KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT BT951 SERTA EVALUASI POTENSINYA SEBAGAI BAKTERI PROBIOTIK PADA BUDIDAYA UDANG WINDU ( Penaeus monodon)

  Karakterisasi dan identifikasi molekuler isolat BT951 ..... (Muliani) KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT BT951 SERTA EVALUASI POTENSINYA SEBAGAI BAKTERI PROBIOTIK Penaeus monodon) PADA BUDIDAYA UDANG WINDU (

  

M uliani, Nur baya, dan Endang Susianingsih

  Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau Jl. Makm ur Dg. Sit akka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selat an

  E- m ail: mulianim@yahoo.com (Naskah diterima: 25 Juli 2011; Disetujui publikasi: 29 September 2011)

ABST RAK

  Penelitian ini bertujuan untuk m engetahui karakteristik, dan m enentukan posisi relatif i sol at BT9 5 1 m el al u i i d en t i f i k asi m ol ek u l er m en g g u n ak an g en 1 6 S- r RNA, ser t a m engevaluasi pot ensinya sebagai probiot ik pada budidaya udang windu (P. Monodon). Penelitian ini m eliputi tahapan: (1) isolasi dan karakterisasi secara m orfologi; (2) uji fisiologi dan biokim ia; (3) identifikasi isolat BT951 secara m olekuler; (4) uji sensitifitas t erhadap ant ibiot ik ; (5) uj i daya ham bat isolat BT951 t erhadap V. harveyi; (6) uj i patogenisitas isolat BT951 terhadap larva udang; (7) uji tantang isolat BT951 dengan

  o V. harveyi; (8) uji ketahanan isolat BT951 pada suhu ruang dan suhu 4

  C. Hasil penelitian m enunjukkan bahwa, secara m orfologi isolat BT951 koloninya berbentuk bulat kecil, berwarna krem kekuningan, t epian licin, dan cem bung, t erm asuk kelom pok bakt eri gram posit if yang berbent uk bat ang, oksidase dan kat alase posit if, indol negat if, dan

  o

  bersifat m ot il. Bakt eri ini dapat t um buh pada suhu 40

  C, salinit as 0- 50 ppt , dan sensit if terhadap beberapa jenis antibiotik seperti rifanpisin, eritrom isin, dan kloram penikol akan t et api resit en t erhadap am pisilin, oksit et rasiklin, gent am isin, dan furazolidon. Berdasarkan hasil analisis gen 16S- rRNA m enunjukkan bahwa isolat BT951 term asuk kelom pok Brevibacillus laterosporus dengan indeks kedekat an sebesar 97,7%. Bakt eri ini t idak bersifat pat ogen t erhadap udang windu, dapat m engham bat pert um buhan bakteri V. harveyi, dan pot ensial dijadikan sebagai bakt eri probiot ik pada budidaya udang windu.

  Br evib acillus lat er osp or us, Penaeus KATA KUNCI: isolat BT 9 5 1 , p r ob iot ik , m o n o d o n ABST RACT : Char act er iz at ion and m olecular id ent if icat ion of BT 9 5 1 and e v a l u a t i o n o f i t s p o t e n t i a l a s p r o b i o t i c b a ct e r i a i n t i g e r shr im p (Penaeus monodon) cult ur e. By: M uliani, Nur baya, and En d a n g Su si a n i n g si h The aims of this experiment were to characterize and analyze the relative position of BT951 isolate through molecular biology identification using 16S-rRNA gen, and evaluate its potential as a probiotic bacteria in tiger shrimp (P. monodon) culture. The experiment consisted of several steps i.e; (1) isolation and morphological characterization; (2) biochemical and physiological characterization; (3) molecular identification of BT951; (4) antibiotic sensitivity test; (5) inhibition test of BT951 bacteria to V. harveyi; (6) pathogenecity test of BT951 isolate to tiger shrimp larvae;

  

(7) in vitro and in vivo challenge test of BT951 bacteria against V. harveyi; (8)

survival test of BT951 at room and 4 o

  C temperatures. Morphological characterization

showed that the colonies of BT951 were small, circular, yellowish-white, has smooth

edges, and convex shape. Physiological and biochemical test showed that BT951

isolate was gram positive, short-rod shape, catalase and cytocrome oxidase positive,

indole negative, non motile, protelytic, Lysine and arginin Decaroxilase positive. This

bacteria can still grow at 40 o

  C, salinity of 0-50 ppt, and sensitive to rifampicine,

erythromicine, and chloramphenicol, but resistant to ampicilin, oxytetracyline,

gentamicine, dan furazolidone. Base on 16S-rRNA sequencing, BT951 isolate was

closely related (97.7%) to DNA sequence of Brevibacillus laterosporus. This bacteria

is not pathogenic to tiger shrimp larvae, known to have inhibitory effect on the

growth of V. harveyi, and potential as probiotic bacteria in tiger shrimp culture.

  

KEYWORD S: i so l a t BT 9 5 1 , Pr o b i o t i k , Brevibacillus laterosporus, Penaeus

monodon

  PENDAHULUAN

  Keberhasilan budidaya udang di t am bak masih terkendala oleh serangan penyakit yang m asi h saj a t er u s t er j ad i m esk i p u n t el ah dilakukan berbagai upaya pencegahan dan penanggulangan. Serangan penyakit tersebut t idak hanya t erjadi pada level budidaya akan t et api juga pada level perbenihan. Di t am bak, serangan penyakit umumnya disebabkan oleh serangan virus. Ada beberapa jenis virus yang sering t erident if ikasi m enginf eksi udang di t am bak di ant aranya, MBV, IHHNV, HPV, dan WSSV. Nam u n d i an t ar a j en i s- j en i s vi r u s t ersebut , WSSV m erupakan penyebab ut am a t erjadinya kem at ian udang di t am bak yang beref ek t erhadap m erosot nya indust ri per- t am b ak an u d an g (Leon ar d o et al., 2 0 0 5 ; Balasubram anian et al., 2008). Jenis virus ini t idak hanya m enyerang udang windu t et api j u g a u d an g van am e yan g saat i n i t el ah dibudidayakan secara meluas di hampir seluruh pertambakan di Indonbesia. Serangan penyakit di level perbenihan masih saja disebabkan oleh serangan bakt eri berpendar yait u V. harveyi. Mesk i p u n ser i n g d i t em u k an ad an ya l ar va udang yang positif terinfeksi oleh WSSV, akan t et api kem at ian m assal benur di perbenihan akibat serangan virus ini masih jarang, bahkan ham pir t idak pernah ada laporan akan hal t ersebut .

  Ber b ag ai u p ay a p en c eg ah an d an p en an g g u l an g an p en yak i t p ad a b u d i d aya udang windu telah dilakukan, namun hasilnya b el u m m em b er i k an h asi l yan g m ak si m al seh i n g g a ser an g an p en yak i t m asi h t er u s t erjadi. Serangkaian penelit ian m aupun uji cob a t elah d ilak uk an unt uk m end ap at k an m et od e p encegahan d an p enanggulangan penyakit pada udang windu antara lain dengan m enggunak an obat - obat an dan ant ibiot ik sebagai anti bakteri (Karunasagar et al., 1994). Pengelolaan lim bah budidaya udang dengan m enggunakan t andon dan biofilt er juga t elah banyak dilakukan (Chanratchakool et al., 1995; Muliani et al., 1998a). Upaya lain yang t elah dilakukan unt uk pencegahan penyakit pada b u d i d ay a u d an g w i n d u ad al ah d en g an m erangsang kekebalan non- spesif ik m elalui penggunaan vaksin dan im unostim ulan (Itam i & Takashi, 1991; Sung et al., 1994; Devaraja

  et al., 1998; Salfira, 1998; Vargas- Albores et al., 1998), penggunaan ektrak mikroalga untuk

  merangsang kekebalan dan resistensi terhadap p en y ak i t (Su p am at t ay a et al., 2 0 0 5 ), penggunaan probiot ik (Aust in & Day, 1990; Lavilla- Pit ogo et al., 1998; Rengpipat et al., 1998; Maeda, 1999), serta penggunaan bahan ak t if sponge dan hydrozoan sebagai ant i- bakt eri (Ahm ad et al., 1995; Muliani et al., 1998b; Suryati et al., 2000). Nam un dem ikian usaha tersebut belum membuahkan hasil yang m aksim al dan serangan penyakit m asih saja terus terjadi.

  Seleksi dan upaya pem anfaat an beberapa j eni s b ak t er i yang d i i sol asi d ar i b er b ag ai sum ber sebagai, biokont rol, probiot ik, dan penghasil antivibriosis telah banyak dilakukan (Devaraja et al., 2002). Oclarit et al. (1994) telah m engisolasi bakt eri pengahsil ant ibakt erial,

  o-Aminiphenol dari sponge, Adocia sp. Populasi V. harveyi di lingkungan pemeliharaan udang

  dapat ditekan dengan cara mengintroduksikan bakt eri t ert ent u yang diisolasi dari perairan laut di sekitar tambak atau pembenihan udang (Tjahjadi et al., 1994). Selanjut nya Rosa et al. (1997) m engisolasi bakt eri pengham bat V.

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 457-468

  Karakterisasi dan identifikasi molekuler isolat BT951 ..... (Muliani)

  tergantung kondisi sedimen tambak, semakin t inggi kadar bahan organik di dasar t am bak m aka t ingkat pengenceran sem akin t inggi, k ar ena b iasanya p op ulasi b ak t er inya j uga sem ak i n t i n g g i ). Sel an j u t n ya d ar i set i ap pengenceran diam bil 100 m L dan disebar pada media Triptic Soy Agar (TSA) dalam cawan pet ri, kem udian diinkubasi pada suhu ruang selam a 1- 2 hari. Koloni bakt eri yang t um buh selanjutnya diidentifikasi berdasarkan bentuk, warna, elevasi, dan ukuran koloni bakteri yang t erbent uk (At las, 1997; Prescot t et al., 2002). Bakteri yang tum buh dim urnikan dan dikultur pada m edia TSA yang dim iringkan, diinkubasi selam a 48 jam dan selanjut nya diuji secara fisiologi dan biokimia.

  C, 10.000 rpm selama

  water bath pada suhu 28 o

  Isolat BT951 dit um buhkan dalam m edia SWC kaldu. Kult ur diinkubasi dalam shaker

  Ekstraksi DNA

  dengan m esin Sequenser.

  milk, Cycle sequensing d en g an m et o d e BigDye, p r esi p i t asi DNA, d an sek uensi ng

  Unt uk m enent ukan ident it as isolat BT951 b er d asar k an sek uen 1 6 S- r RNA, d ilak uk an an al i si s yan g m el i p u t i b eb er ap a t ah ap an sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh Marchesi et al. (1998) dan t elah dim odif ikasi oleh Suwant o et al. (2 0 0 0 ) yait u m elip ut i ek st r ak si DNA, am p lif ik asi gen 1 6 S- r RNA dengan PCR, gene clean dengan m etode glass

  Identif ikasi Isolat BT9 5 1 Secara M olek uler

  Karakt erisasi fisiologi dan biokim ia isolat BT951 yang dilakukan adalah pewarnaan gram, oksidase, kat alase, indol, m ot ilit as, akt ivit as am ilolit ik , ak t ivit as prot ease, dan ak t ivit as kitinase (Hadioetomo, 1993; Muir, 1996).

  Karakterisasi Fisiologi dan Biokimia

  Sedim en t am bak diam bil m enggunakan bot ol sam pel st eril kurang lebih 10 g, di- m asukkan ke dalam coolbox dan selanjut nya dibawa ke laboroat orium Pat ologi, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau, Maros. Sedimen t am bak dit im bang sebanyak 1 g, kem udian d i en c er k an d en g an l ar u t an f i s i o l o g i s (NaCl8,5%) secara berseri (bisa sam pai 10

  harveyi d ar i air laut , air t am b ak , d an air

  BAHAN DAN METODE Isolasi dan Karakterisasi Secara M or f ol og i

  Pemanfaatan bakteri- bakteri probiotik yang diisolasi dari berbagai sumber belum maksimal karena adanya beberapa kendala di ant ara- nya opt im alisasi pert um buhan, kem am puan b er ad ap t asi, d an k onsist ensi ant ivib r iosis yang dim iliki belum diket ahui. Kem am puan t um buh dan berkem bang suat u jenis bakt eri probiotik sangat dipengaruhi oleh asal bakteri tersebut diisolasi. Untuk lebih mengoptimalkan pert um buhan dan perkem bangan probiot ik yang digunakan pada budidaya udang windu, maka dicoba mengisolasi bakteri dari sedimen t am bak . Menurut Poernom o (2004) bahwa probiotik yang diaplikasikan ke dalam tambak harus mampu hidup di dalam tambak, mampu tumbuh, mampu berkembang biak, dan mampu berfungsi/ bekerja akt if pada bidang m asing- m asing sesuai yang diharapkan. Oleh karena it u, karakt erisasi dan ident if ikasi baik secara f i si ol og i m au p u n b i ok i m i a ser t a eval u asi pot ensinya sebagai probiot ik dari suat u jenis b ak t er i p er l u d i l ak u k an u n t u k l eb i h m e- m ak s i m al k an p en g g u n aan n y a s eb ag ai probiot ik di t am bak. Penelit ian bert ujuan ini untuk mengetahui karakteristik, mengevaluasi p o t en s i n y a s eb ag ai p r o b i o t i k , s er t a menentukan posisi relatif isolat BT951 melalui analisis gen 16S- rRNA.

  g i l t h ead sea b r eam (Sparus aurata, L), s ed an g k an Bj o r n s d o t t i r et al . , (2 0 1 0 ) m enisolasi probiot ik dari larva ikan sebelah (Atlantic halibut).

  et al. (2010) m engisolasi probiot ik dari larva

  Merrif ield et al. (2010) m engisolasi probiot ik dari lingkungan budidaya ikan salm on, Avella

  al. (2010) m engisolasi probiot ik dari abalon,

  isolat bakt eri laut , baik dari sedim en, air, dan k ar ang yang p ot ensi al m eng ham b at p er - t um buhan bakt eri V. harveyi pat ogen udang windu. Macey & Coyne (2005) dan Iehat a et

  et al. (2003), t elah m engisolasi sedikit nya 15

  udang) dan dapat m engurangi jum lah larva udang yang m at i. Haryant i et al. (2000) t elah m engisolasi t iga isolat bakt eri yang m am pu m engham bat pert um buhan V. harveyi pada m edium agar dalam cawan pet ri dan sat u di ant ara t iga isolat t ersebut m am pu m enekan p er t u m b u h an V. harveyi p ad a m ed i a pemeliharaan larva udang. Sedangkan Muliani

  carchariae YA32.2 (pat ogen t erhadap larva

  p em el i h ar aan l ar va. Hal a (1 9 9 9 ) m en g e- m uk ak an bahwa V. metschnicovii Z dan M yang diisolasi dari larva udang sehat ef ekt if m engham bat pert um buhan dan pelekat an V.

• 4

  55

  C selama 2 menit, tahap denat urasi DNA ut as ganda pada suhu 92

  Pemurnian DNA

  C (Suwanto et al., 2000).

  o

  C. Selanjut nya hasil PCR disimpan pada suhu - 20

  o

  C selam a 20 m enit , dan t ahap st op PCR pada suhu 4

  o

  C selam a 1 m enit , t ahap post PCR pada suhu 75

  o

  C selama 30 detik, dan tahap perpanjangan pada suhu 75

  o

  24 jam. Sel bakteri dipanen dengan mengambil 1 m L suspensi biakan bakt eri, lalu dim asuk- k an k e d al am Ep p end or f vol um e 1 ,5 m L. Selanjut nya disent rifugasi dengan kecepat an 6000 rpm selam a 5 m enit dan supernat annya dibuang. Hal ini dilakukan dua kali. Pelet bakteri yan g t er b en t u k k em u d i an d i r esu sp en si dengan 250 mL buffer 1xTE dan 2 mg/ L lisozim, diikubasi 37

  C selam a 30 det ik, t ahap annealing pada suhu

  o

  pre start pada suhu 94 o

  Cycle Sequensing, Presipitasi, dan Sekuensing DNA

  di mana masing- masing siklus terdiri atas tahap

  running pada PCR dilakukan dalam 30 siklus,

  CAGGCCTAACACATGCAAGTA- 3’) dan reverse prim er 1387r (GGGCGGWTGGTACAAGGC- 3’ ) ( Marchesi et al. 1998; Suwant o et al., 2000). Sem ua k om p onen r eak si d icam p ur d alam mikrotube dan selanjutnya di- running. Proses

  Pada t ahapan ini pereaksi dan langkah k erj a dilak uk an berdasark an m et ode yang dilaporkan oleh Marchesi et al. (1998) yang t elah dim odifikasi oleh Suwant o et al. (2000).

  Evaluasi Potensi Isolat BT9 5 1 sebagai Probiot ik Uji Sensitivitas terhadap Antibiotik

  Isolat BT951 diuji sensitivitasnya terhadap b eb er ap a j en i s an t i b i o t i k d i an t ar an ya; g en t am i si n , k l o r am p en i k o l , er i t r o m i si n , furazolidon, dan rifam pisin pada konsent rasi 25 m g/ m L. Set iap jenis ant ibiot ik t ersebut dicam purkan dalam m edia SWC 100% (air laut 750 m L, akuades 250 m L, bakt o pept on 5 g, ekst rak kham ir 1 g, gliserol 3 m L, dan bakt o agar 15 g). Penam bahan ant ibiot ik ke dalam media SWC dilakukan setelah media disterilkan d an suhunya sek it ar 5 0

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 457-468

  C selam a 20 m enit . Selanjut nya k e dalam cam puran t er seb u t d i t am b ah k an 6 5 0 m L p h en o l : chloroform:isoamyl alkohol (25:24:1), divortex selama 30 detik, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm pada suhu ruang selama 10 m enit . Supernat an diam bil dengan m ikro p i p et d an d i p i n d ah k an k e d al am t ab u n g Eppendorf st eril yang t elah diisi dengan 600 m L isopropanol dan dibolak balik sehingga timbul benang- benang DNA dan dibiarkan pada suhu r uang selam a 3 0 m enit . Selanj ut nya disent rif ugasi dengan kecepat an 5.000 rpm pada suhu ruang dan set elah it u supernat an d i b u an g . DNA d al am b en t u k p el et d i cu ci dengan 300 m L et hanol 70%, disent rif ugasi selam a 5 m enit pada suhu ruang dan set elah i t u et an o l d i b u an g . Pel et DNA d i k er i n g - udarakan at au dengan m enggunakan pom pa vakum untuk m enguapkan etanol yang m asih t er sisa. Langk ah t er ak hir d alam ek st r ak si DNA adalah penam bahan akuabides bebas nuklease at au buffer 1x TE at au Elut ion Buffer (EB) dan selanjutnya DNA disim pan pada suhu

  o

  Set elah it u dit am bahkan 65 m L NaCl 5 M, di bolak- balik sehingga tercampur dengan baik, k em udian dit am bahk an 80 m L CTAB 10%. Dihom ogenkan sam pai berwarna put ih susu, kem udian diinkubasi pada suhu 65

  o C selam a satu jam (tiap 15 m enit dikocok).

  37

  C selam a 30 m enit . Selanjut nya dit am bahkan SDS 10% sebanyak 50 m L dan 5 m L Proteinase- K, dibolak- balik sampai bening berlendir. Cam puran ini diinkubasi pada suhu

  o

  Pad a t ah ap an i n i DNA yan g t el ah d i - am plif ikasi dengan PCR di “running” dalam elekt rof oresis kem udian dim urnikan dengan m et ode Glass milk.

• 20

  23 m L; DNA tem plet 0,5 m L; 1 m L 63f prim er; dan 1 m L 1387r prim er. Prim er yang diguna- kan adalah prim er universal unt uk dom ain b ak t er i a b er u p a For war d p r i m er 6 3 f (5 ’ -

  Sebelum dilakukan am plif ikasi gen 16S- rRNA dengan PCR, t erlebih dahulu dilakukan p en g ecek an t er h ad ap D N A y an g t el ah d i ek st r ak m el al u i el ek t r of or esi s g el m i n i (Suwant o et al., 2 0 0 0 ) at au d engan gene Quant . Am plif ik asi gen 1 6 S- r RNA dengan PCR d i g u n ak an Ready to Go PCR Bead s dengan kom ponen reaksi t erdiri at as ddH

  Amplifikasi Gen 1 6 S- rRNA dengan PCR

  o

  C, selanj ut nya d i t uang ke dalam cawan pet ri. Media t ersebut selanjut nya digunakan sebagai m edia biakan i so l at BT9 5 1 . Sen si t i vi t as i so l at BT9 5 1 t erhadap ant ibiot ik yang digunakan dit andai d eng an t i d ak ad anya p er t um b uhan i sol at t er seb ut p ad a m ed ia yang t elah d ib ub uhi d en g an an t i b i o t i k , set el ah 4 8 j am m asa inkubasi.

  o C untuk keperluan selanjutnya.

2 O

• 10

  Konsent rasi isolat BT951 yang digunakan pada uj i pat ogenisit as adalah 10

  2 CFU/ m L, B) Isolat BT951 dengan kepadat an

  10

  4 CFU/ mL, C) Isolat BT951 dengan kepadatan

  10

  6 CFU/ mL, D) Kontrol (V. harveyi 10

  7 CFU/ mL

  t an p a BT9 5 1 ). Masi n g - m asi n g p er l ak u an diulang tiga kali. Pengamatan populasi bakteri d an si n t asan l ar va u d an g wi n d u d i am at i setelah 96 jam.

  Uji Ketahanan Isolat BT9 5 1 pada Suhu Ruang dan Suhu 4 o C

  Karakterisasi dan identifikasi molekuler isolat BT951 ..... (Muliani)

  Uji Patogenisitas Isolat BT9 5 1 terhadap Larva Udang

  Uji Daya Hambat Isolat BT9 5 1 terhadap V. harveyi

  C selam a 2 4 - 4 8 j am , set elah it u zona hambatan yang terbentuk diukur dengan mistar penggaris pada t iga posisi dan selanjut nya diratakan.

  o

  28

  cfu/ m L). Kem udian diinkubasi pada suhu

  9

  8

  yang t um buh diam bil dengan jarum Ose dan disuspensikan dalam larutan garam fisiologis (0,85% (w/ v) NaCl). Kem udian disebar pada m ed i a SWC 1 0 0 % d al am c aw an p et r i , selanj ut nya dit aruh paper disk st eril yang berdiameter 7 mm. Paper disk ditetesi dengan b i ak an i so l at BT9 5 1 seb an yak 1 0 - 2 0 L (konsentrasi biakan dalam suspensi sekitar 10

  Sucrose Agar) selam a 24 jam . Koloni t unggal

  Bakt eri V. harveyi MR5339 dit um buhkan pada m edium TCBSA (Thiosulfate Citrate Bile

   Uji Tantang Secara In vivo Uji t ant ang secara In vivo dilakukan di dalam akuarium kaca yang berkapasit as 3 L. Wadah t ersebut diisi air laut st eril dengan kadar garam 28 ppt sebanyak 2 L, dan ditebari larva udang st adia PL7 sebanyak 25 ekor/ wadah. Perlakuan dalam penelit ian ini t erdiri at as A) Isolat BT951 dengan kepadat an 10

6 CFU/ m L dengan metode perendaman (Hameed, 1995).

  6 CFU/ m L (Tjahjadi,

  4

  Wadah yang digunakan adalah st oples kaca b er k ap asit as 3 L yang d iisi air laut st er il dengan kadar garam 28 ppt sebanyak 2 L dan dit ebar i dengan lar va udang sebanyak 2 5 ekor/ wadah.

  Mor f ologi isolat BT9 5 1 disaj ik an pada Gam bar 1 . Pada Gam bar 1 t er lihat bahwa koloninya berbent uk bulat kecil, berwarna krem kekuningan, t epian licin, dan cem bung (Prescott et al., 2002). Pada media TSA bakteri ini pertumbuhannya agak lambat yaitu sekitar 72 jam masa inkubasi.

  HASIL DAN BAHASAN Morf ologi BT9 5 1

  Pen yi m p an an i so l at BT9 5 1 d i l ak u k an selam a 10 bulan, dan dilak uk an sampling pertumbuhan satu kali dalam sebulan.

  b i ak an u n t u k sampling b er i k u t n ya t i d ak t erganggu, dan biakan yang t ersisa set elah di- sampling langsung dimusnahkan.

  sampling sehingga setiap dilakukan sampling

  C. Jum lah bot ol k ecil yang berisi biak an isolat BT951 disesuaikan dengan f rekuensi

  o

  Bakt eri isolat BT951 dit um buhkan pada m edia biakan m urni at au m edia kaldu m urni (nutrient broth). Wadah yang digunakan untuk m enum b uhk an isolat BT9 5 1 ad alah g elas Er l enm eyer 2 5 0 m L. Bi ak an d i t um b uhk an p ad a su h u r u an g sam b i l d i g o yan g p ad a inkubator bergoyang selama 24 jam kemudian di- sampling sebagai data pertum buhan awal. Untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi, m aka biakan dibagi ke dalam botol kecil yang steril dan disimpan pada suhu ruang dan suhu

  1994; Hala, 1999; Muliani et al., 2003). Biakan bakteri BT951 dimasukkan ke dalam media SWC kaldu sesuai dengan kepadat an yang t elah ditentukan, dan selanjutnya biakan V. harveyi dim asukkan ke dalam m edia t ersebut . Biakan kedua bakteri ini dikultur selam a 96 jam pada su h u r u an g d al am i n k u b at o r b er g o yan g . Populasi V. harveyi menggunakan media SWC 100% yang t elah dit am bah rifam pisin sebagai m edia selektif.

  Un t u k m en j ag a k et er sed i aan ok si g en , wadah pem eliharaan larva dilengkapi dengan aerasi. Pat ogenisit as isolat BT951 t erhadap larva udang windu diam at i m elalui kem at ian l ar va u d an g set el ah 2 4 j am p er en d am an (Rengpipat et al., 1998) dan dibandingkan dengan kontrol.

  Uji Tantang Isolat BT951 dengan V. harveyi

   Uji Tantang Secara In vitro Uj i t an t an g secar a In vitro d i l ak u k an dengan menggunakan media SWC kaldu 100%

  (air laut 750 mL, akuades 250 mL, bakto pepton 5 g, ekst rak kham ir 1 g, gliserol 3 m L) dalam labu erlem eyer. Kepadat an bakt eri V. harveyi dibuat m enjadi 10

  7 CFU/ m L (Rengpipat et al.,

  1998) dan kepadat an bakt eri BT951 dibuat m enjadi 10

  2

  , 10

  4

  , dan 10 Gambar 1. Koloni isolat BT951 setelah 72 jam inkubasi pada media TSA

  Figure 1. Colony of BT951 isolate after 72 hours incubation on TSA media Sif at Fisiologi dan Biok im iaw i Isolat BT951

  kandidat probiotik (isolat U, isolat 9, dan isolat P1 7 B

  dan 10

  8

  cf u/ m L selam a 24 jam perendaman semua bakteri kandidat biokontrol yang d iuj i p at ogenisit asnya t id ak b er sif at pat ogen pada larva udang windu. Dem ikian p ul a yang d i hasi l k an ol eh Har yant i et al. (2000), isolat BY- 9 sebagai biokont rol t idak b er sif at p at ogen p ad a lar va ud ang wind u set elah inkubasi 12 jam pada konsent rasi 10

  5 CFU/ m L. Beber apa isolat bak t er i k andidat

  probiot ik yang disolasi dari sedim en karang (Muliani et al., 2003) dan daun m angrove (Muliani et al., 2004) juga dilaporkan t idak pat ogen pada larva udang windu. Widanarni

  et al. (2010) m elaporkan bahwa ket iga isolat

  o

  , 10

  ) yan g d i u j i p at o g en i si t asn ya p ad a konsentrasi 10

  6 CFU/ mL terhadap larva udang

  windu hingga hari ke- 5 tidak patogen terhadap larva udang windu.

  Hasil Uji Daya Hambat Isolat BT9 5 1 terhadap V. harveyi

  Hasi l u j i d aya h am b at i so l at BT9 5 1 terhadap V. harveyi disajikan pada Gam bar 2. Pada Gam bar 2 t erlihat bahwa isolat BT951 mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi yang dit andai dengan adanya zona bening di sekitar koloni BT951.

  Hasil Uji Tantang Secara In vitro

  Hasil uji t ant ang secara In vitro ant ara BT9 5 1 d en g an V. harveyi d i saj i k an p ad a Gambar 3. Pada gambar tersebut terlihat bahwa p op ulasi V. harveyi p ad a p er lak uan yang m en g g u n ak an i sol at BT9 5 1 l eb i h r en d ah dibanding dengan populasi V. harveyi pada perlak uan yang t idak m enggunak an isolat BT951 (kont rol), baik pada perlakuan yang

  7

  6

  Beberapa sifat fisiologi dan biokimia isolat BT951 disajikan pada Table 1. Pada Tabel 1 t er l i h at b ah w a i so l at BT 9 5 1 t er m asu k kelompok bakteri gram positif yang berbentuk bat ang, Oksidase dan kat alase posit if , indol negat if , dan bersif at m ot il. Bakt eri ini dapat tum buh pada suhu 40

  Dari hasil analisis gen 16S- rRNA dapat d i k et ah u i b ah w a i so l at BT9 5 1 t er m asu k kelom pok Brevibacillus laterosporus dengan indeks kedekat an sebesar 97,7%. Bakt eri ini t er m asu k d al am k i n g d o m b ak t er i , Di vi si Firm icut es, Klass Bacilli, Ordo Bacillus, Fam ily Paenibacillaceae, Genus Brevibacillus, spe- cies Brevibacillus laterosporus. Jenis bakt eri ini banyak digunak an sebagai biok ont r ol unt uk di bidang pert anian. Menurut Oliveira

  o

  C, tum buh pada m edia yang dibubuhi NaCl 0- 10%. Bakteri ini sensitif t erhadap beberapa j enis ant ibiot ik sepert i rif anpisin, erit rom isin, dan cloram penik ol, ak an t et ap i r esi t en t er h ad ap am p i si l i n , oksit et rasiklin, gent am isin, dan f urazolidon. Populasi bakt eri ini pada salinit as 0- 30 ppt set elah 24 jam m ecapai 10

  4 CFU / m L, nam un

  pada salinit as yang lebih t inggi yait u 40- 50 ppt sedikit m enurun yait u 10

  3 CFU/ m L.

  Identif ikasi Isolat BT9 5 1 Secara M olek uler

  et al. (2 0 0 4 ), Brevibacillus laterosporus pot ensial sebagai agen biologi kont rol.

  , 10

  Hasil Uji Patogenisitas terhadap Larva Udang Windu

  Hasi l u j i p at eg en i si t as i so l at BT9 5 1 t erhadap larva udang windu m enunj uk k an bahwa hingga kepadat an 10

  6 CFU/ m L t idak bersifat patogen terhadap larva udang windu.

  Hal ini dapat diket ahui dari sint asan udang windu yang dihasilkan m encapai 96% sedikit lebih tinggi dibanding dengan sintasan udang windu pada bak yang t idak m enggunak an probiotik yaitu 92%. Beberapa hasil penelitian sebelumnya menunjukkan hal yang serupa, di m ana bakt eri yang diisolasi dari air laut dan tambak yang potensial sebagai probiotik tidak bersifat patogen pada larva udang windu. Rosa

  et al. (1997) melaporkan bahwa pada kepadatan

  10

  5

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 457-468

  Tabel 1. Karakteristik fisiologi dan biokimia isolat BT951

  Table 1. Physiological and biochemical characterization of BT951 isolate Iso lat BT 951 BT 951 isola t e

• Ampisilin 50 (mg/ mL) + Eritromidsin 50 (mg/ mL) - Rifampisin 50 (mg/ mL) - Ox itetrasiklin 50 (mg/ mL) + Gentamisin 50 (mg/ mL) +
• -
• - - - - - - - -
• Arginin dehidr (Arginine dehydr ) Lisin dekarb (Lysine decarb ) Produksi amilase (Amilolytic ) Produksi protease (Proteoly tic ) Ketoglutarat (Cetoglutarate )
m en g g u n ak an i s o l at BT 9 5 1 d en g an konsentrasi 10

  Furaz olidon 50 (mg/ mL) + Chloramphenikol 50 (mg/ mL) - 0% + 0.01% +

  0.10% + 1% + 10% + 0 ppt 1.0x 10

  4 10 ppt 2.5x 10

  4 20 ppt 1.0x 10

  4 30 ppt 1.0x 10

  4 40 ppt 1.0x 10

  3 50 ppt 3.1x 10

  3

  Pertumbuhan pada salinitas y ang berbeda setelah 24 jam Growth on different salinities after 24 hours Heptanoat (H eptanoate ) Xantin (X anthine ) Amonobutirat (Aminobutirate ) Arabinosa (Arabinose ) Sellubiosa (Cellubiose ) Glukuronata (Glucuronate ) Produksi gas (Gas from glucose ) Uji O-F (O-F test ) Putrisin (Putriscine ) Sukrosa (Sucrose ) Indol (Indole ) Uji VP (VP-test ) Pertumbuhan pada suhu 40 o

  C (Growth at 40 o

  

C )

Pertumbuhan pada etanol 95% (Growth at 95% ethanol ) Peny ebaran (Swarming ) Pendaran (Luminescence ) Ornitin dekarb (Ornithine decarb ) Serin (Serine ) Pew arnaan gram (Gram staining ) Oksidase (Ox idase ) Katalase (Catalase ) Motilitas (Motility )

  Uji f isio lo g i d an b io kimia Ph ysiolog ica l a n d b ioch em ica l t est s Uji hambat terhadap V. harveyi (Inhibition test of BT951 against V. harveyii) Pertumbuhan pada media SWC y ang dibubuhi antibiotik 50 mg/ mL Growth on SWC media supplemented with 50 mg/mL of antiobiotic Pertumbuhan pada beberapa konsentrasi NaCl Growth on several concentrations of NaCl

  Karakterisasi dan identifikasi molekuler isolat BT951 ..... (Muliani)

  2 CF/ m L, 10

  Isolat BT951 (BT951 isolate)

  10

  4 CFU m L

  10

  4

  2

  4

  6

  8

  1 0

  2 CFU m L

  10

  V . h a rv e y i (l o g C F U / m L )

  P o p u la s i V. harveyi Population of

  Population of V. harveyi (log CFU/mL) challenged with BT951 isolate

  4 CFU/ m L, m aupun

  BT951 pada konsent rasi yang berbeda Figure 3.

  BT9 5 1 Gambar 3. Populasi V. harveyi (log CFU/ mL) yang ditantang dengan isolat

  Test result of BT951 inhibition to V. harveyi by scratch method V. harveyi

  Figure 2.

  bahwa bahwa Bacillus sp. m erupakan salah satu jenis bakteri yang telah diproduksi secara Gambar 2. Hasil uji daya ham bat isolat BT951 dengan V. harveyi dengan m etode goresan

  Brevibacillus. Poernom o (2004) m elaporkan

  Berdasarkan hasil sekuensing gen 16S- rRNA, isolat BT951 termasuk dalam kelompok

  demikian hasil uji statistik menunjukkan bahwa t idak ada per bedaan yang nyat a (P> 0 ,0 5 ) terhadap sintasan larva udang windu baik yang diberi isolat BT951 m aupun t anpa pem berian isolat BT951. Hal ini menunjukkan bahwa isolat BT951 dapat dijadikan sebagai probiotik pada budidaya udang windu.

  2 CFU/ m L. Meskipun

  Sint asan udang windu pada uji t ant ang secara In vivo disajikan pada Tabel 2. Pada Tabel 2 t erlihat bahwa sint asan larva udang wi n d u t er t i n g g i p ad a p en g g u n aan BT9 5 1 dengan konsent rasi 10

  Sintasan Udang pada Uji Tantang Secara In vivo

  isolat Bt951 m am pu m enekan perkem bangan p op ulasi b ak t er i V. harveyi d alam wad ah pem eliharaan udang windu.

  6 CFU/ mL. Hal ini menunjukkan bahwa

  pada 10

  6 CFU m L Kont rol J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 457-468

  Karakterisasi dan identifikasi molekuler isolat BT951 ..... (Muliani)

  4

  3 CFU/ mL dan

  I P

  o p u la s i is o la t B T

  9

  5

  1 Population of BT951 isolate (l o g C F U / m L )

  Awal (Initial) 1 2

  1 0

  8

  6

  2 Wakt u sampling (setiap bulan)

  12 CFU/ m L. Hal ini

  Sampling time (each month)

  Gambar 4. Populasi isolat BT951 pada penyim panan dengan suhu yang berbeda

  Figure 4. Population of BT951 isolate stored at different temperatures

  II III

  IV V

  VI VII

  VIII

  IX X SR BT951

  4

  o

  C BT951

  m en u n j u k k an b ah w a s el am a p r o s es penyim panan populasi probiot ik m engalam i penurunan. Gunarto et al. (2006) melaporkan bahwa populasi bakt eri probiot ik kom ersil (Super NB) yang dikem as dalam larut an st ok sebelum difermentasi sebesar 10

  11

  Tabel 2. Sint asan benur windu (%) dalam uji t ant ang secara In vivo antara bakteri kandidat probiotik dengan V. harveyi

  Kontrol/ Control

  

Table 2. Survival rate of tiger shrimp postlarvae (%) in vivo challenge

between probiotic candidate bacteria with V. harveyi

Nilai yang diik ut i superscript serupa dalam k olom yang sam a t idak berbeda

nyat a (The values followed by the same superscript in the same column were not

significantly different) (P> 0.05)

  Perlakuan T r ea t m en t s Sint asan larva ud ang w ind u ( %) Sur viva l r a t e (%) of t ig er sh r im p la r va e BT951 (10

  2 CFU/ mL)

  95.67 a

  BT951 (10

  4 CFU / mL)

  87.78 a

  BT951 (10

  6 CFU / mL)

  86.67 a

  94.44 a

  labelnya t er t er a bahwa populasi pr obiot ik t ersebut m encapai 10

  komersil dan diaplikasikan di lapangan sebagai probiotik.

  Ketahanan BT9 5 1 pada Penyimpanan dengan Suhu yang Berbeda

  Isolat BT951 yang disim pan pada suhu ruang (± 28

  o

  C) selama 10 bulan penyimpanan m en g al am i p en u r u n an , n am u n d em i k i an secara keseluruhan tidak berbeda jauh dengan yan g d i si m p an p ad a su h u 4

  o

  C. Hal i n i menunjukkan bahwa dalam kondisi tidak ada alat pendingin (kulkas) isolat BT951 sebagai probiot ik m asih bisa disim pan pada kondisi suhu ruangan (± 28

  o

  C). Ini berart i jika bakt eri ini diproduksi sebagai bakteri probiotik, maka b ak t er i i n i d ap at d i k em as d al am b en t u k probiotik cair dan dapat disimpan pada kondisi suhu ruangan, sehingga m udah penanga- nannya dan dapat digunakan di m asyarakat.

  Pada um um nya probiot ik k om ersil cair yang beredar di pasaran hanya m encapai 10

  3 CFU/ mL sebelum difermentasi meskipun pada

• 10
• 10

  set elah dif erm ent asi m enggunakan t epung ik an, dedak halus, ragi, dan m olase m ak a populasinya meningkat menjadi 10

12 CFU/ mL.

  It am i, T. & Takahashi, Y. 1991. Survival of larval giant tiger prawns Penaeus monodon af t er addit ion of k illed vibrio cell t o a m icroencapsulat ed diet . J. Aqua Anim.

  Hadioet om o, R.S. 1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek: Teknik dan prosedur dasar laboratorium. PT Gramedia, Jakarta, hlm. 62- 68. Hala, Y. 1999. Penggunaan gen penanda mo-

  lekular untuk deteksi pelekatan dan kolonisasi vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon) [Disert asi].

  Bogor. Inst it ut Pert anian Bogor, Program Pascasarjana, 91 hlm. Ham eed, A.S.S. 1995. Suscept ibilit y of t hree

  Penaeus species to a Vibrio campbelli- like bacterium. J. World Aqua. Soc., 26: 315- 319.

  Haryanti, Sugama, K., Tsamura, S., & Nishijima, T. 2000. Vibriost at ic bact erium isolat ed from seawat er: Pot ent ialit y as probiot ic agent in t he rearing of Penaeus monodon larvae. Ind. Fish. Res. J., 6: 26- 32.

  Iehata, S., Inagaki, T., Okunishi, S., Nakano, M., Tanaka, R., & Maeda, H. 2010. Improve gut envirom ent of abalone Haliotis gigantea through Pseudiococcus sp. Ah1. treatment.

  Aquaculture, 305: 59- 65

  Health, 3:151- 152.

  Gim an, Winar no, A. Prosiding Seminar

  Kar u n asag ar , I., Pai , R., Mal at h i , G.R., & Karunasagar, I. 1994. Mass m ort alit y of

  Penaeus monodon larvae due to antibiotic- r esi st an t Vibrio harveyi i n f ect i o n . Aguaculture, 128: 203- 209.

  Lavilla- Pitogo, C.R., Albright, L. J., & Paner, M.G.

  1998. Will m icrobial m anipulation sustain the ecological balance in shrim p (Penaeus

  monodon) Hatcheries? In Flegel TW. (Ed).

  Advances in shrim p biot echnology. Na-

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 457-468

  Nasional Kelautan III. Universit as Hang Tuah. 24 April 2006. Surabaya, hlm. 26- 33.

  monodon d i l ab o r at o r i u m d en g an penambahan probiotik hasil perbanyakan. Dalam Taufiqurrohm an, M., Prayogi, U.,

  10

  2006. Pemeliharaan udang windu, Penaeus

  Ch an g es i n b act er i al p op u l at i on s an d shrim p product ion in ponds t reat ed wit h com m ercial m icrobial product s. Aquacul- ture, 206: 245- 256. Gunarto, Tampangallo, B.R., & Susianingsih, E.

  Cent er for Genet ic Engineering and Bio- technology, Bangkok, p. 167- 170. Devaraja, T.N., Yussoff, F. M., & Shariff, M. 2002.

  KESIMPULAN

  Isolat BT951 t erm asuk kelom pok gram p o si t i f , b er b en t u k b at an g , Brevibacillus

  laterosporus, tidak bersifat patogen terhadap

  u d an g w i n d u , d ap at m en g h am b at p er - t um buhan bakt eri V. harveyi, dan pot ensial sebagai bakteri probiotik pada budidaya udang windu.

DAFTAR ACUAN

  J., Thorarinsdot t ir, E.E.., Sm aradot t ir, H., Sigurgisladot t ir, S., & Gudm undsdot t ir, B. K. 2010. Select ion of Bact eria and t he ef- fects of bacterial treatment of Atlantic hali- but (Hippoglossus hippoglossus L.) eggs and larvae. Aquaculture, 302: 219- 227. Chanratchakool, P., Turnbull, J. F., Smith, S. F., &

  Limsuwan, C. 1995. Health management in shrim p ponds. 2

  Avella, M.A., Gioacchini, G., Decam p, O., & M ar k i d i s, P. 2 0 1 0 . A p p l i cat i o n o f m u l t i sp eci es of Baci l l u s i n sea b r eam larviculture. Aquaculture, 305:12- 19. Balasubramanian, G., Sarathi, M., Venkatesan,

  New York. London. Tokyo, 1706 pp. Austin, B. & Day, J.G. 1990. Inhibition of prawn pat hogenic Vibrio spp. By a com m ercial spray- dried preparat ion of Tetraselmis suecica. Aquaculture, 90: 389- 392.

  nd edition. CRC Press. Boca Raton.

  Ahmad, T., Suryati, E. , & Muliani. 1995. Screen- ing sponge for bact ericide t o be use in shrimp culture. Ind. Fish. Res. J., 1: 1- 10. Atlas, R.M. 1997. Hand Book of Microbiologicak m edia. 2

  nd

  Edition. Aquatic Anim al Healt h Research Inst it ut e. Depart m ent of Fisheries. Kaset sart Universit y Cam pus.

  Bangkok, 111 pp. D evar aj a, T. N. , Ot t a, S. K. , Sh u b h a, G. , Karunasagar, I., Tauro, P., & Karunasagar, I.

  1 9 9 8 . Im m u n ost i m u l an t i on of sh r i m p through oral administration of Vibrio bacteri and yeast glucan. In Flegel TW. (Ed.) Ad- vances in shrim p biot echnology. Nat ional

  C., Thomas, J., & Hameed, A.S.S. 2008. Oral adm inist rat ion of ant ifiral plant ex t ract of cynodon dactylon on a large scale produc- tion against White Spote Syndorom e Virus (WSSV) in Penaeus monodon. Aquaculture, 279: 2- 5. Bjornsdottir, R., Karadottir, E.G., Johannsdottir, tional Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok, p. 185- 192. Leonardo, V.A.D., Bonnichon, V., Roch, F.,

  Parrinello, N., & Bonami, J.R. 2005. Compara- t ive WSSV infect ion rout e in t he shrim p g en er a Mar su p en aeu s an d Pal aem o n .

  monodon): I. Isolasi Bakteri Penghambat. J. Penel. Perik. Indonesia, 3: 1- 10.

  Microbiology. 5t h edit ion. Mc Graw Hill. Boston Burr Ridge, IL Dubuque, IA Madison, WI New York , San Fransisco, Bangk ok , Bogota, Caracas, Kualalumpur, Lisbon, Lon- don, Madrid, Mex ico City, Milan, Montreal, Newd el hi , Sant i ag o, Seoul , Si ng ap or e, Sydney, Taipei, Toront o, 1026 pp.

  Poernom o, A. 2004. Technology of probiotics to solve the problems in shrimp pond cul- t ure and t he cult ure environm ent . Paper

  presented in the National Symposium on on Development and Scientific and Tech- nology Innovation in Aquaculture, Semarang, January 27- 29, 2004, 24 pp.

  Ren g p i p at , S. , Ru k p r at an p o r n , S. , Piyatiratitivorakul, S., & Menasveta, P. 1998.

  Probiot ics in Aquacult ure: A case st udy of probiot ics for larvae of black t iger shrim p (Penaeus monodon). In Flegel TW. (Ed). Ad- vances in shrim p biot echnology. Nat ional Cent er for Genet ic Engineering and Bio- technology, Bangkok, p. 177- 181. Rosa, D., Zafran, Taufik, I., & Girsang, M.A. 1997.

  Pen g en d al i an Vibrio harveyi secar a biologis pada larva udang windu (Penaeus

  Sal f i r a. 1 9 9 8 . Pengaruh pemberian LPS

  Oliveira, E.J,D., Rabinovitch, L., Monnerat, R.G., Passo s, L. K. J. , & Zah n er , V. 2 0 0 4 .

  (Lipopolisakarida) dari dinding sel bakteri V i b r i o h a r v eyi terhadap gambaran sistem kekebalan Non-spesifik pada udang windu (Penaeus monodon Fab.) [Tesis].

  Program Pascasarjana Inst it ut Pert anian Bogor. Bogor. Sung, H.H., Kou, G.H., & Song, Y.L. 1994. Vibrio- sis resist ance induced by glucan t reat - m ent in t iger shrim p (Penaeus monodon). Fish Phatol., 1: 11- 17. Suryati, E., Rosmiati, Moka, W., & Hala, Y. 2000.

  Hydrozoan Aglaophenia sp. Bioactive Sub- st ance Analysis for Bact ericide. Ind. Fish.

  Res. J., 6: 55- 61.

  Su p am at t ay a, K. , Ki r i r at n i k o m , S. , Boonyaratpalin, M., & Borowitzka, L. 2005.

  Effect of a Dunaliella ex t ract on growt h perf orm ance, healt h condit ion, im m un

  Appl.Environ. Microbiol., 11: 6657- 6664. Prescott, L.M., Harley, J.P., & Klein, D.A. 2002.

  Oclarit, J.M., Ohta, S., Kamimura, K., Yamaoka, Y., & Ikegam i, S. 1994. Product ion of an ant ibact erial agen, o- Am iniphenol, by a bact erium isolat ed from m arine sponge, Adocia sp. Fish. Sci., 60: 559- 562.

  Aquaculture, 28: 565- 569.

  Pseudomonas b act er ia. Dep ar t m ent of

  Macey, B.M. & Coyne, V.E. 2 0 0 5 . Im pr ove g r owt h r at e an d r esi st an ce i n f ar m ed

  Haliotis midae through Probiotic treat- ment. Aquaculture, 245: 249- 261.

  Maeda, M. 1999. Microbial proses in aquacul- ture. National Research Institute of Aquac- ulture. Nansei, Mie. 516- 0193. Japan, 102 pp. Marchesi, J., Sato, R.T., Weightman, A.J., Martin, T.A., Fry, J.C., Hiom, S.J., & Wade, W.G. 1998.

  Design and evaluation of useful bacterium- spesifik PCR prim ers t hat am plify genes co d i n g f o r b act er i al 1 6 S- r RNA. Ap p l . Environ. Microbiol., 64: 795- 799. Merrifield, D.L., Dimitroglou, A., Foey, A., Davies,

  J., Baker, R.T.M., Bogwld, J., Cast ex , M., & Ringo, E. 2010. The current status and fu- t ure focus of probiot ic and prebiot ic ap- plication for salmonids. Aquaculture, 302: 1- 18.

  Muir, P. 1996. Ident if icat ion of Vibrio and