PENGARUH EKSTRAK ETANOL BUNGA CENGKEH (Eugenia caryophylata Thunb) TERHADAP AKTIVITAS ANTIMALARIA ARTEMISININ PADA Plasmodium falciparum Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria activity on Plasmodium falciparum

  

PENGARUH EKSTRAK ETANOL BUNGA CENGKEH (Eugenia caryophylata

Thunb) TERHADAP AKTIVITAS ANTIMALARIA ARTEMISININ PADA Plasmodium

falciparum

Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria

activity on Plasmodium falciparum

• *** ** * Faizal Hermanto , Maria Immaculata Iwo , Puji BS Asih
• Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA Universitas Jenderal Achmad Yani-Cimahi
• Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung

• Lembaga Biologi Molekular Eijkman

  

ABSTRAK

Malaria masih merupakan salah satu masalah kesehatan utama di Indonesia. Pengobatan malaria saat ini

menggunakan kombinasi artemisinin dengan antimalaria lain (Artemisinin Based Combination Therapy).

  

Masalah utama penggunaan artemisinin adalah radikal bebas yang dihasilkan, yang tidak hanya toksik pada

P. falciparum tetapi juga toksik terhadap inang. Untuk mengatasi dampak radikal bebas diperlukan suatu

antioksidan, seperti yang dapat diperoleh dari bunga cengkeh (Eugenia caryophylata Thunb). Penelitian

ini bertujuan menguji efek ekstrak etanol bunga cengkeh (EEBC) sebagai antioksidan dalam terapi dengan

artemisinin. Komponen aktif dalam bunga cengkeh diekstraksi dengan cara refluk menggunakan etanol 96%

(v/v). Dalam penelitian ini P. falciparum galur 3D7 dikultur dalam Medium RPMI 1640 yang mengandung sel

darah merah, dapar HEPES, serum AB dan NaHCO sesuai teknik Trager dan Jensen. Hasil menunjukan pada

₃

pemeriksaan status oksidan, kadar MDA pada kultur P. falciparum yang diinkubasi dengan kombinasi EEBC dan

artemisinin menurun (1,778±0,07 nM/ml) secara bermakna (p<0,05) dibandingkan terhadap kontrol tanpa

EEBC (2,026±0,47 nM/ml). Hasil sebaliknya, kadar GSH pada kultur yang sama meningkat (1,1318±0,07 µg/

ml) secara bermakna (p<0,05) dibandingkan terhadap kontrol tanpa EEBC (0,2496±0,01 µg/ml). Berdasarkan

hasil penelitian ini, ekstrak etanol bunga cengkeh dapat meredam radikal bebas yang terbentuk akibat kerja

artemisinin tetapi tidak mempengaruhi aktivitas antimalaria falciparum artemisinin.

  Kata kunci : Eugenia caryophylata Thunb, Plasmodium falciparum, artemisinin, GSH, MDA

ABSTRACT

  

Malaria is still one of the major health problems in Indonesia. The current malaria treatment is using artemisinin

combination with other antimalarials drug (Artemisinin-Based Combination Therapy). The main problem of the

Volume 6, No. 2, Desember 2013

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 PENGARUH EKSTRAK ETANOL BUNGA CENGKEH ( Eugenia caryophylata Thunb) TERHADAP AKTIVITAS ANTIMALARIA ARTEMISININ PADA Plasmodium falciparum

  Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria activity on Plasmodium falciparum use of artemisininbecause it is generating free radicals, which are not only toxic to P. falciparum but also toxic

to the host. To minimize the effects of free radicals is by takes an antioxidant, that can be derived from clove

(Eugenia caryophylata Thunb). This study aims to examine the effects of the ethanol extract of clove (EEBC) as antioxidants in artemisinin treatment. Active component in clove was extracted by reflux using ethanol 96% (v/v). In this study, P. falciparum strain 3D7 was cultured in RPMI 1640 medium containing red blood cells, HEPES buffer, serum AB and NaHCO3 withTrager and Jensen techniques. The results of the examination on oxidant status

showed that levels of MDA in the culture of P. falciparum were incubated with combination ofartemisinin and

EEBC were significantly decreased (1.778 ± 0.07 nM / ml) ( p < 0.05 ) compared to controls without EEBC (2.026 ± 0.47 nM / mL). In the other side, GSH levels were significantly increased in the same culture (1.1318 ± 0.07 mg/ ml) (p < 0.05) compared to controls without EEBC (0.2496 ± 0.01 mg/mL). It was concluded that ethanol extract of clove can reduce free radicals whis are formed as a result of the artemisinin work but did not affect the activity of artemisinin as antimalarial.

  Keywords: Eugenia caryophylata Thunb, Plasmodium falciparum, artemisinin, GSH, MDA PENDAHULUAN

  Malaria masih merupakan masalah kesehatan utama di dunia baik di negara-negara berkembang maupun negara maju. Di Indonesia pada tahun 2010 terdapat 544.470 kasus malaria, sedangkan pada tahun 2009 terdapat 1.100.000 kasus malaria klinis, dan pada tahun 2010 meningkat menjadi 1.800.000 kasus malaria klinis (WHO, 2010).

  Upaya pemberantasan panyakit malaria mengalami hambatan karena berkembangnya resistensi Plasmodium falciparum terhadap obat-obat antimalaria yang ada saat ini seperti klorokuin, amodiakuin, sulfadoxin-pirimetamin, dan kinin. Pada tahun 1972 peneliti Cina berhasil mengisolasi artemisinin atau qinghaosu yang berasal dari tanaman Artemisian annua L. yang merupakan tanaman tradisional cina yang digunakan sebagai penurun demam dan secara klinis terbukti sangat berkhasiat terhadap P.

  falciparum termasuk P. falciparum yang resisten

  terhadap obat antimalaria konvensional (Li et al., 1994).

  Artemisinin merupakan seskuiterpen trioksan lakton yang mengandung jembatan peroksida yang sangat penting untuk aktivitas antimalarial. Salah satu target kerja artemisinin adalah vakuola pencernaan parasit, dimana hemoglobin yang merupakan sumber nutrisi parasit akan dicerna dan mengasilkan heme. Heme dan besi (Fe

  2+

  ) akan mengkatalisis pembukaan jembatan peroksida pada artemisinin yang mengarah pada pembentukan radikal bebas. Radikal bebas bersifat sangat toksik terhadap sel karena reaktivitasnya yang tinggi baik terhadap sel inang maupun sel parasit. Radikal dapat bergabung dengan molekul lainnya seperti enzim, reseptor, pompa ion, dan mengoksidasi secara langsung komponen tersebut sehingga fungsi dan aktivitas normal enzim dan konstituen tersebut terganggu. Efek destruktif lainnya adalah inisiasi peroksidasi lipid yang dapat menyebabkan kerusakan membran selular (Machlin and Bendich, 1987; Punchard and Kelly, 1996) dan menghasilakan produk seperti malondialdehid Volume 6, No. 2, Desember 2013 Faizal Hermanto, Maria Immaculata Iwo, Puji BS Asih

  (MDA). Malondialdehid merupakan produk hasil peroksidasi lipid yang merupakan indikator terjadinya stres oksidatif dan dapat diukur kadarnya secara eksperimental.

  Alat

  Pengujian pengaruh ekstrak etanol terhadap artemisinin

  Pembuatan ekstrak Bunga cengkeh dikeringkan kemudiaan digiling dan diekstraksi dengan alat refluks menggunakan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol yang diperoleh dipekatkan sampai diperoleh ekstrak kental.

  Cara Kerja

  ultraviolet, incubator, autoklav, oven, vortex, sentrifuga, spektofotometer sinar tampak (Shimadzu), water bath.

  jar, mikroskop binokuler, lampu spirtus, lampu

  Alat reflux, tabung Eppendorf, pipet pastur, pipet mikro, injeksi spuit, kaca objek, filter milipor 0,22 µl, tabung sentrifuga 15 ml, cawan petri Ø 6 cm, culture flask, botol medium, Erlenmeyer, lempeng sumur mikro 6x4, candle

  Bahan yang digunakan untuk pengujian kadar malondialdehid (MDA) dan glutation (GSH) ialah asam 2-tiobarbiturat (TBA) 0,67%, Larutan TCA (trichloro acetic acid) 20% dan 5%, MDA standar (1,1,3,3 tetraethoxypropane), reagen DTNB (ditiobis nitro benzoic acid) 39,6 mg dalam 10 mL dapar fosfat 0,1 M pH 7, larutan standar glutation (GSH) 2 mg/ml dalam dapar fosfat pH 8.

  Oleh karena radikal bebas yang dihasilkan oleh artemisinin tidak hanya merusak parasit tetapi juga merusak sel inang, maka dibutuhkan suplemen antioksidan. Salah satu sumber antioksidan alam adalah bunga cengkeh yang pada beberapa penelitian menunjukan aktivitas antioksidannya lebih baik dari rempah-rempah lainnya seperti rosemary, sage, oregano, pala, jahe dan hampir sama kuat dengan antioksidan sintetis butil hidroksianisol dan butil hidroksi toluene (Lee and Shibamoto, 2001; Gulcin et al., 2004; Nasar et al., 2007; Phoupuritham et al., 2007).

  klorida, sorbitol, natrium bikarbonat, dapar HEPES, medium RPMI 1640 (Gibco), gentamisin sulfat (Sigma culture grade), serum manusia, eritrosit manusia, larutan dapar fosfat (pH 7,4), artemisinin (Sigma), minyak imersi, pewarna Giemsa, metanol, lilin.

  falciparum ialah air suling, aquabidest, natrium

  Bahan yang digunakan untuk kultur P.

  Kultur P. falciparum galur 3D7 diperoleh dari Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta. Sebagai pelarut untuk ekstraksi bunga cengkeh digunakan etanol sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk identifikasi kandungan senyawa aktif ekstrak cengkeh ialah natrium hidroksida, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, serbuk magnesium dan seng, asam klorida, pereaksi Molisch, pereaksi Lieberermann-Burcard, kalium hidroksida.

  METODE PENELITIAN Bahan

  Pengaruh dari ekstrak etanol bunga cengkeh terhadap artemisinin ditentukan dengan penentuan status oksidan dan antioksidan dalam kultur ditentukan melalui penetapan kadar MDA dan GSH.

  Sebelum dilakukan pengujian, parasit disinkronisasi terlebih dahulu dengan PENGARUH EKSTRAK ETANOL BUNGA CENGKEH ( Eugenia caryophylata Thunb) TERHADAP AKTIVITAS ANTIMALARIA ARTEMISININ PADA Plasmodium falciparum Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria activity on Plasmodium falciparum

  menggunakan sorbitol sehingga diperoleh Bandung. Rendemen ekstrak kental bunga parasit dengan stadium cincin. Uji dilakukan dua cengkeh yang diperoleh adalah sebesar 30%. kali replikasi memakai lempeng sumur mikro Ekstrak etanol bunga cengkeh dikarakterisasi 24 lubang. Setelah diinkubasi selama 48 jam, dan dilakukan penapisan fitokimia dengan hasil supernatan kultur ditentukan status oksidannya seperti pada Tabel 1. dengan penetapan kadar malondialdehid (MDA)

  Tabel 1. Karakteristik dan Penapisan Fitokimia

  dan glutation (GSH) dalam kultur P. falciparum

  Ekstrak

  tunggal dan kultur P. falciparum yang diinkubasi

  Ekstrak Etanol

  dengan kombinasi EEBC dan artemisinin secara

  Parameter Bunga Cengkeh spektrofotometri.

  Kadar air (% v/b)

  18 Kadar abu total (% b/b) 2,6 Penentuan kadar malondialdehid (MDA)

  Kadar abu larut air (% b/b) 1,8

  Sebanyak 1 ml supernatan kultur dicampur dengan 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA Kadar abu larut asam (% b/b) 0,7 0,67%. Campuran tersebut dipanaskan dalam

  Kadar sari larut etanol (% b/b) 12,0

  penangas air selama 10 menit, setelah dingin

  Kadar sari larut air (% b/b) 10,4

  supernatan disentrifugasi pada kecepatan 3.000

  Kandungan Kimia :

  rpm lalu ditentukan serapannya pada panjang Flavonoid

• Saponin gelombang 532 nm.
• Alkaloid +

  Penentuan kadar glutation (GSH) Kuinon

• Sebanyak 0,25 ml supernatan ditambah

  Tanin

• dengan 8,9 ml dapar fosfat pH 8,0 kemudian

  Steroid/Triterpenoid

• dicampur dengan 1 ml TCA 5%. Larutan dikocok

  Keterangan :

  sampai homogen lalu disentrifugasi pada

• = menunjukkan adanya golongan senyawa uji
• = menunjukkan tidak adanya golongan senyawa uji

  kecepatan 3.000 rpm selama 5 menit. Campuran larutan tersebut diambil sebanyak 4 ml dan Efek EEBC sebagai antioksidan dipelajari ditambah dengan 0,05 ml DTNB dan inkubasi pengaruhnya dalam kultur yang mengandung selama 1 jam. Setalah inkubasi, campuran larutan artemisinin dengan parameter penentuan kadar ditentukan serapannya pada panjang gelombang MDA dan GSH yang tersaji dalam Tabel 2. MDA 412 nm. adalah suatu senyawa yang sangat reaktif yang merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid,

HASIL DAN PEMBAHASAN

  dan biasa digunakan sebagai penanda biologis Bunga cengkeh kering yang digunakan peroksidasi lipid untuk menilai ada atau berasal dari Kebun Tanaman Obat Manoko, tidaknya stress oksidatif. Prinsip penentuan Lembang. Hasil determinasi identitas botani yang kadar MDA adalah reaksi antara thiobarbituric dilakukan di Herbarium Bandungense, Sekolah acid (TBA) dengan MDA yang akan menghasilkan Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi

  Volume 6, No. 2, Desember 2013

• 2

  dapat menurunkan stres oksidatif pada kultur P.

  1,1318 ± 0,07 ^ab 3,74x10

• ^-2 1,837 ± 0,06 ^ab

  2,026 ± 0,47 0,2496 ± 0,01 Artemisinin 3,97 nM 2,332 ± 0,19 0,1581 ± 0,012 ^a EEBC + Artemisinin 3,74x10

• ^-1 1,778 ± 0,07 ^ab

  MDA (nmol/ml) Kadar rata-rata GSH (µg/ml) kontrol Kontrol (-)

  

Tabel 2 Kadar MDA dan GSH dalam kultur P. falciparum yang diinkubasi dengan kombinasi ekstrak etanol

bunga cengkeh dan artemisinin Zat uji Dosis (mg/ml) Kadar rata-rata

  dengan parameter penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar GSH. Ekstrak etanol bunga cengkeh pada konsentrasi tersebut tidak mempengaruhi aktivitas antimalaria artemisinin.

  falciparum yang diinkubasi dengan artemisinin

  Ekstrak etanol bunga cengkeh pada konsentrasi 0,374 mg/ml dan 3,74x10

  Peredaman radikal bebas yang terjadi pada kultur yang diinkubasi dengan kombinasi ekstrak etanol bunga cengkeh dan artemisinin diduga disebabkan oleh eugenol. Eugenol merupakan senyawa yang bertanggungjawab sebagai antioksidan dalam minyak cengkeh. Menurut Rajalaksmi and Narasimhan (1995), antioksidan dari cengkeh bekerja sebagai penangkap radikal bebas dengan mendonasikan hidrogen atau elektron ke radikal bebas dan mengkonversinya menjadi produk yang lebih stabil (non radikal).

  mg/ml terlihat selain menurukan kadar MDA juga mengalami peningkatan kadar GSH yang bermakna (p<0,05). Hal ini dapat disimpulkan bahwa EEBC berkhasiat meredam radikal bebas pada kultur yang diinkubasi dengan artemisinin dengan parameter penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar GSH.

  Hasil uji penetapan kadar GSH seperti terlihat pada Tabel 2, konsentrasi EEBC 0,374 dan 3,74x10

• 2
• 2

  mg/ml mengalami penurunan kadar MDA yang bermakna secara berturut-turut adalah 1,778±0,07; 1,837±0,06.

  Hasil uji penetapan kadar MDA seperti terlihat pada Tabel 2, kultur yang diinkubasi dengan artemisinin mengalami peningkatan kadar MDA dan penurunan kadar GSH bila dibandingkan dengan kontrol. Ini sesuai dengan salah satu mekanisme kerja artemisinin yaitu pembentukan radikal bebas akibat pembukaan jembatan endoperoksid sehingga terjadi stress oksidatif yang akan mengakibatkan peningkatan status oksidan dengan parameter peningkatan kadar MDA dan terjadi penurunan kadar GSH. Sedangkan pada kultur yang diberi EEBC konsentrasi 0,374 dan 3,74x10

  senyawa berwarna yang akan mengabsorpsi pada panjang gelombang 532 nm. Glutation (GSH) merupakan antioksidan non enzimatik yang berguna dalam detoksifikasi radikal bebas. Di dalam sel dan jaringan yang normal, lebih dari 90% glutation dalam bentuk tereduksi sedangkan kurang dari 10% glutation dalam bentuk teroksidasi (GSSH). Tingginya kadar GSH dijaga oleh enzim glutation reduktase (GR) yang berfungsi untuk mempertahankan keseimbangan redok intraselular. Rendahnya kadar GSH mengindikasikan terjadinya stress oksidatif.

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 Faizal Hermanto, Maria Immaculata Iwo, Puji BS Asih

  0,8411 ± 0,11 ^ab

DAFTAR PUSTAKA

  Chemical constituents of clove (Syzygium

  World Health Organisation (WHO). 2010. The World Malaria Report; World Health Organisation: Geneva, Switzerland

  technological, toxicological and health perspectives. New York, Marcel Dekker Inc.

  Press, New York. p 1-5 Rajalaksmi D. and Narasimhan S. 1996. Food antioxidants: sources and methods of evaluation. in Madhavi DL, Deshpande SS, Salunkhe DK (ed). Food antioxidants

  a Practical Approach. Oxford University

  Punchard NA. and Kelly FJ. 1996. Free Radicals:

   IAPRI World Conference on Packaging.

  Phoupuritham P., Thongngam M., Yoksan R., Suppakul P. 2007. Antioxidant and radical scavenging activities of selected plant extracts and possible application in active packaging. Proceeding of The 15 ^th

  americana de Quimica, 35(3):47-57

  antioxidant activity. Revista Latino

  aromaticum, Fam. Myrtaceae) and their

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 PENGARUH EKSTRAK ETANOL BUNGA CENGKEH ( Eugenia caryophylata Thunb) TERHADAP AKTIVITAS ANTIMALARIA ARTEMISININ PADA Plasmodium falciparum

  Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria activity on Plasmodium falciparum 3,47x10 ^-3 1,936 ± 0,07 ^ab 0,8364 ± 0,08 ^ab 3,47x10

• ^-4 2,911 ± 0,02 0,7581 ± 0,14 ^ab 3,47x10 ^-5 2,916 ± 0,05 0,6248 ± 0,08 ^ab 3,47x10 ^-6 2,919 ± 0,04 0,5380 ± 0,02
^ab 3,47x10
• ^-7 2,917 ± 0,26 0,5264 ± 0,03 ^ab

  Machlin LJ. and Bendich A. 1987. Free Radical Tissue Damage: Protective Role of Antioxidant nutrients. The FASEB Journal, 1(6): 441-445

  Soc Trop Med Hyg., 88: Suppl 1, S5-6

  Clinical Trials of Artemisinin and Its Derivates in The Treatment of Malaria in China. Trans R

  Li GQ., Guo XB., Fu LC., Jian HX., and Wang XH. 1994.

  Lee KG., dan Shibamoto T. 2001. Antioxidant property of aroma extract isolated from clove buds (Syzygium aromaticum (L.) Merr et Perry.). Food Chemistry, 74(4): 443-448

  (Lavandula stoechas L.). Food Chemistry, 87:393-400

  caryophylata Thunb) buds and lavender

  Gulcin I., Sat IG., Beydemir S., Elmastas M., dan Kufrevioglu OI. 2004. Comparison of antioxidant activity of clove (Eugenia

  Dari penelitian yang dilakukan disimpulkan ekstrak etanol bunga cengkeh mampu meredam radikal bebas yang dihasilkan atas aktivitas artemisinin sebagai obat anti- malaria.

  KESIMPULAN

  EEBC = Ekstrak etanol bunga cengkeh a = (p<0,05)dibandingkan terhadap kontrol b = (p<0,05)dibandingkan terhadap artemisinin

  Nasar MI., Gaara AH., El-Gharab AH., Farray ARH., Shen H., Hug E., and Mabry TJ. 2007.