Penetapan Kadar Pirasetam Tablet dengan Nama Generik dan Nama Dagang secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pirasetam
2.1.1 Uraian Bahan
Menurut Ditjen. BKAK (2014), sifat fisikokimia pirasetam adalah :
Gambar 2.1 Struktur Pirasetam
Nama Kimia
: 2-Oxopirolidin 1-Asetamida
Rumus Molekul
: C6H10N2O2
Berat Molekul
: 142,2
Pemerian
: Serbuk; putih atau hampir putih
Kelarutan
: Mudah larut dalam air; larut dalam etanol
2.1.2
Farmakologi
Pirasetam merupakan obat nootropik yang digunakan untuk meningkatkan
proses belajar dan mengingat. Pirasetam biasa disebut sebagai turunan siklik dari
Gamma Amino Butiric Acid (GABA) yang berikatan dengan GABA reseptor.
Obat ini bekerja pada aktivitas kognitif tanpa menimbulkan perangsangan ekstra
atau menghambat neurotransmitter (Barkat, dkk., 2014).
5
Universitas Sumatera Utara
Pirasetam merupakan salah satu dari kelompok rasetam yang biasa
digunakan untuk mengobati penyakit demensia dan alzheimer. Pirasetam
mempunyai absorbsi yang baik dengan pemberian peroral, dengan bioavailabilitas
hampir 100%. Pirasetam diekskresikan dalam bentuk tidak berubah dan
tereliminasi seutuhnya setelah 30 jam (Gouliaev dan Senning, 1994).
2.2
Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa
diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk
cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom.
Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fasa gerak,
maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan
kromatografi lapis tipis, fasa gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan
paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kualitatif, kuantitatif, atau
preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fasa diam
(stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Klasifikasi Kromatografi
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada
pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi
dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c)
kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi
6
Universitas Sumatera Utara
eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang
digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b)
kromatografi lapis tipis; (c) KCKT dan (d) kromatografi gas (KG) (Rohman,
2009).
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memisahkan komponen campuran
senyawa kimia terlarut dengan sistem adsorpsi pada fasa diam padat atau sistem
partisi di antara fasa diam cair yang terikat pada penyangga padat, dan fasa gerak
cair. KCKT dapat memisahkan makromolekul, ion, bahan alam yang tidak stabil,
polimer dan berbagai gugus polifungsi dengan berat molekul tinggi. Berbeda
dengan kromatografi gas, pemisahan pada KCKT adalah hasil interaksi spesifik
antara molekul senyawa dengan fasa diam dan fasa gerak (Satiadarma, dkk.,
2004).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan sistem pemisahan dengan
kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif
dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif
maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran
(Ditjen. POM., 1995).
Teknik analisis obat secara KCKT merupakan yang paling cepat
berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan
biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984).
7
Universitas Sumatera Utara
2.4 Cara Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi merupakan teknik yang mana zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan zat terlarut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan zat-zat terlarut ini diatur oleh distribusi dalam fasa gerak
dan fasa diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara
tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fasa gerak,
panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fasa gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fasa
gerak yang membawa campuran analit melalui fasa diam dan perbedaan interaksi
analit dengan permukaan fasa diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan
setiap komponen dalam campuran (Meyer, 2010).
2.5 Kriteria Optimasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Menurut Berridge (1985), optimasi dalam sistem KCKT disyaratkan untuk
menemukan kondisi yang optimal guna menghasilkan pemisahan yang baik pada
kondisi percobaan tersebut dilakukan. Adapun tujuan dipersyaratkan optimasi
pada sistem KCKT antara lain: (a) menghemat biaya penelitian; (b) mendapatkan
hasil pemisahan yang baik dengan waktu yang singkat; (c) menciptakan
pemisahan terbaik yang mungkin dihasilkan oleh sampel; (d) memilih fasa gerak
dan kolom yang menunjukkan pemisahan yang baik pada waktu yang singkat.
Keberhasilan pemisahan suatu analit sangat dipengaruhi oleh pemilihan
sistem kromatografi dan komposisi fasa gerak yang tepat. Meskipun dari segi
8
Universitas Sumatera Utara
instrumen sering diabaikan. Proses pemisahan dikatakan baik bergantung pada
kondisi kolom, detektor dan pompa instrumen KCKT.
2.6 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Dari kedua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak, salah satu di antaranya
selalu harus lebih polar daripada yang lainnya. Misalnya, heksana yang dipakai
pada kolom silika kepolarannya jauh lebih rendah daripada permukaan silika. Jika
fasa yang lebih polar itu fasa diam, ini disebut kromatografi normal. Jika fasa
yang kepolarannya lebih rendah ialah fasa diam, ini dikenal sebagai kromatografi
fasa balik (Gritter, dkk., 1985).
Kromatografi fasa balik menggunakan fasa diam dari silika yang
dimodifikasi secara kimiawi. Fasa diam yang paling popular digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) yang relatif non polar sedangkan fasa geraknya
relatif lebih polar daripada fasa diam. Kondisi kepolaran kedua fasa ini
merupakan
kebalikan
dari
kromatografi
fasa
normal
sehingga
disebut
kromatografi fasa balik (Meyer, 2010).
2.7 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumentasi KCKT terdiri atas wadah fasa gerak, pompa, injektor,
kolom, detektor, dan pengolah data. Diagram skematik alat KCKT ditunjukkan
pada Gambar 2.2
9
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.2 Diagram Skematik Alat KCKT (Rohman, 2009).
2.7.1
Wadah Fasa Gerak
Wadah fasa gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fasa gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada
fasa gerak, sebab dengan adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat
membuat pelarut untuk fasa gerak, maka akan sangat dianjurkan untuk
menggunakan pelarut dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi
jika pelarut-pelarut yang akan digunakan berderajat KCKT (HPLC grade).
Adanya pengotor dalam pelarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem
kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau
dalam tabung sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada
kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.2
Pompa
Ada dua jenis pompa yang digunakan: tekanan-tetap dan pendesakan-
tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa
semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan
10
Universitas Sumatera Utara
peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor
yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah
tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut,
tetapi tandonnya terbatas (Jhonson dan Stevenson, 1978).
2.7.3
Injektor
Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), ada tiga tipe dasar injektor yang
dapat digunakan, yaitu:
a. aliran henti: Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfir;
sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap
berada dalam tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat
cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi;
b. septum: Ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor
yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai
pada tekanan sampai sekitar 60 - 70 atmosfir akan tetapi septum tidak dapat
dipakai untuk semua pelarut kromatografi cair. Selain itu, partikel kecil
terlepas dari septum dan cenderung menyumbat;
c. katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan
volum lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang
diotomatkan (volume yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual
memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi
pada tekanan atmosfir. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan di dalam
jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom. Tipe injektor katup jalan-kitar secara
skematik ditunjukkan pada Gambar 2.3
11
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.3 Tipe Injektor Katup jalan-kitar (De Lux Putra, 2007).
2.7.4
Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut
Johnson dan Stevenson (1978), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
a.
kolom analitik: garis tengah dalam 2–6 mm. Untuk kemasan mikropartikel
berpori, biasanya 10 – 30 cm.
b.
kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat. Kolom biasanya dipakai
pada suhu kamar, tetapi suhu yang lebih tinggi dapat juga dipakai, terutama dalam
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan bergantung pada
ragam KCKT yang dilakukan.
2.7.5
Fasa Diam
Fasa diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai
medium yang menjerap, atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis zat
padat. Banyak sistem fasa diam baru telah dikembangkan untuk KCKT, dan
pemakaian bahan tersebut sangat meningkatkan keefisienan dan kemampuan
metode itu. Sebagian besar bahan itu didasarkan pada silika (Gritter, dkk., 1985).
12
Universitas Sumatera Utara
Kebanyakan fasa diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fasa diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Sekarang ini, gel silika ODS atau fasa-fasa sejenis seperti gel silika oktil
digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fasa-fasa lain hanya digunakan
jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat
mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting
karena matriks sampel
tersebut
menghasilkan
banyak
puncak
yang
mengganggu (Watson, 2005).
2.7.6
Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrofotometri massa,
golongan detektor yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor utraviolet-visible, detektor fluoresensi, elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor mempunyai karakteristik sebagai berikut: (a) mempunyai
respon terhadap zat terlarut yang cepat dan reprodusibel; (b) mempunyai
sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat
kecil dan (c) stabil dalam pengoperasiannya (Gandjar dan Rohman, 2007).
13
Universitas Sumatera Utara
2.7.7
Pengolah Data
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, dan rekorder
dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang
dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang
selanjutnya dievaluasi oleh seorang analis (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.8
Fasa Gerak
Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa
diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada KCKT, susunan pelarut atau fasa gerak merupakan salah satu hal
penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai
dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fasa gerak yang digunakan
dalam KCKT. Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kriteria fasa gerak yang
ideal adalah sebagai berikut: (a) murni; (b) tidak bereaksi dengan kemasan;
(c) sesuai dengan detektor; (d) dapat melarutkan cuplikan; (e) mempunyai
viskositas rendah; (f) memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan
mudah, jika diperlukan; (g) harganya relatif.
2.7.9
Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut Gritter, dkk., (1985), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua
sistem yaitu:
a.
Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fasa gerak
dengan perbandingan tetap (komposisi fasa gerak tetap selama elusi).
14
Universitas Sumatera Utara
b.
Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fasa gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fasa gerak
berubah-ubah selama elusi). Elusi gradien digunakan pada situasi yang
membutuhkan pemprograman temperatur dalam kromatografi gas, dan ini
dibutuhkan ketika range dari waktu retensi dari pelarut dalam kolom besar
sehingga tidak dapat terlarut dan elusi dalam waktu tertentu menggunakan satu
jenis atau campuran pelarut (Lindsay, 1987).
2.8
Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi
metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode
analisis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya
cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang
ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi,
spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan
(Robustness) (Harmita, 2004).
Akurasi/kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (% recovery). Presisi/keseksamaan adalah
ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa
15
Universitas Sumatera Utara
kali pengukuran pada sampel yang sama. Presisi dinyatakan dengan Simpangan
Baku Relatif (Relative Standar Deviation, RSD) (Harmita, 2004).
Batas deteksi (Limit of Detection, LOD) adalah jumlah terkecil analit
dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan
dibandingkan dengan blanko. Batas kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ)
merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama. LOD dan LOQ dapat dihitung secara statistik
melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Harmita, 2004).
16
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pirasetam
2.1.1 Uraian Bahan
Menurut Ditjen. BKAK (2014), sifat fisikokimia pirasetam adalah :
Gambar 2.1 Struktur Pirasetam
Nama Kimia
: 2-Oxopirolidin 1-Asetamida
Rumus Molekul
: C6H10N2O2
Berat Molekul
: 142,2
Pemerian
: Serbuk; putih atau hampir putih
Kelarutan
: Mudah larut dalam air; larut dalam etanol
2.1.2
Farmakologi
Pirasetam merupakan obat nootropik yang digunakan untuk meningkatkan
proses belajar dan mengingat. Pirasetam biasa disebut sebagai turunan siklik dari
Gamma Amino Butiric Acid (GABA) yang berikatan dengan GABA reseptor.
Obat ini bekerja pada aktivitas kognitif tanpa menimbulkan perangsangan ekstra
atau menghambat neurotransmitter (Barkat, dkk., 2014).
5
Universitas Sumatera Utara
Pirasetam merupakan salah satu dari kelompok rasetam yang biasa
digunakan untuk mengobati penyakit demensia dan alzheimer. Pirasetam
mempunyai absorbsi yang baik dengan pemberian peroral, dengan bioavailabilitas
hampir 100%. Pirasetam diekskresikan dalam bentuk tidak berubah dan
tereliminasi seutuhnya setelah 30 jam (Gouliaev dan Senning, 1994).
2.2
Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa
diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk
cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom.
Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fasa gerak,
maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan
kromatografi lapis tipis, fasa gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan
paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kualitatif, kuantitatif, atau
preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fasa diam
(stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Klasifikasi Kromatografi
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada
pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi
dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c)
kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi
6
Universitas Sumatera Utara
eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang
digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b)
kromatografi lapis tipis; (c) KCKT dan (d) kromatografi gas (KG) (Rohman,
2009).
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memisahkan komponen campuran
senyawa kimia terlarut dengan sistem adsorpsi pada fasa diam padat atau sistem
partisi di antara fasa diam cair yang terikat pada penyangga padat, dan fasa gerak
cair. KCKT dapat memisahkan makromolekul, ion, bahan alam yang tidak stabil,
polimer dan berbagai gugus polifungsi dengan berat molekul tinggi. Berbeda
dengan kromatografi gas, pemisahan pada KCKT adalah hasil interaksi spesifik
antara molekul senyawa dengan fasa diam dan fasa gerak (Satiadarma, dkk.,
2004).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan sistem pemisahan dengan
kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif
dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif
maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran
(Ditjen. POM., 1995).
Teknik analisis obat secara KCKT merupakan yang paling cepat
berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan
biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984).
7
Universitas Sumatera Utara
2.4 Cara Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi merupakan teknik yang mana zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan zat terlarut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan zat-zat terlarut ini diatur oleh distribusi dalam fasa gerak
dan fasa diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara
tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fasa gerak,
panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fasa gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fasa
gerak yang membawa campuran analit melalui fasa diam dan perbedaan interaksi
analit dengan permukaan fasa diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan
setiap komponen dalam campuran (Meyer, 2010).
2.5 Kriteria Optimasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Menurut Berridge (1985), optimasi dalam sistem KCKT disyaratkan untuk
menemukan kondisi yang optimal guna menghasilkan pemisahan yang baik pada
kondisi percobaan tersebut dilakukan. Adapun tujuan dipersyaratkan optimasi
pada sistem KCKT antara lain: (a) menghemat biaya penelitian; (b) mendapatkan
hasil pemisahan yang baik dengan waktu yang singkat; (c) menciptakan
pemisahan terbaik yang mungkin dihasilkan oleh sampel; (d) memilih fasa gerak
dan kolom yang menunjukkan pemisahan yang baik pada waktu yang singkat.
Keberhasilan pemisahan suatu analit sangat dipengaruhi oleh pemilihan
sistem kromatografi dan komposisi fasa gerak yang tepat. Meskipun dari segi
8
Universitas Sumatera Utara
instrumen sering diabaikan. Proses pemisahan dikatakan baik bergantung pada
kondisi kolom, detektor dan pompa instrumen KCKT.
2.6 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Dari kedua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak, salah satu di antaranya
selalu harus lebih polar daripada yang lainnya. Misalnya, heksana yang dipakai
pada kolom silika kepolarannya jauh lebih rendah daripada permukaan silika. Jika
fasa yang lebih polar itu fasa diam, ini disebut kromatografi normal. Jika fasa
yang kepolarannya lebih rendah ialah fasa diam, ini dikenal sebagai kromatografi
fasa balik (Gritter, dkk., 1985).
Kromatografi fasa balik menggunakan fasa diam dari silika yang
dimodifikasi secara kimiawi. Fasa diam yang paling popular digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) yang relatif non polar sedangkan fasa geraknya
relatif lebih polar daripada fasa diam. Kondisi kepolaran kedua fasa ini
merupakan
kebalikan
dari
kromatografi
fasa
normal
sehingga
disebut
kromatografi fasa balik (Meyer, 2010).
2.7 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumentasi KCKT terdiri atas wadah fasa gerak, pompa, injektor,
kolom, detektor, dan pengolah data. Diagram skematik alat KCKT ditunjukkan
pada Gambar 2.2
9
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.2 Diagram Skematik Alat KCKT (Rohman, 2009).
2.7.1
Wadah Fasa Gerak
Wadah fasa gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fasa gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada
fasa gerak, sebab dengan adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat
membuat pelarut untuk fasa gerak, maka akan sangat dianjurkan untuk
menggunakan pelarut dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi
jika pelarut-pelarut yang akan digunakan berderajat KCKT (HPLC grade).
Adanya pengotor dalam pelarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem
kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau
dalam tabung sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada
kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.2
Pompa
Ada dua jenis pompa yang digunakan: tekanan-tetap dan pendesakan-
tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa
semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan
10
Universitas Sumatera Utara
peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor
yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah
tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut,
tetapi tandonnya terbatas (Jhonson dan Stevenson, 1978).
2.7.3
Injektor
Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), ada tiga tipe dasar injektor yang
dapat digunakan, yaitu:
a. aliran henti: Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfir;
sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap
berada dalam tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat
cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi;
b. septum: Ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor
yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai
pada tekanan sampai sekitar 60 - 70 atmosfir akan tetapi septum tidak dapat
dipakai untuk semua pelarut kromatografi cair. Selain itu, partikel kecil
terlepas dari septum dan cenderung menyumbat;
c. katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan
volum lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang
diotomatkan (volume yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual
memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi
pada tekanan atmosfir. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan di dalam
jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom. Tipe injektor katup jalan-kitar secara
skematik ditunjukkan pada Gambar 2.3
11
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.3 Tipe Injektor Katup jalan-kitar (De Lux Putra, 2007).
2.7.4
Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut
Johnson dan Stevenson (1978), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
a.
kolom analitik: garis tengah dalam 2–6 mm. Untuk kemasan mikropartikel
berpori, biasanya 10 – 30 cm.
b.
kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat. Kolom biasanya dipakai
pada suhu kamar, tetapi suhu yang lebih tinggi dapat juga dipakai, terutama dalam
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan bergantung pada
ragam KCKT yang dilakukan.
2.7.5
Fasa Diam
Fasa diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai
medium yang menjerap, atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis zat
padat. Banyak sistem fasa diam baru telah dikembangkan untuk KCKT, dan
pemakaian bahan tersebut sangat meningkatkan keefisienan dan kemampuan
metode itu. Sebagian besar bahan itu didasarkan pada silika (Gritter, dkk., 1985).
12
Universitas Sumatera Utara
Kebanyakan fasa diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fasa diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Sekarang ini, gel silika ODS atau fasa-fasa sejenis seperti gel silika oktil
digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fasa-fasa lain hanya digunakan
jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat
mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting
karena matriks sampel
tersebut
menghasilkan
banyak
puncak
yang
mengganggu (Watson, 2005).
2.7.6
Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrofotometri massa,
golongan detektor yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor utraviolet-visible, detektor fluoresensi, elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor mempunyai karakteristik sebagai berikut: (a) mempunyai
respon terhadap zat terlarut yang cepat dan reprodusibel; (b) mempunyai
sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat
kecil dan (c) stabil dalam pengoperasiannya (Gandjar dan Rohman, 2007).
13
Universitas Sumatera Utara
2.7.7
Pengolah Data
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, dan rekorder
dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang
dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang
selanjutnya dievaluasi oleh seorang analis (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.8
Fasa Gerak
Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa
diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada KCKT, susunan pelarut atau fasa gerak merupakan salah satu hal
penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai
dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fasa gerak yang digunakan
dalam KCKT. Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kriteria fasa gerak yang
ideal adalah sebagai berikut: (a) murni; (b) tidak bereaksi dengan kemasan;
(c) sesuai dengan detektor; (d) dapat melarutkan cuplikan; (e) mempunyai
viskositas rendah; (f) memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan
mudah, jika diperlukan; (g) harganya relatif.
2.7.9
Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut Gritter, dkk., (1985), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua
sistem yaitu:
a.
Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fasa gerak
dengan perbandingan tetap (komposisi fasa gerak tetap selama elusi).
14
Universitas Sumatera Utara
b.
Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fasa gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fasa gerak
berubah-ubah selama elusi). Elusi gradien digunakan pada situasi yang
membutuhkan pemprograman temperatur dalam kromatografi gas, dan ini
dibutuhkan ketika range dari waktu retensi dari pelarut dalam kolom besar
sehingga tidak dapat terlarut dan elusi dalam waktu tertentu menggunakan satu
jenis atau campuran pelarut (Lindsay, 1987).
2.8
Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi
metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode
analisis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya
cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang
ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi,
spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan
(Robustness) (Harmita, 2004).
Akurasi/kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (% recovery). Presisi/keseksamaan adalah
ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa
15
Universitas Sumatera Utara
kali pengukuran pada sampel yang sama. Presisi dinyatakan dengan Simpangan
Baku Relatif (Relative Standar Deviation, RSD) (Harmita, 2004).
Batas deteksi (Limit of Detection, LOD) adalah jumlah terkecil analit
dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan
dibandingkan dengan blanko. Batas kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ)
merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama. LOD dan LOQ dapat dihitung secara statistik
melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Harmita, 2004).
16
Universitas Sumatera Utara