolom (Snyder et al., 1997). Filtrat yang didapatkan selanjutnya didegassing selama
15 menit untuk menghilangkan gelembung yang terdapat dalam larutan, karena
adanya gelembung dikhawatirkan dapat menyumbat kolom instrumen KCKT.
E. Penentuan Recovery, Kesalahan Acak, dan Kesalahan Sistemik
Penentuan nilai recovery dilakukan untuk melihat tingkat akurasi metode
yang digunakan dan memeriksa apakah metode yang digunakan dapat menetapkan
kadar hingga mendekati nilai yang sebenarnya.
Nilai recovery pada baku asam ursolat adalah sebagai berikut.

30

Tabel III. Nilai recovery asam ursolat

Volume
injeksi
2 µl

6 µl

10 µl

Kadar
teoritis
(µg/µl)
0.094

0.094

0.094

AUC

Kadar terukur
(µg/µl)

Recovery
(%)

132084
133101

0.1007
0.1014

106.673
107.944

121793

0.0931

98.622

395495
400792

0.0984
0.0997

104.237
105.614

409706

0.1019

107.944

691068
673256

0.1027
0.1000

108.792
105.932

692868

0.1029

109.004

Hasil
̅ = 104.413%
SD = 5.055
CV = 4.84%
̅ = 105.931%
SD = 1.873
CV = 1.768%
̅ = 107.242%
SD = 1.444
CV = 1.346%

(Wardani, 2010).
Nilai recovery metode KCKT untuk asam ursolat adalah 104.413% untuk
volume injeksi 2 µl; 105.931% untuk volume injeksi 6 µl; dan 107.242% untuk
volume injeksi 10 µl. Nilai recovery pada baku asam ursolat masuk dalam rentang
yang diijinkan sehingga dapat dinyatakan metode KCKT fase terbalik ini memiliki
akurasi yang baik untuk menetapkan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong
berdasarkan parameter respon AUC.
Untuk mengukur tingkat kesalahan yang terjadi dalam penetapan kadar
hidrokortison asetat dan kloramfenikol, maka ditentukan pula nilai kesalahan sistemik
yang merupakan parameter kesalahan yang disebabkan oleh faktor instrumen dan
metode yang digunakan. Kesalahan sistemik metode KCKT fase terbalik ini baik
yaitu memiliki nilai 4.84% pada volume injeksi 2 µl ; 1.