Aktivitas sitotoksik ekstrak metanolik daun Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap sel kanker payudara T47D melalui regulasi ekspresi reseptor Estrogen-α (ERα).

AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-� _(ER�₎

Clara Dewi Anggraeni 118114122 INTISARI

Kanker payudara merupakan penyakit yang kompleks dan heterogen. Penyakit ini terus berkembang dan diperkirakan dalam 20 tahun ke depan insidensinya meningkat. Kanker payudara memiliki karakter ekspresi berlebih reseptor estrogen alfa (ERα_{) yang dapat dihambat dengan pengobatan standar} yaitu tamoxifen. Dewasa ini muncul efek samping dan resistensi terhadap pengobatan tamoxifen. Oleh sebab itu dibutuhkan agen kemoprevensi kanker payudara yang selektif terhadap ERα_.

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap model sel kanker payudara T47D yang dapat mengekspresikan ERα_{. Pengujian awal dilakukan} untuk mengetahui viabilitas sel dengan metode 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Kemampuan apoptosis ekstrak diuji dengan metode Annexin V Fluos dan uji imunositokimia untuk mengetahui kemampuan penekanan ekstrak terhadap ekspresi ERα _{sel T47D.}

Ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 μg/mL yang dihitung secara statistik dengan Program R. Ekstrak

metanol daun rosemary dapat menginduksi apoptosis 19,68%, nekrosis 77,33%, dan dapat menekan ekspresi ERα _{91-93% pada sel T47D.}

Kata kunci: Daun rosemary, Rosmarinus officinalis L., kanker payudara, T47D, ERα_.

ABSTRACT

Breast cancer is a complex and heterogeneous disease. This disease is rapidly grow and predicted in the next 20 years the incidence increases. Breast cancer has overexpression of estrogen receptor alpha (ERα_{) characteristic that can}

be inhibited by a standard treatment, tamoxifen. Today tamoxifen treatment arises side effect and resistance problem. Therefore chemoprevention agent for breast cancer selective ERα _{is highly needed.}

This study was conducted to determine the effect of the methanol extract of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) against T47D breast cancer cells model that express ERα_{. Preliminary study was conducted to determine cell viability by} 3-[4,5-dimethylthiazol-2-Yl]-2.5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Furthermore, apoptosis cells were assayed by Annexin V Fluos and immunocytochemistry to know suppression abilty of rosemary methanol extract againts ERα _expression.

Methanol extract of rosemary leaves showed a cytotoxic effect with IC50

13,95 μg/_mL which calculated statistically by R program. Rosemary methanol extract induced apoptosis 19,68%, necrosis 77,33%, and suppressed ERα expression to 91-93%.

Keywords: Rosemary leaves, Rosmarinus officinalis L., breast cancer, T47D, ERα_.

 

AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-! _(ER!₎

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh: Clara Dewi Anggraeni

118114122

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

2015

! i

AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-! _(ER!₎

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh:

Clara Dewi Anggraeni

118114122

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

2015

Persetujuan Pembimbing

AKTIYITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METAIYOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus ofJieinarrs L.) TERIIADAP SEL KAIIKER

PAYI]DARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-c (ERcr)

Skripsi yang diajukan oleh : Clara Dewi Anggraeni

MM

: ll8ll4l22

telah disetujui oleh :

Pembimbing

(Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.) tanggal 2Maret2015

Pengesahan Skripsi Beriudul

AKTTVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METAI\IOLIK DAT]N ROSEMARY (Rosmarinus offtcinalis L.) TERIIADAP SEL KAIIKER

PAYI]DARA T47D MELALTJI REGULASI EKSPRESI RE,SEPTOR

ESTROGEN-cI _@Rc) Oleh:

Clara Dewi Anggraeni

NIM: ll8ll4122

Diperhhankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Padatanggal: 10 Maret 2015

Metgetahui FakrdAs Farmasi

itas Sanata Dharma (Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.) Panitia Penguji Skripsi

l.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.

2.

Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt.

3.

Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. lll

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Wherever your heart is, there you will find your treasure.”

Paulo Coelho – The Alchemist

Kupersembahkan karya ini kepada:

Papa Alyosius Bekti Subagyo dan Mama Ambrosia Sariningsih Mbak Maria Erika Sariputranti dan Mas Christian J.P. Willy Resubun Kakak Felisitas Kanyamurti Cyrillus Dirga Sakti Adhyastha Resubun

PERNYATAAI\ KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa slaipsi yang telah saya

tulis ini, tidak memuat karya atau bagian karya orang laiq kecuali yang sudatr

disebutkan dalarn hrtipan dan daftar pustakq seperti layalrrya karya ilmiah.

Apabila dikennrdian hari ditemukan indikasi plagirisme dalam naskah

tersebut, saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan per,undang-undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 2 Maret 2015 Penulis

LEMBAR PERNYATAAI\ PERSETUJUAI\

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAI\ AKADBMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Clara Dewi Anggraeni

NIM :

ll8ll4l22

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta,karya ilmiah saya yang berjudul:

AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalk L.) TERIIADAP SEL KANKER

PAYUDARA T4TD MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-a (ERc)

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

hak

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet dan media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 2 Maret 2015 Yang menyatakan

! vii

PRAKATA

Puji syukur pada Tuhan Yesus Kristus atas berkat dan rahmat-Nya yang melimpah, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen-α _(ERα_{)” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu}

persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis menyadari bahwa pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan yang indah ini penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji Skripsi ini serta selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi, atas bimbingan, bantuan, dukungan, kesabaran, dan motivasi selama pelaksanaan dan penyusunan skripsi juga ijin yang diberikan sehingga penulis dapat menggunakan sarana dan prasarana untuk kepentingan skripsi ini.

3. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku Dosen Penguji Skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis.

4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku Dosen Penguji Skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis.

5. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang sudah memberi dukungan dengan sabar selama saya menempuh studi.

6. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, arahan, dan bimbingan yang dibagikan.

7. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Rumbi dan Ibu Juju selaku Supervisor

dan Teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah membantu dan membimbing selama pelaksanaan penelitian penulis dengan sabar. 8. Keluarga terkasih, Papa Aloysius Bekti Subagyo, Mama Ambrosia

Sariningsih, Mbak Erika Sariputranti, Mas Christian John Phillips Willy Resubun, Kakak Felisitas Kanyamurti, Cyrillus Dirga Sakti Adhyastha Resubun atas segala bantuan dalam bentuk materi dan moril, kepercayaan, dukungan dan doa yang tiada henti sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu dan dapat membanggakan keluarga.

9. Sahabat dari Tim Skripsi Pasti Sukses yaitu Andung Panjalu dan Winda Sekarjati yang telah mengerahkan segala pikiran dan usaha dengan penuh semangat agar dapat mengenakan toga bersama tepat waktu.

10. Teman-teman FSM C 2011 dan FST B 2011 atas kebersamaan yang indah dalam perjuangan ini.

11. Rekan, kerabat, dan sahabat yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu sejak bangku sekolah hingga saat ini atas bantuan dan penghiburannya yang hangat.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga membutuhkan saran dan kritik yang membangun untuk perubahan yang lebih baik. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 2 Maret 2015 Penulis

! ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xvi

INTISARI ... xvii

ABSTRACT ... xviii

BAB I. PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Rumusan Masalah ... 3

2. Keaslian Penelitian ... 3

3. Manfaat Penelitian ... 4

B. Tujuan Penelitian ... 4

1. Tujuan Umum ... 4

2. Tujuan Khusus ... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ... 5

A. Kanker dan Karsinogenesis ... 5

B. Kanker Payudara ... 7

C. Model Sel Kanker Payudara ... 8

D. Reseptor Estrogen-α _{dan Tamoxifen ... 9}

E. Apoptosis dan Nekrosis ... 11

F. Uji Sitotoksik ... 15

G. Annexin V Fluos ... 17

H. Imunositokimia ... 18

I. Tanaman Rosemary dan Ekstrak Metanol Daun Rosemary ... 19

J. Landasan Teori ... 21

K. Hipotesis ... 22

BAB III. METODE PENELITIAN ... 23

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 23

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 23

1. Variabel Utama ... 23

2. Variabel Pengacau ... 23

3. Definisi Operasional ... 24

C. Bahan Penelitian ... 25

D. Alat Penelitian ... 25

E. Tata Cara Penelitian ... 26

1. Pengumpulan Tanaman ... 26

! xi

3. Penyiapan Simplisia ... 26

4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary ... 27

5. Panen Sel ... 28

6. Preparasi Larutan Uji ... 28

7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT ... 28

8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos ... 29

9. Pengujian Ekspresi ERα _{dengan Metode Imunositokimia ... 30}

F. Tata Cara Analisis Hasil ... 31

1. Analisis Nilai IC50 ... 31

2. Analisis Apoptosis Sel ... 31

3. Analisis Ekspresi ERα _{... 31}

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 33

A. Determinasi Tanaman dan Ekstraksi Daun Rosemary ... 33

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Metanol Daun Rosemary dengan Metode MTT .... 35

C. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos ... 39

D. Pengujian Ekspresi ERα _{dengan Metode Imunositokimia ... 42}

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 48

A. Kesimpulan ... 48

B. Saran ... 48

DAFTAR PUSTAKA ... 49

LAMPIRAN ... 54

BIOGRAFI PENULIS ... 61

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil Uji Sitotoksik ... 36

Tabel 2. Hasil Uji Apoptosis Dengan Metode Annexin V Fluos ... 40

! xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Skema signaling ERα _{... 10}

Gambar 2. Tiga jalur utama apoptosis ... 12

Gambar 3. Proses apoptosis ... 13

Gambar 4. Proses nekrosis ... 14

Gambar 5. Mekanisme reaksi pada pembentukan kristal formazan ... 16

Gambar 6. Tanaman rosemary ... 19

Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary ... 27

Gambar 8. Struktur senyawa dalam ekstrak dan ligan ERα _{... 34}

Gambar 9. Kristal formazan yang terbentuk pada uji MTT ... 35

Gambar 10. Hasil uji sitotoksik ... 37

Gambar 11. Hasil uji Annexin V Fluos ... 40

Gambar 12. Hasil uji imunositokimia ... 43

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat determinasi tanaman rosemary ... 55

Lampiran 2. Seri kadar ekstrak metanol daun rosemary dan tamoxifen ... 56

Lampiran 3. Hasil analisis IC50 ekstrak dengan Program R ... 57

Lampiran 4. Hasil analisis IC50 tamoxifen dengan Program R ... 58

Lampiran 5. Lapang pandang preparat ekstrak dan tamoxifen ... 59

! xv

INTISARI

Kanker payudara merupakan penyakit yang kompleks dan heterogen. Penyakit ini terus berkembang dan diperkirakan dalam 20 tahun ke depan insidensinya meningkat. Kanker payudara memiliki karakter ekspresi berlebih reseptor estrogen alfa (ERα_{) yang dapat dihambat dengan pengobatan standar}

yaitu tamoxifen. Dewasa ini muncul efek samping dan resistensi terhadap pengobatan tamoxifen. Oleh sebab itu dibutuhkan agen kemoprevensi kanker payudara yang selektif terhadap ERα_.

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap model sel kanker payudara T47D yang dapat mengekspresikan ERα_{. Pengujian awal dilakukan}

untuk mengetahui viabilitas sel dengan metode 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Kemampuan apoptosis ekstrak diuji dengan metode Annexin V Fluos dan uji imunositokimia untuk mengetahui kemampuan penekanan ekstrak terhadap ekspresi ERα _{sel T47D.}

Ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 !g/mL yang dihitung secara statistik dengan Program R. Ekstrak

metanol daun rosemary dapat menginduksi apoptosis 19,68%, nekrosis 77,33%, dan dapat menekan ekspresi ERα _{91-93% pada sel T47D.}

Kata kunci: Daun rosemary, Rosmarinus officinalis L., kanker payudara, T47D, ERα_.

ABSTRACT

Breast cancer is a complex and heterogeneous disease. This disease is rapidly grow and predicted in the next 20 years the incidence increases. Breast cancer has overexpression of estrogen receptor alpha (ERα_{) characteristic that can} be inhibited by a standard treatment, tamoxifen. Today tamoxifen treatment arises side effect and resistance problem. Therefore chemoprevention agent for breast cancer selective ERα _{is highly needed.}

This study was conducted to determine the effect of the methanol extract of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) against T47D breast cancer cells model that express ERα_{. Preliminary study was conducted to determine cell viability by}

3-[4,5-dimethylthiazol-2-Yl]-2.5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Furthermore, apoptosis cells were assayed by Annexin V Fluos and immunocytochemistry to know suppression abilty of rosemary methanol extract againts ERα _expression.

Methanol extract of rosemary leaves showed a cytotoxic effect with IC50

13,95 !g/_mL which calculated statistically by R program. Rosemary methanol extract induced apoptosis 19,68%, necrosis 77,33%, and suppressed ERα

expression to 91-93%.

Keywords: Rosemary leaves, Rosmarinus officinalis L., breast cancer, T47D, ERα_.

1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker payudara merupakan keganasan non-kulit yang sering terjadi

pada wanita. Wanita yang hidup hingga usia 90 tahun memiliki kemungkinan satu

dari delapan mengidap kanker payudara. Pada tahun 2001, hampir 240.000 wanita

didiagnosis kanker payudara, dan lebih dari 40.000 meninggal akibat penyakit ini.

Jumlah wanita penderita kanker payudara diperkirakan meningkat tiga kali lipat

dalam 20 tahun ke depan (Kumar, dkk., 2004).

Pengobatan kanker payudara yang berkembang dewasa ini terbagi atas

terapi locoregional, kemoterapi dan kanker payudara triple negatif, dan terapi

bertarget reseptor estrogen (Sledge, dkk., 2014). Pengobatan kanker payudara

tidak selalu berhasil pada tiap subjek dikarenakan faktor heterogenisitas tingkat

genetik. Semakin kompleksnya arah perkembangan kanker payudara dapat

memunculkan resistensi terhadap pengobatan yang tersedia (Roche dan Vahdat,

2010). Maka dibutuhkan agen kemoprevensi untuk mencegah berkembangnya

kanker payudara sedini mungkin.

Perilaku pencegahan penyakit melalui makanan, bahan tambahan,

mikronutrien dan senyawa alami terus dikembangkan. Perilaku ini disebut

kemoprevensi dan substansi yang digunakan disebut agen kemopreventif.

Kemoprevensi merupakan penggunaan agen alami atau sintesis yang

membalikkan, menghambat, atau mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama

dari kemoprevensi adalah menunda terjadinya kanker dan juga menurunkan angka

kejadiannya. Kemopreventif yang berhasil membutuhkan penggunaan agen yang

mampu menghambat tahapan molekuler spesifik pada jalur karsinogenesis. Studi

selama empat dekade terakhir menunjukkan bahwa agen kemopreventif alami dan

sintetis mampu menghambat karsinogenesis melalui dua jalur utama yaitu

menginhibisi aktivasi karsinogen dan induksi enzim pemetabolisme xenobiotik

sehingga dapat melindungi dari efek toksik lingkungan. Di samping itu, agen

kemopreventif memiliki target molekuler seperti protein yang terlibat dalam

progresi dan proliferasi siklus sel, protein anti apoptosis, transport obat; multi

drug resistance (MDR); multi-drug resistance-related protein (MRP), jalur faktor

pertumbuhan, jalur aktivasi NF-!_{B, angiogenesis, protein inflamasi seperti}

COX-2 (Sharma, COX-201COX-2).

Daun rosemary berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen

kemopreventif pada kanker payudara. Abe dkk. (2002) berhasil mengekstraksi

daun rosemary menggunakan pelarut metanol dan menganalisis kandungan

kimianya antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Menurut

hasil studi penelitian Bishaye dkk. (2011) asam betulinat pada T47D dan asam

ursolatpada MCF-7 memiliki aktivitas antiproliferatif dan induksi apoptosis, dan

menurut Liu dkk. (2014) asam oleanolat pada MCF-7 juga memiliki efek yang

sama. Beberapa penelitian telah membuktikan aktivitas antikanker komponen

dalam ekstrak metanol daun rosemary pada MCF-7 atau T47D akan tetapi uji

!

3

kanker payudara belum pernah dilakukan.

Pada penelitian ini, dilakukan penelusuran mekanisme molekuler

aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel T47D. Sel kanker

payudara T47D yang merupakan golongan luminal A banyak digunakan karena

mengekspresikan ERα _{yang berlebih, sehingga ideal untuk penelitian ini}

(Holliday dan Speirs, 2011). Dengan demikian, diharapkan penelitian ini dapat

memberikan kontribusi dalam penemuan agen kemopreventif bagi kanker

payudara.

1. Rumusan masalah

Apakah ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.)

mempunyai aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis, dan berpengaruh terhadap

ekspresi protein ERα _{terhadap sel kanker payudara T47D serta berapa IC50}

ekstrak tersebut?

2. Keaslian penelitian

Penelitian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.)

yang pernah dilakukan adalah “Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carsonic

Acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines”

oleh Ozlem Yesil-Celiktas, Canan Sevimli, Erdal Bedir, Fazilet Vardar-Sukan

(2010). Daun rosemary diekstraksi dengan supercritical CO2 menggunakan

metanol, senyawa aktif yang ditemukan adalah asam karsonik dan asam

rosmarinik diujikan pada NCI-H82, DU-145, Hep-3B, K-562, MCF-7, PC-3,

MDA-MB-231 dengan metode MTT. Ekstrak metanol daun rosemary dinyatakan

berpotensi sebagai kandidat antikanker.

Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan peneliti, penelitian tentang

Uji Aktivitas Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus Officinalis L.)

terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor

Estrogen-α _(ERα_{) belum pernah dilakukan.}

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat Teoretis. Penelitian ini dapat bermanfaat bagi

pengembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian mengenai

informasi tentang kemopreventif terkait ekstrak metanol daun rosemary

(Rosmarinus officinalis L.), sehingga dapat pula menjadi sumber acuan yang

dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya.

b. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan

secara ilmiah khasiat dari ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis

L.) yang berpengaruh pada viabilitas, induksi apoptosis, dan mendeteksi ekspresi

protein sel kanker payudara T47D.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan ekstrak metanol daun

rosemary (Rosmarinus officinalis L.) memiliki aktivitas sebagai agen

kemopreventif.

2. Tujuan khusus

Mengetahui kemampuan ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus

officinalis L.) untuk menginduksi sitotoksik, apoptosis, dan mempengaruhi

!

!

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kanker dan Karsinogenesis

Kanker dikarakterisasi oleh pertumbuhan yang tidak terkontrol dan

akuisisi metastatik. Pada banyak kasus, aktivasi onkogen dan atau deaktivasi gen

tumor supresor mengarah pada progresi siklus sel yang tidak terkendali dan

mekanisme inaktivasi apoptosis. Pada tumor ganas terjadi penurunan afinitas

antar jaringan spesifik ikatan sel-sel dengan reseptor dan peningkatan jumlah

reseptor pergerakan sel. Aktivasi membran metalloprotease membuka jalur fisik

metastatik persebaran sel kanker yang semakin lebar. Perubahan genetik yang

terjadi antara lain mutasi, translokasi dan delesi kromosom, disregulasi ekspresi

atau aktivitas jalur sinyal. Studi terkini menyebutkan bahwa perubahan epigenetik

merupakan ciri kanker karena sifatnya sebagai sel pencetus kanker dan inisiator

karsinogenesis (Sarkar, dkk., 2013).

Proses karsinogenesis diawali dengan tahap inisiasi neoplasia di mana

perubahan yang tidak terbalikan terjadi pada sel somatik. Inisiasi terjadi karena

adanya ketidakstabilan sel yang disebabkan oleh paparan karsinogen sehingga

terjadi mutasi pada gen dan terbentuk neoplastik. Aktivasi onkogen berperan

penting dalam transformasi neoplastik, seperti mutasi gen tumor menyebabkan

perubahan respon seluler yang mengacu pada disregulasi gen pada jalur kontrol

sinyal biokimia sehingga terjadi gangguan proses alami komunikasi,

perkembangan, dan diferensiasi sel. Sel yang mengalami transformasi akan terus

membelah diiringi dengan mutasi lanjutan sebelum manifestasi lesi ganas (Devi,

2005).

Tahap kedua karsinogenesis adalah promosi di mana sel yang mengalami

transformasi terstimulasi untuk melakukan proliferasi lebih lanjut hingga muncul

ketidakseimbangan seluler. Tahap ini membutuhkan transformasi yang didorong

oleh paparan karsinogen dalam jangka panjang. Ketiga adalah progresi, atau biasa

disebut konversi sel pre-neoplastik. Sel pre-neoplastik bertransformasi ke tahap

perkembangan keganasan, diikuti oleh akumulasi mutasi gen dan luasnya klon sel

pre-neoplastik (Devi, 2005).

Tahap keempat adalah angiogenesis tumor, pertumbuhan tumor perlu

didukung oleh faktor pertumbuhan dan pembuangan molekul toksik yang efisien

juga asupan darah yang mencukupi. Faktor pendukung tersebut disalurkan oleh

pembuluh darah, akan tetapi pembuluh darah pada jaringan normal dan tumor

berbeda. Pembuluh tumor sering melebar, saccular dan berliku-liku dapat pula

mengandung sel-sel tumor dalam lapisan endotel pembuluh. Aliran darah di tumor

mungkin lebih lambat dibandingkan dengan jaringan normal yang berdekatan dan

mikrovaskuler tumor dapat menunjukkan hiperpermeabilitas protein plasma.

Tahap kelima adalah metastasis tumor, ketika progresi tumor terus berkembang,

sel akan terlepas dari massa tumor dan menginvasi jaringan terdekat. Sel yang

lepas tersebut juga akan masuk ke dalam sirkulasi darah dan limfa sehingga

masuk ke jaringan atau organ lain kemudian berkembang. Hal ini menyebabkan

!

7

B. Kanker Payudara

Kanker payudara dapat muncul akibat akumulasi kerusakan genetik.

Beberapa gen bertanggung jawab terhadap sebagian besar kanker payudara

herediter, tapi banyak gen predisposisi bertanggung jawab terhadap kasus

sporadik. Mutasi yang terjadi pada gen predisposisi seperti p53, BRCA1 dan

BRCA2 yang cenderung bertindak melalui perbaikan DNA mempengaruhi

kestabilan gen. Studi mengenai kanker sporadis menyatakan bahwa abnormalitas

genetik yang luas terlibat dalam perkembangan penyakit kanker payudara

(Mallon, dkk., 2000).

Subtipe molekuler kanker payudara yang dikenal baik adalah luminal,

dengan cirinya yaitu sensitif terhadap hormon estrogen maupun progesteron.

Subtipe luminal dapat dibagi menjadi dua yaitu luminal A dan luminal B. Secara

prognosis subtipe luminal B dapat dikenali dengan ko-ekspresi HER2 selain ER

dan PR, berlawanan dengan luminal A yang HER2 negatif. Subtipe molekuler

berhubungan dengan tumor lokal yang kambuh, respon terhadap pengobatan

sistemik neoadjuvant, pola metastatik dan kelangsungan hidup sel kanker. Subtipe

molekuler dapat dihubungkan dengan perbedaan faktor resiko, sehingga dapat

mengidentifikasi perbedaan biologis proses neoplastik dengan bermacam tindakan

klinis dan reaksi pengobatan. Faktor molekuler yang memiliki peran pada

perkembangan sel kanker payudara yang telah diketahui dan berpotensi menjadi

target pengobatan adalah fascin, matrix metalloproteinase-1, cyclooxygenase-2,

interleukin, p53, p27, dan apoptosis-related factors seperti Bcl-2 (Strumfa, dkk.,

2012).

C. Model Sel Kanker Payudara

Model sel kanker yang dikulturkan memberikan keuntungan pada

penelitian kanker yaitu populasi yang relatif homogen dan mampu bereplikasi

pada media kultur standarnya. Profil kanker payudara dengan ekspresi gen dan

imunohistokemikal reseptor estrogen alfa (ERα_{), reseptor progesteron (PR), dan}

HER2 dapat diklasifikasikan menjadi beberapa subtipe yaitu luminal A (MCF-7,

T47D), luminal B (BT474, ZR-75), HER2 (SKBR3, MDA-MB-453), basal

(MDA-MB-468) dan normal (MDA-MB-231) (Holliday dan Speirs, 2011).

Kultur sel kanker payudara manusia mampu memberikan pedoman yang

sangat baik untuk penelitian kanker payudara dalam perkembangan dan

pengobatan tumor. Model sel kanker payudara yang dapat mengekspresikan ERα

adalah MCF-7 dan T47D. Sel ini biasa digunakan untuk uji in vitro dan in vivo

pada analisis gen, protein fungsional, dan uji efektivitas inhibitor. MCF-7

menggunakan media kultur DMEM, sifatnya resisten terhadap doxorubicin,

mengekspresikan Bcl-2 berlebih akan tetapi tidak mengekspresikan caspase 3

(Adjo Aka and Lin, 2012).

Sel kanker payudara T47D mengekpresikan reseptor estrogen nukleus,

yang diperlukan bagi sel untuk mengaktifkan gen penting tertentu dalam

pertumbuhan dan replikasi. Estrogen termasuk dalam hormon seks yang terdiri

dari estradiol, estriol, dan estrone. Hormon-hormon ini mampu menembus

membran sel sehingga dapat berdifusi langsung ke nukleus. Estrogen yang masuk

ke nukleus berikatan dengan reseptor estrogen membentuk reseptor dimer. Sisi

!

9

menaikkan atau menurunkan ekspresi gen tergantung pada peran faktor transkripsi

sisi aktif. T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi akan tetapi sel ini

sensitif terhadap doxorubicin (Neumann dan Rossi, 2012).

D. Reseptor Estrogen-! _{dan Tamoxifen}

Kanker payudara adalah penyakit heterogen, akan tetapi hampir 70% dari

penyakit ini adalah reseptor estrogen positif. Reseptor estrogen (ER) mendorong

pertumbuhan tumor dalam rangka respon terhadap ligannya yaitu estrogen.

Ekspresi ER mengindikasikan tingkat estrogen dependence dari kanker payudara.

Terapi endokrin merupakan terapi efektif kanker payudara ER-positif, yang

dicapai dengan antagonisasi ligan yang berikatan dengan ER (tamoxifen dan

selective estrogen receptor modulator lainnya), menurunkan regulasi ER

(fulvestrant) atau menghentikan biosintesis estrogen (inhibitor aromatase dan

luteinizing hormone-releasing hormone agonists) (Tokunaga, dkk., 2014).

Ada dua bentuk reseptor estrogen yang dibedakan berdasarkan kode

genetiknya yaitu ERα _{dan ERβ. ER}α _{bertanggung jawab pada proses}

estrogen-induces mitogenic signaling sel epitel pada payudara, uterus, dan ovarium, selain

itu juga berperan dalam inisiasi dan progresi kanker payudara (Tokunaga, dkk.,

2014). Tamoxifen telah banyak digunakan sebagai pengobatan kanker payudara,

melalui kemampuannya menghambat ikatan antara estrogen dengan reseptornya

sehingga proliferasi sel yang diinduksi oleh mekanisme ini dapat dihambat

(Jordan, 2006). Tamoxifen bekerja sebagai inhibitor kompetitif ikatan estrogen

dengan ERα_{, selain itu secara langsung dapat menginduksi apoptosis (Criscitiello,}

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

dkk., 2011). Pada awalnya tamoxifen digunakan sebagai pengobatan tambahan

setelah tindakan medis seperti pembedahan , tapi seiring berkembangnya waktu

juga digunakan sebagai pengobatan kanker payudara (Jordan, 2006).

Gambar 1. Skema signaling ER! _{(Tokunaga, dkk., 2014)}

Gambar 1 memaparkan estradiol berikatan dengan ERα _{sehingga ER}α

mengalami perubahan konformasi dan membentuk dimer. Dimer ERα _ini

berikatan dengan rangkaian estrogen response element (ERE) dalam promoter gen

target dan menarik kompleks ko-faktor (ko-aktivator dan ko-represor). Fungsi

klasik ERα _{adalah fungsi nukleusnya, yang disebut dengan aktivitas genomik.}

Gambar 1 juga menjabarkan ERα _{dapat langsung berikatan dengan faktor}

transkripsi lain seperti activator protein-1 (AP-1) dan specificity protein-1 (SP-1)

pada situs spesifiknya di DNA. Jalur sinyal ERα _{juga diregulasi oleh reseptor}

membran tirosin kinase (RTK). RTK mengaktivasi jalur sinyal seperti jalur

!

11

menyebabkan fosforilasi ERα _{dan mengarah pada aktivasi ER}α _{(Tokunaga, dkk.,}

2014).Mekanisme lain diungkapkan oleh Liao dkk. (2014) di mana ekspresi ERα_!

yang tinggi dan ikatan 17-β-estradiol (E2) dengan ERα_{!menginduksi penekanan} p53/p21 dan meningkatkan proliferating cell nuclear antigen (PCNA) dan

proliferation-related Ki-67 antigen (Ki-67) yang berguna dalam induksi

proliferasi sel kanker payudara. ERα _{memediasi proliferasi sel kanker payudara}

dengan meningkatkan miR-17 hingga membungkam ekspresi p21.

E. Apoptosis dan Nekrosis

Kematian sel terprogram atau programmed cell death (PCD) merupakan

bagian dari apoptosis yang diperlukan sebagai mekanisme pelengkap pada

proliferasi untuk memastikan homeostasis seluruh jaringan. Proses ini harus

diregulasi dengan baik karena kegagalan pada apoptosis dapat mempengaruhi

kelangsungan hidup sel dan dapat berkontribusi pada perkembangan sel

neoplastik. Pengaruh pada kelangsungan hidup sel dapat menyebabkan

ketidakstabilan gen dan akumulasi mutasi (Andreeff, dkk., 2000).

Kematian sel yang terprogram dapat distimulasi oleh beberapa faktor

seperti kurangnya asupan nutrisi, aktivasi reseptor kematian pada permukaan sel,

senyawa kimia, radiasi ionisasi, kerusakan fisik secara langsung, dan karena sel T

sitotoksik (Gambar 2). Berbagai macam stimulus dapat menyebabkan beberapa

macam jalur apoptosis, akan tetapi mengarah pada satu jalur umum yaitu aktivasi

caspase. Caspase adalah kelompok enzim yang terlibat dalam regulasi apoptosis.

Dua jalur aktivasi caspase yang berbeda telah teridentifikasi. Pertama adalah jalur

ekstrinsik yang diinisiasi oleh aktivasi reseptor kematian yang terletak pada

transmembran. Kedua adalah jalur intrinsik yang diaktivasi oleh stress seluler dan

secara umum melibatkan pelepasan protein mitokondrial seperti sitokrom C.

Ketiga adalah jalur perforin atau granzim (Bali, dkk., 2013).

Gambar 2. Tiga jalur utama apoptosis (Bali, dkk., 2013)

Apoptosis terhadap respon kerusakan DNA dapat diinduksi dalam jalur

p53-dependent atau independent. DNA awal yang rusak menerjemahkan sinyal ke

nukleus untuk melibatkan ataxia telangiectasia mutated (ATM) dan ataxia

telangiectasia RAD3 related (ATR) protein kinases. Jalur sinyal p53-dependent

menginduksi aktivasi transkripsional dari gen proapoptik seperti Bcl-2 associated

X (BAX) dan Fas. Jalur sinyal p53-independent melibatkan aktivasi

!

13

Reseptor kematian sel pada permukaan dari kelompok tumor necrosis

factor-receptor (TNFR), seperti TNFR-1 dan kelompok diferensiasi Fas 95

(CD95) dapat mentranduksi sinyal apoptosis dengan melibatkan masing-masing

ligannya atau antibodi spesifik. Stimulasi oleh Fas ligand (FASL) atau TNF-α

menyebabkan trimerise reseptor kematian dan daerah sitoplasmik yang mati

menarik protein adaptor sitoplasmik. Protein adaptor FAS adalah FAS associated

death domain (FADD) dan untuk TNFR1 adalah TNFR associated death domain

(TRADD). FADD dan TRADD menarik dan mengaktifkan caspase-8 sehingga

dapat menginduksi caspase lainnya dan mengarah ke apoptosis (Bali, dkk., 2013).

Gambar 3. Proses apoptosis (Schulze-Osthoff, 2008)

Gambar 3 memaparkan apoptosis ditandai dengan perubahan morfologi

nukleus, termasuk kondensasi kromatin dan fragmentasi. Secara keseluruhan sel

mengalami pengerutan, blebbing membran plasma, dan terakhir akan membentuk

badan apoptosis yang mengandung nukleus atau materi sitoplasmik

(Schulze-Osthoff, 2008). Proses nekrosis (Gambar 4) secara morfologis ditandai dengan

terjadinya pembengkakan sitoplasmik kemudian dilatasi organela yang

menyebabkan vakuolisasi seluler dan rupturnya membran plasma, menghasilkan

kebocoran proinflamator dari konten intraseluler (Schulze-Osthoff, 2008).

Gambar 4. Proses nekrosis (Schulze-Osthoff, 2008)

Kondisi sel yang mengalami nekrosis mirip dengan sel yang mengalami

apoptosis, tetapi terdapat perbedaan yaitu sel mengkerut dan menggerombol. Sel

yang mengalami nekrosis akan membentuk fragmen dan terjadi pembengkakan,

selain itu matriks mitokondria membentuk kumpulan agregat dan mengganggu

membran sel bersamaan dengan pembentukan mielin. Nukleus terdegradasi

terlebih dahulu, kemudian terjadi gumpalan kromatin dan mengarah pada

kariolisis (Trump, dkk., 1997).

Mekanisme yang terjadi pada proses nekrosis sel ada beberapa macam,

pertama adalah jalur ATP. Penurunan jumlah ATP menyebabkan kerusakan sel

secara cepat yang mengarah pada onkosis sehingga tidak ada pasokan energi

untuk mengaktifkan kanal Na+K+ATPase pada membran sel yang menyebabkan

peningkatan ion Na+ dan Cl- dan masuknya air sehingga sel membengkak, selain

itu jumlah ion Ca+ meningkat cepat (Trump, dkk., 1997). Pada apoptosis jumlah

ATP masih dapat dijaga lebih lama di tahap reversibel sehingga pompa Na+ dan

pembengkakan sel dapat dihambat. Pengkerutan yang terjadi dapat disebabkan

!

15

oleh hilangnya ion K+ dan Cl- tapi terjadi peningkatan Ca2+ sehingga kanal K+

yang diaktivasi Ca+ dapat bekerja (Trump, dkk., 1997).

Mekanisme nekrosis lainnya melalui regulasi volume dan ion sel yang

ditandai dengan peristiwa onkosis di mana kendali pengaturan volume cairan

hilang, hal ini dapat terjadi karena defisiensi ATP juga kerusakan langsung pada

membran plasma. Telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan ion Ca2+

dapat menyebabkan onkosis tapi pada beberapa sel dapat pula terjadi apoptosis,

selain itu ion Ca2+ mempengaruhi transkripsi gen juga fungsi sitoskeletal (Trump,

dkk., 1997).

F. Uji Sitotoksik

Kinerja, reprodusibilitas, dan kemampuan studi untuk diperbandingkan

memerlukan kuantifikasi sel. Metode klasik yang dapat digunakan adalah

perhitungan langsung menggunakan haemocytometer, dihubungkan dengan

pewarnaan seperti triptan biru untuk membedakan sel hidup dan mati. Metode

klasik ini memang mudah, murah, dengan jumlah sel yang sedikit akan tetapi

masih bersifat subjektif. Dewasa ini telah banyak metode yang dikembangkan dan

lebih sesuai seperti deteksi dengan pelabelan radiokromium, ATP selular, volume

intraselular, pewarnaan spesifik, potensi redoks, uji turbiditas, kalorimetri, dan

monitoring biomassa (Doyle dan Griffiths, 2000). Dalam penelitian ini digunakan

metode pewarnaan spesifik yaitu 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl

Tetrazolium Bromide (MTT).

Garam tetrazolium telah dikembangkan sebagai alat pengukuran warna

secara kuantitatif untuk menentukan proliferasi dan kemampuan bertahan

hidupnya sel. Uji ini mengukur jumlah sel yang hidup bukan sel yang mati, dan

sinyal berasal dari derajat keaktifan masing-masing sel. Hasilnya dapat dibaca

pada multiwell scanning spetrophotometer (ELISA reader) dan menunjukkan

hasil dengan presisi tinggi. Metode ini dapat mengurangi proses pencucian yang

tidak diperlukan sehingga mampu mengurangi waktu dan jumlah sampel yang

diperlukan. Kelebihan metode ini adalah keakuratan dan kepresisiannya, juga

minimnya gangguan radioisotop (Mosmann, 1983).

Gambar 5. Mekanisme reaksi pada pembentukan kristal formazan (Talupula, 2011)

MTT adalah uji reduksi tetrazolium untuk uji viabilitas sel homogen

yang dikembangkan pada wadah dengan 96 lubang yang cocok untuk hasil

pemilahan yang baik. Substrat MTT disiapkan dalam larutan pada kondisi

fisiologis, ditambahkan ke dalam kultur sel, biasanya pada kadar 0,2–0,5 mg/mL,

dan diinkubasi selama satu sampai empat jam. Jumlah formazan (yang sebanding

langsung dengan jumlah sel yang hidup) diukur menggunakan spektrofotometer

pada panjang gelombang 570 nm. Sel yang hidup dengan metabolisme akif dapat

mengubah MTT ke formazan berwarna ungu yang dapat dibaca absorbansinya.

!

17

Ketika sel mati tidak dapat mengubah MTT menjadi formazan, sehingga

intensitas warna yang muncul spesifik untuk sel hidup (Riss, dkk., 2014).

G. Annexin V Fluos

Apoptosis tahap awal ditandai dengan tersebarnya sel tunggal sehingga

tidak dapat dikenali lagi, dan pada tahap akhir badan apoptosis mengalami

fagositosis cepat, proses ini terjadi hanya dalam beberapa jam. Perubahan pada

permukaan sel apoptik seperti ekspresi sisi ikatan trombospondin, hilangnya

residu asam sialik, dan paparan fosfatidilserin menjadi sulit dikenali.

Fosfatidilserin adalah fosfolipid yang bermuatan negatif, yang biasanya muncul

pada ujung membran berhadapan dengan sitosol. Paparan fosfatidilserin pada

permukaan sel mengaktivasi platelet dan eritrosit tua, sel yang akan hancur oleh

apoptosis (Vermes, dkk., 1995).

Annexin V ditemukan sebagai protein pembuluh darah yang memiliki

aktivitas kuat antikoagulan, sebagai keluarga multigen protein yang memiliki

urutan yang berulang yang disebut loop endoxin. Annexin dapat berikatan dengan

fosfolipid dengan bantuan Ca+. Annexin V berikatan secara spesifik terhadap

fosfolipid seperti fosfatidilserin, yang biasanya tidak ada di luar permukaan

membran plasma, dan menunjukkan ikatan minim dengan fosfolipid lain seperti

fosfatidilkolin dan spingomielin yang ada di permukaan membran plasma

(Vermes, dkk., 1995).

Ketika kematian sel terjadi, fosfatidilserin berpindah ke permukaan

membran (bagian terluar sel). Ini terjadi pada fase awal dari kematian sel akibat

apoptosis di mana membran sel masih utuh. Nekrosis di sisi lain, mengalami

penurunan integritas membran dan kebocoran selular dari dalam sel ke

lingkungan. Oleh sebab itu, pengukuran ikatan Annexin V diikuti dengan

pewarnaan dapat memberikan pengukuran yang tepat untuk mendeteksi sel yang

mengalami apoptosis dan membedakannya dari yang mengalami nekrosis

(Vermes, dkk., 1995).

H. Imunositokimia

Imunohistokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein, antigen

dalam jaringan dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi dengan bantuan

penanda. Pewarna fluoresen dan enzim adalah yang paling banyak digunakan.

Metode pewarnaan jaringan ini disebut immunostaining. Proses yang mirip untuk

mendeteksi antigen pada sel disebut imunositokimia. Langkah-langkah

pengerjaan dalam imunositokimia ini adalah aktivasi antigen, blocking

peroksidasi endogen, inkubasi antibodi primer, inkubasi antibodi sekunder,

deteksi antibodi, counter stainning, dan penutupan slide. Blocking peroksidase

endogen dapat mencegah reaksi tidak spesifik saat pewarnaan, larutan yang

dipakai adalah hidrogen peroksidase. Pencucian dengan Phosphate Buffer Saline

(PBS) penting dilakukan agar tidak ada reagen tersisa dari perlakuan sebelumnya.

Inkubasi antibodi primer dilakukan untuk memberi waktu reaksi antara antibodi

primer tidak berlabel dengan antigen, selanjutnya dilakukan inkubasi antibodi

sekunder berlabel dapat memberikan warna pada reaksi yang terjadi di antigen

antibodi jaringan atau sel. Counterstain menggunakan pewarna Mayer

!

19

agar preparat yang sudah jadi bisa lebih tahan lama dengan menggunakan lem

khusus antara kaca preparat, cover slip, dan penutup preparatnya. Pengamatan

preparat dilakukan dengan menggunakan mikroskop (Prabin, dkk., 2009).

I. Tanaman Rosemary dan Ekstrak Metanol Daun Rosemary

Gambar 6. Tanaman Rosemary (Deymos, 2010)

Rosemary merupakan herba dari famili Lamiaceae yang berasal dari

daerah Mediterania. Klasifikasi rosemary adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Asteridae

Order : Lamiales

Family : Lamiaceae

Genus : Rosmarinus L.

Species : officinalis

Binominal name : Rosmarinus officinalis L.

(Begum, dkk., 2013).

Tanaman rosemary terutama bagian daunnya dapat diekstraksi

menggunakan pelarut metanol, menurut Abe dkk. (2002) dengan metode refluks

sehingga dihasilkan empat fraksi yang telah dianalisis kandungan kimianya.

Fraksi ketiga dianalisis lebih lanjut dan didapatkan hasil kandungan tiga jenis

triterpen yaitu asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat.

Asam ursolat yang dapat diisolasi dari daun rosemary (Rosmarinus

officinalis L.) diketahui dapat menginduksi apoptosis melaui TNF-related

apoptosis-inducing ligand (apoptosis diinduksi TRAIL) pada sel kanker dan

JNK-mediated upregulation of death receptor (DR) dan penurunan decoy receptor-2

(DcR2) sehingga mampu mempengaruhi kelangsungan hidup sel (Prasad, dkk.,

2011). Asam ursolat pernah diujikan secara in vitro pada sel kanker payudara

MCF-7 yang menunjukkan kemampuan sitostatik asam ursolat pada fase G1.

Mekanisme yang diketahui mempengaruhi sinyal Ca2+ intrasel untuk menurunkan

proliferasi sel (Neto, 2011).

Asam betulinat yang diujikan secara in vitro pada sel kanker payudara

MCF-7 menunjukkan aktivitas sitotoksik kemudian diujikan pada tikus athymic

tanpa bulu yang dipapari dengan kanker payudara MCF-7 adenokarsinoma juga

menunjukkan terjadinya penghambatan pembentukan tumor dan penurunan

!

21

penurunan angiogenesis, proliferasi dan invasi sel kanker pada hewan yang diberi

perlakuan (Damle, dkk., 2013).

Asam oleanolat dapat menekan glikolisis aerobik. Bentuk dimer pyruvate

kinase muscle isoenzyme 2 (PKM2) mengakumulasi intermediet glikolitik dan

menghubungkan ke biosintesis nukleotid dan asam amino, yang berkontribusi

pada pertumbuhan sel. PKM2 banyak diekspresikan pada sel yang berproliferasi,

seperti sel tumor. Dalam penelitian Liu dkk. (2014) pada sel kanker PC3 dan

MCF-7 yang diberi asam oleanolat, dapat menurunkan ekspresi PKM2.

J. Landasan Teori

Kanker payudara terjadi akibat akumulasi kerusakan genetik, salah

satunya adalah ekspresi berlebih ERα _{yang dapat mempengaruhi kestabilan gen}

ko-aktivator dan ko-supresor. Penelitian ini menggunakan model sel kanker

payudara T47D karena kemampuannya mengekspresikan ERα_{. Ketika ER}α

berikatan dengan substratnya (estradiol) membentuk dimer yang dapat masuk ke

nukleus dan berikatan dengan ERE untuk mempengaruhi aktivator dan

ko-supresor. Kelebihan ekspresi ERα _{dapat menyebabkan penurunan transkripsi}

genetik untuk regulasi kematian sel dan meningkatkan gen penginduksi

proliferasi.

Tamoxifen merupakan pengobatan yang sering digunakan dalam terapi

kanker payudara karena sifatnya selektif terhadap ERα_{. Tamoxifen dapat}

menghambat proliferasi sel sekaligus menginduksi apoptosis secara langsung,

akan tetapi timbul permasalahan resistensi dan efek samping pada penderita

kanker payudara. Saat ini diperlukan solusi untuk mengatasi permasalahan dari

pengobatan tamoxifen, maka dibutuhkan agen kemoprevensi yang diharapkan

dapat mengatasinya, selain itu agar dapat menekan insidensi kanker payudara.

Rosmarinus officinalis L. tanaman yang biasa disebut dengan rosemary

telah lama dikenal dan diuji kemampuannya dalam mengatasi kanker payudara.

Bagian yang digunakan adalah daun yang dapat diekstraksi menggunakan metanol

dan diharapkan mengandung asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat.

Ketiga senyawa tersebut ini telah diteliti terutama pada model sel kanker

payudara MCF-7 yang juga mampu mengekspresikan ERα_{. Asam betulinat, asam}

oleanolat, dan asam ursolat dapat menghambat proliferasi dan menginduksi

apoptosis sel kanker payudara MCF-7. Dengan demikian, daun rosemary

berpotensial dikembangkan sebagai agen antikanker.

Ekstrak metanol daun rosemary dalam penelitian ini diujikan ke model

sel kanker payudara T47D dengan metode MTT untuk kuantifikasi kemampuan

sitotoksik didukung oleh komputasi statistik Program R agar didapatkan nilai IC50

dari ekstrak. Kemampuan induksi apoptosis ekstrak metanol daun rosemary

dikuantifikasi dengan metode Annexin V Fluos menggunakan alat flowcytometry

dan dilakukan penelusuran mekanisme molekuler ekstrak pada ERα _{sel melalui}

uji semi kuantitatif imunositokimia.

K. Hipotesis

Ekstrak metanol daun rosemary (Rosemarinus officinalis L.) memiliki

aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis

!

!

23

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian eksperimental murni

dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel-variabel yang terdapat pada penelitian ini, yaitu:

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi

konsentrasi dalam pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus

officinalis L.)

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini

adalah viabilitas sel (IC50), persentase sel apoptosis, dan level ekspresi

protein ERα_.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam

penelitian ini adalah kondisi sel uji, yaitu sel kanker payudara T47D. Bahan

uji yang digunakan berupa daun rosemary, didistribusikan oleh Dipokusumo

Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia)

berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni 2014.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali

dalam penelitian ini adalah usia tanaman, kondisi lingkungan, kontaminasi

lingkungan, dan lama inkubasi.

3. Definisi operasional

a. Ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) adalah

serbuk hasil ekstraksi total daun rosemary menurut metode Abe dkk.

(2002).

b. Uji sitotoksik MTT adalah metode yang digunakan untuk mengetahui

viabilitas sel atau jumlah sel yang masih hidup setelah pemberian

ektrak metanol daun rosemary pada sel kanker payudara T47D.

c. IC50 adalah konsentrasi ekstrak yang dapat mematikan 50% dari

populasi sel kanker payudara T47D.

d. Metode induksi apoptosis Annexin V adalah pengujian yang

dilakukan untuk menginduksi apoptosis ekstrak metanol daun

rosemary pada sel kanker payudara T47D.

e. Imunositokimia adalah metode pengujian untuk mengetahui level

ekspresi protein ERα _{pada sel kanker payudara T47D setelah}

pemberian ekstrak metanol daun rosemary.

f. Level ekspresi ERα _{adalah persentase sel yang berwarna coklat pada}

sitoplasma dan atau nukleus sel kanker payudara T47D dalam tiga

!

25

C. Bahan Penelitian

Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak metanol

daun Rosmarinus officinalis L. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel

kanker payudara T47D yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah

metanol pro analis (Merck), FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, FBS 0.5%, Media

Kultur Medium RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco), media

kultur medium 199 (Gibco), Tripsin EDTA 0.25%, PBS (Phosphat Buffer Saline),

Fungison (Gibco), Penisilin Streptomisin 1% v/v, akua bidestilata, etanol 96%,

natrium bikarbonat, HEPES (N-2-Hidroxy Ethyl Piperazine-N-Ethane Sulfonic

Acid), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0.01 N, DMSO (Merck)

0.5%, biru tripan, eter, etanol (CV. Labora), akuades, Nolvadex 20 mg (tablet

kontrol tamoxifen), metanol 70%, reagen Annexin V Fluos (Roche), reagen MTT

5 mg/mL, primary monoclonal antibody antiER! _{(Thermo Fisher Scientific),}

biotinylated universal secondary antibody (Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako),

xylol, substrat DAB.

D. Alat Penelitian

Peralatan refluks, alat-alat gelas, mantel heater, waterbath, blender,

rotary evaporator, incubator CO2, autoklaf, tangki nitrogen cair, alat-alat gelas

steril, laminar air flow cabinet (LAF), mikroskop fase kontras, tissue culture

flask, blue tip, yellow tip, neraca digital, mikropipet, mikroplate 96 sumuran, 24

sumuran, coverslip, ELISA reader, tabung conical 15 mL, tissue culture cluster

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

96, haemocytometer, mikroskop fluoresensi, kamera digital, mikroskop cahaya,

sentrifuge, neraca digital, flowcytometry.

E. Tata Cara Penelitian 1. Pengumpulan Tanaman

Tanaman rosemary (Rosmarinus officinalis L.) didistribusikan oleh

Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah,

Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni

2014. Bagian yang digunakan hanya bagian daunnya. Daun yang dipilih adalah

daun yang segar, berwarna hijau, dan bentuk yang masih utuh.

2. Determinasi Tanaman

Tanaman rosemary ini didapatkan melalui distributor komersil maka

diperlukan pemastian akan kebenaran tanaman yang digunakan. Sampel daun

rosemary dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi,

Universitas Gadjah Mada.

3. Penyiapan Simplisia

Daun rosemary dipetik kemudian dicuci bersih dibawah air mengalir.

Daun dipotong-potong, dikeringkan di atas tampah ditutupi kain hitam diberi

sirkulasi udara yang cukup dengan sinar matahari. Pengeringan pertama dilakukan

dalam waktu tujuh hari, setelah tujuh hari daun rosemary dipilah, daun yang

sudah kering (berwarna hijau kecoklatan dan mudah rapuh saat diremas) dari yang

masih kurang kering. Daun yang kurang kering dilanjutkan dengan pengeringan

!

27

dihaluskan menggunakan blender, serbuk disimpan dalam plastik clip yang diberi

silika penjerap lembab dalam wadah tertutup di suhu ruang (Alfredo, 2012).

4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary

7,3 g serbuk simplisia daun rosemary

1. Ditambahkan metanol absolut 30 mL. 2. Direfluks selama 30 menit.

3. Proses refluks diulang tiga kali dengan penggantian pelarut. 4. Campuran disaring lalu digabungkan.

Gabungan ekstrak

1. Dipekatkan menggunakan rotary evaporator selama 5 menit. 2. Dikeringkan di atas waterbath pada suhu 800C hingga mencapai

bobot tetap.

Residu serbuk hijau tua

Diambil 0,5 g

1. Ditambahkan 10 mL metanol 60%. 2. Divortex selama 1 menit.

3. Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. 4. Disaring, endapan yang tertahan dikumpulkan.

Endapan

1. Ditambahkan 10 mL metanol absolut.

2. Disaring kemudian cairan dikumpulkan dan dipekatkan dengan

rotary evaporator.

3. Dilanjutkan dengan pengeringan dengan waterbath pada suhu 800C sampai mencapai bobot tetap.

Serbuk ekstrak metanol daun rosemary

!

Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary (Abe, dkk., 2002).

!

5. Panen Sel

Pada awalnya sel ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga

konfluen, kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan

mikropipet. Ke dalam cawan petri ditambahkan PBS untuk mencuci kemudian

dibuang dan ditambahkan 0,5 mL tripsin secara merata dalam cawan petri, setelah

itu ditutup dan didiamkan selama 3 menit hingga sel terlepas di dalam inkubator.

Setelah 4 menit ditambahkan media RPMI lengkap, dicuplik sedikit diamati di

bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang

diperlukan selama pengujian dengan:

jumlah_!sel_!kuadran_!1+₂+3+₄

4 ×

10! mL

Sejumlah sel terhitung yang diperlukan ditambahkan media RPMI hingga

10 mL dan dimasukkan sebanyak 100 !_L ke dalam 96 well-plate untuk uji MTT, 2 mL ke dalam 6 well-plate untuk uji Annexin V Fluos, dan 1 mL ke dalam 24

well-plate dengan cover slip untuk uji imunositokimia, diinkubasi selama 24 jam

hingga konfluen (CCRC, 2009).

6. Preparasi Larutan Uji

Sepuluh miligram sampel dilarutkan dalam 100 !_L DMSO kemudian dilakukan pengenceran ke seri konsentrasi yang diinginkan. Pada tahap

pengenceran sampel, digunakan media kultur sebagai pelarutnya (CCRC, 2009).

7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT

Sel yang telah diinkubasi selama 24 jam di dalam well-plate dan didapati

!

29

diberi 100 !_L sampel yang telah diencerkan, pada kolom kontrol sel cukup diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dapat dikosongkan saja, lalu

diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam,

disiapkan larutan MTT yang telah dicampur dengan media kultur terlebih dahulu

kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang lalu diberi 100 !_L PBS dan dibuang, ke dalam tiap lubang diberi 110 !_L larutan MTT dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 !_L reagen stopper

SDS kemudian diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan

pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595

nm (CCRC, 2009).

8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos

Uji apoptosis sel menggunakan metode annexin dilakukan dengan

menanam sel (dengan populasi 500.000-1.000.000 sel/mL) sejumlah 2 mL

kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah konfluen, media kultur dibuang

kemudian diberi 100 !_L PBS lalu dibuang. Tiap lubang diberi sampel sebanyak 2 mL dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil

dengan mikropipet dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS,

kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi

200 !_L tripsin diinkubasi selama 3 menit, lalu dilihat dengan mikroskop apabila sel sudah terlepas diberi 1 mL media kultur dan ditampung lagi ke dalam conical

tube. Conical tube disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm.

Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi

campuran dan dipindahkan ke dalam eppendorf sebanyak 1 mL. Campuran dalam

eppendorf disentrifugasi (5 menit, 5000 rpm). Tahap selanjutnya adalah preparasi

reagen annexin pada eppendorf yang dibalut alumunium foil diisi dengan 550 !_L

buffer dan diberi 10 !_L!annexin juga 10 !_L propidium iodida. Eppendorf yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 !_L lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 !_L buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometry (CCRC, 2009).

9. Pengujian Ekspresi ER! _{dengan Metode Imunositokimia}

Pengujan imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24

well-plate diberi cover slip (jumlah sel 500.000 sel/mL) sejumlah 1 mL. Setelah

inkubasi 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur dibuang lalu diberi 500 !_L

PBS dan dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dan

diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca

preparat. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian

difiksasi menggunakan metanol 300 !_L lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip

diberi aquadest lalu dibuang (dilakukan dua kali), diberi hidrogen peroksida 100

!_L!selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan

blocking 100 !_L selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer (ERα_{) 100} !_L selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi antibodi sekunder 100 !_L selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi HRP sebanyak 100 !_L selama 10 menit kemudian dibuang dan diberi PBS, lalu diberi larutan DAB 100 !_L diinkubasi 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang.

Cover slip diberi 100 !_LHematoxylin selama 5 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang juga xylol dan

!

31

segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih dahulu lalu diawetkan. Pengamatan

dilakukan dengan mikroskop (CCRC, 2009).

F. Tata Cara Analisis Hasil 1. Analisis nilai IC50

Menurut Doyle dan Griffiths (2000) nilai IC50 adalah konsentrasi

yang menghambat pertumbuhan 50% populasi sel untuk mengetahui

potensi sitotoksisitasnya. Data hasil ELISA reader berupa absorbansi

(Abs) tiap sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel.

Absorbansi kontrol pelarut dianggap sama dengan absorbansi kontrol sel

maka persentase sel hidup dihitung dengan rumus:

%viabilitas_!sel ₌

Abs_!sel_{!dengan!perlakuan−}Abs_!kontrol_!media

Abs_!kontrol_!sel₋Abs_!kontrol_!media ×100%

Kemudian dihitung besar IC50 menggunakan program R antara log

konsentrasi dengan persen viabilitas sel.

2. Analisis apoptosis sel

Pengamatan kuantitatif dapat dilakukan dengan mengolah data

hasil pembacaan flowcytometry dengan metode cellquest dan alat FACS

Calibur.

3. Analisis ekspresi ER!

Pengamatan semi kuantitatif dilakukan dengan mengambil foto tiga

lapang pandang sel di bawah mikroskop. Tiga subjek independen

menghitung sel yang berwarna coklat sebagai sel yang mengekspresikan

ERα _{(positif) dan sel yang berwarna biru tidak mengekspresikan ER}α

(negatif). Sistem semi kuantifikasi mengikuti Vang dkk. (2006).

%ekspresi_!ERα₌

sel_!berwarna_!coklat

total_!sel_!satu_{!lapang!pandang}×100%

Level ekspresi ERα _{ditentukan dengan:}

a. 0 = kurang dari 5%

b. 1+ = 6% - 25%

c. 2+ = 26% - 50%

d. 3+ = 51% - 75%

!

!

33

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik,

kemampuan induksi apoptosis, dan ekspresi reseptor estrogen alfa (ERα_{) ekstrak}

metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) pada sel kanker payudara

T47D. Parameter aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dievaluasi

secara kuantitatif berdasarkan uji MTT dengan penurunan viabilitas sel dan

didapatkan nilai IC50 ekstrak pada sel T47D. Kemampuan ekstrak metanol daun

rosemary menginduksi apoptosis dikuantifikasi dengan uji Annexin V Fluos dan

hasil didapat dengan menggunakan flowcytometry. Regulasi ekspresi ERα

diidentifikasi dengan imunositokimia ditandai dengan jumlah sel yang positif

(berwarna coklat), dengan metode semi kuantitatif didapatkan level ekspresi ERα_.

Penelitian ini menggunakan tamoxifen sebagai pembanding, karena dewasa ini

digunakan sebagai terapi hormonal spesifik ERα _{untuk kanker payudara.}

A. Determinasi Tanaman dan Ekstraksi Daun Rosemary

Penelitian ini menggunakan bahan uji berupa serbuk daun rosemary

(Rosmarinus officinalis L.). Determinasi daun rosemary pada penelitian ini

bertujuan untuk membuktikan bahwa tanaman yang digunakan memang benar

tanaman yang dimaksud, yaitu tanaman Rosmarinus officinalis L. (Lampiran 1).

Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi berupa daun. Hasil dari

determinasi membuktikan bahwa tanaman tersebut benar merupakan tanaman

Rosmarinus officinalis L. dan hasil determinasi terlampir.

Penulis menggunakan metode ekstraksi refluks yang diambil dari jurnal

Abe dkk. (2002). Metode ekstraksi dengan refluks biasa digunakan untuk

mengekstraksi solid (pada penelitian ini adalah serbuk simplisia daun rosemary).

Metode ini adalah cara alternatif yang cepat menggunakan pemanasan, sehingga

pelarut yang dibutuhkan tidak terlalu banyak dan kehilangan substansi dapat

dikendalikan karena pelarut yang diuapkan akan berkondensasi dan kembali

mengekstrak simplisia. Pelarut yang digunakan harus dapat melarutkan senyawa

yang diharapkan, memiliki titik didih lebih rendah dari senyawa target sehingga

kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metode refluks dapat digunakan pada

metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik lebur yang

tinggi yaitu sekitar 292-3000C dan metanol digunakan karena memiliki titik didih

64,50C sehingga dapat menguap dalam sistem refluks selain itu metanol diketahui

dapat melarutkan senyawa target dengan baik.

Gambar 8. Struktur senyawa dalam ekstrak (Abe, dkk., 2002) dan ligan ER! A. Asam Betulinat, B. Asam Oleanolat, C. Asam Ursolat, D. 17-!-Estradiol

Penulis mengekstraksi 7,3 g serbuk daun rosemary dengan metanol dan

didapatkan serbuk ekstrak metanol daun rosemary sebanyak 0,1507 g. Abe dkk.

(2002) menyatakan bawah di dalam ekstrak ini didapatkan tiga komponen yaitu

!

35

asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antiproliferatif pada T47D diperkirakan disebabkan oleh kandungan asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat tersebut (Gambar 8). Gambar 8 menunjukkan kesamaan antara ketiga senyawa yang terdapat di dalam ekstrak metanol daun rosemary dengan ligan ERα_{, yaitu cincin aromatis satu; dua;} tiga; dan gugus fungsi hidroksil pada cincin satu.

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Metanol Daun Rosemary dengan Metode MTT 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide atau MTT adalah metode kolorimetrik standar yang digunakan untuk mengukur perubahan warna pada analisis proliferasi sel dan sitotoksik sel terhadap agen dengan kemampuan toksik dan medis. MTT adalah larutan berwarna kuning yang dapat berubah ke bentuk formazan yang tidak larut (Gambar 9). MTT direduksi oleh sel yang metabolismenya aktif ke formazan ungu oleh suksinat tetrazolium reduktase ke dalam enzim rantai pernapasan pada mitokondria. Formazan ungu dapat larut ketika diberi SDS sehingga dapat dibaca absorbansinya dan dihasilkan kurva yang berguna untuk mengetahui IC50 sampel.

Gambar 9. Kristal formazan yang terbentuk pada uji MTT.

(A). Sel T47D tanpa perlakuan, (B). Dengan pemberian tamoxifen 1 !", dan (C). Dengan pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) 30 !"/!"

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Kelebihan metode ini adalah tidak bersifat radioaktif, bisa digunakan

untuk berbagai jenis sel, dan analisis yang lengkap juga banyak dengan metode

scanning spektrofotometer. Kekurangan metode ini adalah kurang sesuai untuk

banyak jenis sel dalam satu waktu, beberapa sel yang tidak berproliferasi dapat

memetabolisme MTT dan memberikan hasil, dan dapat memberikan hasil yang

salah jika sel terkontaminasi oleh mikoplasma (Talupula, 2011). Atas dasar

prinsip, kekurangan, dan kelebihannya metode ini sesuai untuk digunakan dalam

analisis viabilitas sel kanker T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary

(Rosmarinus officinalis L.).

Tabel 1. Hasil Uji Sitotoksik

No.

Konsentrasi Ekstrak Daun

Rosemary (!g/_mL)

% Viabilitas Sel

1 2 3 Rata2 Rata2±SD

1 1 98,643 118,323 123,413 113,460 113,460±13,082 2 10 91,687 89,651 85,918 89,085 89,085±2,925 3 18 33,494 34,681 32,645 33,607 33,607±1,023 4 30 10,420 10,590 8,723 9,911 9,911±1,032 5 100 -0,269 -0,608 -0,438 -0,438 -0,438±0,170 6 178 4,991 1,258 1,258 2,502 2,502±2,155 7 300 8,045 7,027 7,027 7,366 7,366±0,588

No. Konsentrasi Tamoxifen (!_M)

% Viabilitas Sel

1 2 3 Rata2 Rata2±SD 1 0,01 4,233 5,163 4,698 4,698 4,698±0,465 2 0,1 1,910 2,375 2,530 2,272 2,272±0,322 3 1 107,537 106,736 102,891 105,731 105,731±2,489 4 10 105,834 100,568 92,514 99,639 99,639±6,708 5 100 103,201 105,524 104,440 104,388 104,388±1,162 6 1000 88,952 100,258 93,908 94,373 94,373±5,667

!

37

Pengukuran viabilitas sel T47D dilakukan untuk mengetahui jumlah sel

yang masih hidup setelah pemberian ekstrak metanol daun rosemary. Data

pengujian tersaji pada Tabel 1. Berdasarkan data yang disajikan di atas terlihat

terjadi penurunan jumlah sel yang hidup seiring dengan bertambahnya konsentrasi

ekstrak metanol daun rosemary, hal serupa juga terjadi pada sel kanker payudara

T47D yang diberi tamoxifen. Kendala yang dialami selama penelitian adalah

semakin besar konsentrasi sampel dapat mempengaruhi pembacaan absorbansi,

dikarenakan kepekatan larutan sampel menyebabkan pembacaan yang salah

sehingga yang terbaca bukan absorbansi jumlah sel yang masih hidup tetapi

absorbansi sampel itu sendiri.

Gambar 10. Hasil uji sitotoksik.

(A). Sel T47D yang normal tanpa perlakuan. (B). Sel T47D yang diberi tamoxifen 1 !", (C). Sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary 30 !"/!" dan (D) 1 !"/!"

! ! C

B A

D

sel mati

sel hidup

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Sel kanker dapat diamati di bawah mikroskop dan terlihat bentuk sel

kanker payudara T47D adalah elips. Kepadatan populasi antara sel yang diberi

dengan yang tidak diberi perlakuan dapat dibandingkan yaitu antara kontrol sel

dan perlakuan. Gambar 13 menunjukkan populasi sel pada konsentrasi sampel 1

!g/mL kepadatannya mendekati kontrol sel yang menandakan viabilitas sel masih tinggi. Pada konsentrasi 30_!!g/_mL populasi sel nampak berkurang kepadatannya. Perbedaan lain yang dapat ditemui adalah perubahan morfologi sel kanker T47D

saat diberi perlakuan dengan tamoxifen dan ekstrak metanol daun rosemary. Sel

T47D ketika diberi tamoxifen terbentuk gelembung-gelembung di dalam sel dan

beberapa diantaranya berbentuk bulat gelap, dan pada sel kanker T47D yang

diberi ekstrak metanol daun rosemary berbentuk bulat gelap. Sel yang mati akan

berbentuk bulat dengan warna yang lebih gelap (Gambar 10)._!

Tujuan dari penentuan IC50 adalah untuk mendapatkan konsentrasi

ekstrak metanol daun rosemary yang dapat mematikan setengah dari populasi sel

yang ada. Penentuan IC50 menggunakan Program R, didapatkan hasil IC50 dari

ekstrak metanol daun rosemary sebesar 13,95 !g/_mL sedangkan untuk tamoxifen sebesar 37,64 !_M (13,98 !g/_mL). Hal ini menunjukkan kemampuan sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary sama dengan tamoxifen. Penelitian ini

menggunakan kurva sigmoid karena dapat menggambarkan fenomena yang terjadi

di mana perubahan sekecil apapun terlihat sebagai respon terhadap rangsangan,

sampai ambang tercapai yang menandai terjadinya transformasi dramatis hingga

keadaan stabil tercapai dan tampak tidak responsif lagi atau tidak ada lagi

!

39

dalam penelitian ini agar interaksi yang terjadi antara sel kanker T47D dengan

bahan uji terlihat jelas pengaruhnya hingga tercapai titik konstan dimana tidak ada

lagi perubahan yang berarti. Program R merupakan sistem analisis komputasi

dengan sumber yang terbuka gratis, bahasa program yang sederhana, dan dapat

digunakan pada berbagai jenis komputer (Paula dan Arhipova, 2012).

C. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos

Kultur sel kanker payudara T47D diberi ekstrak metanol daun rosemary

(Rosmarinus officinalis L.) dan terbukti dapat menyebabkan kematian sel, akan

tetapi mekanisme kematian yang terjadi belum diketahui. Metode Annexin V

Fluos ini dapat digunakan untuk mengetahui mekanisme kematian sel akibat

pemberian ekstrak metanol daun rosemary pada kadar IC50. Pengujian ini

menggunakan flowcytometry sehingga didapatkan hasil yang disajikan pada

Gambar 11 dan Tabel 2. Metode Annexin V Fluos digunakan untuk menganalisis

secara kuantitatif sel yang mengalami apoptosis atau pun nekrosis secara cepat,

akan tetapi memerlukan sampel sel uji yang segar. Metode ini memanfaatkan jalur

perubahan membran pada proses apoptosis sehingga dapat membedakan sel yang

mengalami apotosis dengan nekrosis di mana reagen Annexin V Fluos berikatan

dengan sel yang mengalami apoptosis dan propidium iodida berikatan dengan sel

yang mengalami nekrosis.

Tabel 2. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Annexin V Fluos

Perlakuan

Total Sel (%)

Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4

Hidup Awal Apoptosis

Akhir

Apoptosis Nekrosis Kontrol Sel 91,85 6,24 1,75 0,21 Tamoxifen (37,64 !_M) 4,55 65,61 27,62 2,38 Ekstrak Metanol Daun

Rosemary (13,95 !g/mL) 3,21 2,22 17,46 77,33

Gambar 11. Hasil uji Annexin V Fluos.

(A). Kontrol sel, (B). Sel kanker T47D yang diberi tamoxifen 37,64 !"dan (C) diberi ekstrak metanol daun rosemary 13,95 !g/mL

Dapat dilihat dari hasil di Tabel 2 jumlah sel yang masih hidup pada

kontrol sel sebesar 91,85% sehingga masih dianggap cukup baik (lebih dari 90%),

karena pada dasarnya sel dapat mengalami apoptosis dan nekrosis secara natural.

Pada uji ini jumlah sel pada kontrol sudah cukup baik sehingga proses dapat

dilanjutkan. Pada sel T47D yang diberi tamoxifen (konsentrasi IC50 = 37,64 !M)

A B

!

41

sebagai obat yang bekerja sebagai inhibitor kompetitif ERα _{memiliki kemampuan}

induksi apoptosis yang tinggi, didukung oleh hasil sebesar 93,23%. Sel T47D

yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (konsentrasi IC50 = 13,95 !g/mL)

dapat menginduksi apoptosis sebesar 19,68% tapi cenderung menyebabkan

nekrosis pada sel yaitu sebesar 77,33% dapat diakibatkan oleh durasi inkubasi sel

dengan ekstrak yang terlalu lama sehingga terjadi kerusakan membran sel dan

terjadi nekrosis.

Radian satu pada hasil pembacaan flowcytometry menunjukkan sel yang

masih hidup sehingga tidak ada reagen annexin dan reagen propidium iodida yang

berikatan dengan sel. Radian kedua menunjukkan sel yang mengalami apoptosis

awal di mana reagen annexin akan berikatan dengan fosfatidilserin pada sel yang

mengalami apoptosis. Radian ketiga menunjukkan sel yang mengalami apoptosis

akhir di mana reagen annexin berikatan dengan fosfatidilserin sel yang mengalami

apoptosis, akan tetapi ada beberapa badan apoptosis yang mengandung bagian

nukleus mengalami kerusakan membran sehingga dapat berikatan dengan

propidium iodida. Radian keempat menunjukkan ikatan propidium iodida dengan

sel yang mengalami nekrosis.

Berdasarkan data ini ekstrak metanol daun rosemary dapat menyebabkan

kematian sel lebih besar dari tamoxifen dilihat dari jumlah sel yang masih hidup

pada sel yang diberi ekstrak hanya tersisa 3,21% sedangkan pada tamoxifen

sebesar 4,55%. Kemampuan induksi apoptosis ekstrak metanol daun rosemary

lebih rendah dari tamoxifen, dan cenderung menyebabkan kematian sel melalui

jalur nekrosis. Kematian dengan jalur nekrosis diharapkan tidak terjadi karena

dapat menyebabkan respon inflamasi. Sel yang mengalami apoptosis akan

cenderung dihadapkan pada peristiwa fagositosis tetapi sel yang mengalami

nekrosis dapat memicu sinyal tubuh untuk melepaskan mediator inflamasi ke

daerah kerusakan (Schulze-Osthoff, 2008). Pada tabel terlihat jumlah sel yang

mati lebih dari 50% padahal pengujian ini dilakukan pada kadar IC50 ekstrak

metanol daun rosemary. Hal ini dapat terjadi karena inkubasi sel dengan sampel

yang terlalu lama ataupun ketika pereaksian dengan reagen Annexin V Fluos

sehingga kematian sel semakin banyak terjadi.

D. Pengujian Ekspresi ER! _{dengan Metode Imunositokimia}

Tujuan dari imunositokimia adalah menentukan level ekspresi reseptor

estrogen alfa (ERα_{) pada sel T47D setelah pemberian sampel. Imunositokimia}

merupakan teknik untuk mendeteksi protein atau antigen dalam sel dengan

mendeteksi reaksi antigen antibodi dengan bantuan penanda, dalam penelitian ini

menggunakan pewarna sehingga teknik ini lebih cocok disebut dengan

immunostaining. Kelebihan metode ini adalah morfologi sel dapat diawetkan

sehingga pola pewarnaan sel dapat diamati secara berkesinambungan dan

berbagai jenis antibodi dapat digunakan untuk pendeteksian, akan tetapi

kekurangan dari metode ini adalah proses yang cukup lama dan rumit juga mahal

dan terbatas pada penilaian semi kuantitatif karena menggunakan sudut pandang

subjektif, oleh sebab itu diperlukan metode standar untuk mengkuantifikasi level

!

43

Tabel 3. Hasil Perhitungan Ekspresi ER!

Subjek

Ekspresi Reseptor Estrogen Alfa pada Sel Kanker Payudara T47D KS No-Ab KS Ab Tamoxifen Rosemary LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3

1 0 0 0 175 101 177 0 0 0 8 11 10 2 0 0 0 175 101 177 0 0 0 10 15 11 3 0 0 0 175 101 177 0 0 0 8 14 8

Σ_{Sel 514 365 193 175 101 177 56 80 63 138 154 126}

% 0 0 0 100 100 100 0 0 0 6,28 8,66 7,67 Level 0 0 0 4+ 4+ 4+ 0 0 0 1+ 1+ 1+

Gambar 12. Hasil uji imunositokimia.

(A). Kontrol sel T47D yang diberi antibodi ER!_{. (B). Kontrol sel yang tidak diberi antibodi} ER!_{. (C). Sel T47D yang diberi tamoxifen 37,64 !" dan (D). Sel T47D yang diberi ekstrak}

metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) 13,95 !"/_!". A

D C

B

tidak mengeskpresikan ERa

mengeskpresikan ERa

Lampiran 2. Seri Kadar Ekstrak Metanol Daun Rosemary Dan Tamoxifen

Rosemary Tamoxifen

10 mg + 100 !_L DMSO = 100.000!g/_mL

intermediet = 500 !g/mL = 5 !L bulk + 995 !_L MK

10 mg + 100 !L DMSO + 900 !L MK = 2000 !M

Konsentrasi Intermediet MK Konsentrasi Sampel MK 300!g/_mL 300_!!_L 200_!!_L 1000 !_M 500 !L

bulk

500 !_L 178!g/_mL 178_!!_L 322 !_L 100_!!_M 50 !_L C1 450

!_L 100!g/_mL 100_!!_L 400 !_L 10 !_M 50 !_L C2 450

!_L

30!g/mL 30!!_L 470 !L 1 !M 50 !L C3 450

!_L 18!g/mL 18!!_L 482 !L 0,1!!_M 50 !L C4 450

!_L 10!g/mL 50!!_L 450 !L 0,01!!_M 50 !L C5 450

!_L

Lampiran 5. Lapang Pandang Preparat T47D Yang Diberi (A). Ekstrak Metanol Daun Rosemary Dan (B) Tamoxifen

A

A

A

B

B

Lampiran 6. Lapang Pandang Kontrol Sel (A). Tanpa Antibodi Dan (B). Dengan Antibodi Pada Preparat T47D

A

A

A B

B B

BIOGRAFI PENULIS

Penulis Skripsi berjudul “Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanolik Daun Rosemary

(Rosmarinus officinalis L.) terhadap Sel

Kanker Payudara T47D melalui Regulasi

Ekspresi Reseptor Estrogen- ! _{(ER !}! _)” memiliki nama lengkap Clara Dewi Anggraeni, merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara pasangan Bapak Aloysius Bekti Subagyo dan Ibu Ambrosia Sariningsih. Penulis dilahirkan di Jakarta, 10 Agustus 1993. Pendidikan formal yang ditempuh yaitu TK Mater Dei (1997-1999), tingkat sekolah dasar di SD Santa Ursula (1999-2005), tingkat sekolah menengah pertama di SMP Mater Dei (2005-2008), dan tingkat sekolah menengah atas di SMA Mater Dei (2008-2011). Pada tahun 2011, penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Semasa studinya, penulis aktif mengikuti kegiatan keorganisasian dan kepanitiaan diantaranya adalah Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2013), Kordinator Divisi Publikasi dan Informasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2012), Anggota Divisi Hubungan Masyarakat Panitia Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF dan Ketua DPMF Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2011).