Penetapan Kadar Levofloksasin Dalam Sediaan Tablet Dengan Nama Dagang Dan Generik Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Levofloksasin
2.1.1 Sifat fisikokimia
Menurut Moffat, dkk., (2005) sifat fisikokimia levofloksasin adalah sebagai
berikut:
Rumus struktur
:
Gambar 1 Struktur levofloksasin
Nama Kimia
: (-)-(S)-9-fluoro-2,3-dihidro-3-metil-10-(4-metil-1-piperazinil)-7-okso7- 7H-pirido [1,2,3-de]-1,4-benzoksasin-6-karboksilat
Rumus Molekul
: C18H20FN3O4
Berat Molekul
: 361,4
Pemerian
: Serbuk kristal berwarna putih kekuningan, tidak berbau dan
rasa pahit
Kelarutan
: Mudah larut dalam asam asetat glasial dan kloroform, sedikit
larut dalam air, metanol, etanol atau aseton, sangat sukar larut
dalam etil asetat
4
Universitas Sumatera Utara
2.1.2 Farmakologi
Levofloksasin
adalah
antibakteri
golongan
flourokuinolon
yang
merupakan S-(-) isomer dari ofloksasin dan memiliki aktivitas antibakteri dua kali
lebih besar dari pada ofloksasin. Levofloksasin memiliki efek antibakteri dengan
spektrum luas, aktif terhadap bakteri gram-positif dan gram-negatif termasuk
bakteri anareob. Levofloksasin telah menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap
chalmydia pneumoniae dan mycoplasma pneumoniae. Levofloksasin secara in
vitro lebih aktif melawan bakteri gram-positif, termasuk streptococcus
pneumoniae dan bakteri anaerob dibandingkan fluorokuinolon yang lain.
Mekanisme kerja dari levofloksasin adalah dengan menghambat DNA-gyrase,
sehingga meningkatkan kerusakan rantai DNA. DNA-gyrase (topoisomerase II)
merupakan enzim yang sangat diperlukan oleh bakteri untuk memelihara struktur
superheliks DNA, juga diperlukan untuk replikasi, transkrip dan perbaikan DNA
(Setiabudy, 2007).
2.1.3 Efek samping
Secara umum, efek samping paling sering akibat golongan obat ini ialah
mual, muntah, rasa tidak enak di perut, pusing dan sakit kepala (Setiabudy, 2007).
2.2 Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada
tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna
dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas
yang berisi kalsium karbonat. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan
5
Universitas Sumatera Utara
dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, analisis
kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, industri dan lain sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Penggunaan kromatografi
Menurut Gritter, dkk., (1985) penggunaan kromatografi adalah sebagai berikut:
- Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya
senyawa tertentu dalam cuplikan.
- Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing
komponen campuran.
- Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran
dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.2.2 Puncak asimetris
Puncak asimetris yakni membentuk pucak yang berekor (tailing) dan
adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut yang
lebih besar (Johnson dan Stevenson, 1978).
Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan
konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi
perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi
pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih
akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).
6
Universitas Sumatera Utara
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang
sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisis berbagai cuplikan
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Ditjen POM, 1995).
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson,
1991).
2.3.1 Kelebihan KCKT
Menurut Muson (1991), kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
− Resolusinya baik
− Mudah melaksanakannya
− Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
− Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya
tidak
begitu
tergantung
pada
keahlian
operator
dan
reprodusibilitasnya lebih baik
7
Universitas Sumatera Utara
− Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
− Waktu analisis umumnya singkat
2.3.2 Cara kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam
fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis
kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.3.3 Komponen KCKT
detektor
kolom
injektor
oven
pompa
Wadah
Data processor
Gambar 2 Instrument Dasar KCKT
2.3.3.1 Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
wadah yang ada labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
8
Universitas Sumatera Utara
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)
yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.3.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.3.3 Injektor
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), ada 3 jenis dasar injektor yaitu:
a. Hentikan aliran/stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
9
Universitas Sumatera Utara
b. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak, umumnya sama dengan
yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarutpelarut kromatografi cair. Di samping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran (loop valve)
Injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak
ke dalam kolom( Johnson dan Stevenson, 1978).
Gambar 3 Tipe Injektor Putaran (De Lux Putra, 2007)
2.3.3.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok:
10
Universitas Sumatera Utara
a. Kolom analitik: diameter khas adalah 2 – 6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat,
umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan
pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi (De Lux
Putra, 2007).
2.3.3.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan
dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1978).
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer
karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor
ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan (Johnson
dan Stevenson, 1978).
11
Universitas Sumatera Utara
2.3.3.6 Pengolahan data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan
Stevenson, 1978).
2.3.4 Guna kromatogram
Menurut Johnson dan Stevenson (1978), guna kromatogram adalah sebagai
berikut:
1. Kualitatif: waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang
sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif: luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan
dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
2.3.5 Fase gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat
yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak
(De Lux Putra, 2007).
Menurut De Lux Putra (2007), fase gerak harus:
− Murni, tidak ada pencemar/kontaminan
− Tidak bereaksi dengan pengemas
− Sesuai dengan detector
− Melarutkan cuplikan
− Mempunyai viskositas rendah
12
Universitas Sumatera Utara
Gelembung udara yang ada harus dihilangkan (degassing) dari pelarut,
karena udara yang keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise
sehingga data tidak dapat digunakan ( De Lux Putra, 2007).
2.3.6 Elusi gradien dan isokratik
Menurut De Lux Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua
sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).
2. Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi).
2.3.7 Jenis pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT
dibedakan atas:
a.
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya
silika gel, aluminium, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b.
Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang
banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8).
Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Mulja
dan Suharman, 1995).
13
Universitas Sumatera Utara
2.4 Kriteria Optimasi
Optimasi dalam KCKT disyaratkan untuk menentukan kondisi yang
optimal guna menghasilkan pemisahan yang baik pada kondisi percobaan tersebut
dilakukan. Meskipun demikian, kondisi terbaik sistem KCKT sulit untuk
ditemukan. Ada pun tujuan dipersyaratkan optimasi pada sistem KCKT antara
lain:
− Menghemat biaya penelitian
− Mendapatkan hasil pemisahan yang baik dengan waktu yang singkat
− Menciptakan pemisahan terbaik yang mungkin dihasilkan
− Menyeleksi/memilih komposisi fase gerak dan kolom yang menunjukkan
pemisahan yang baik pada waktu yang singkat
− Memperoleh kombinasi optimum pada kecepatan elusi/laju alir, ukuran
sampel, dan resolusi dari larutan sampel
− Melokasikan kriteria optimasi untuk tempat/daerah percobaan tersebut
dilakukan.
Keberhasilan suatu pemisahan analit sangat dipengaruhi oleh pemilihan
sistem kromatografi dan komposisi fase gerak yang tepat. Meskipun dari segi
instrumennya sering diabaikan. Proses pemisahan dikatakan baik bergantung pada
kondisi kolom, detektor, dan pompa instrumen KCKT. Ditinjau lebih luas lagi,
pemilihan komposisi
fase gerak merupakan aspek utama dalam optimasi.
Pemilihan fase gerak ini tidak hanya mempertimbangkan proses ekstraksi/isolasi
sampel oleh pelarut karena adanya parameter seperti laju alir dan suhu kolom
yang menjadi pertimbangan penting dalam pemilihan komposisi fase gerak yang
digunakan (Berriddge, 1985).
14
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Levofloksasin
2.1.1 Sifat fisikokimia
Menurut Moffat, dkk., (2005) sifat fisikokimia levofloksasin adalah sebagai
berikut:
Rumus struktur
:
Gambar 1 Struktur levofloksasin
Nama Kimia
: (-)-(S)-9-fluoro-2,3-dihidro-3-metil-10-(4-metil-1-piperazinil)-7-okso7- 7H-pirido [1,2,3-de]-1,4-benzoksasin-6-karboksilat
Rumus Molekul
: C18H20FN3O4
Berat Molekul
: 361,4
Pemerian
: Serbuk kristal berwarna putih kekuningan, tidak berbau dan
rasa pahit
Kelarutan
: Mudah larut dalam asam asetat glasial dan kloroform, sedikit
larut dalam air, metanol, etanol atau aseton, sangat sukar larut
dalam etil asetat
4
Universitas Sumatera Utara
2.1.2 Farmakologi
Levofloksasin
adalah
antibakteri
golongan
flourokuinolon
yang
merupakan S-(-) isomer dari ofloksasin dan memiliki aktivitas antibakteri dua kali
lebih besar dari pada ofloksasin. Levofloksasin memiliki efek antibakteri dengan
spektrum luas, aktif terhadap bakteri gram-positif dan gram-negatif termasuk
bakteri anareob. Levofloksasin telah menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap
chalmydia pneumoniae dan mycoplasma pneumoniae. Levofloksasin secara in
vitro lebih aktif melawan bakteri gram-positif, termasuk streptococcus
pneumoniae dan bakteri anaerob dibandingkan fluorokuinolon yang lain.
Mekanisme kerja dari levofloksasin adalah dengan menghambat DNA-gyrase,
sehingga meningkatkan kerusakan rantai DNA. DNA-gyrase (topoisomerase II)
merupakan enzim yang sangat diperlukan oleh bakteri untuk memelihara struktur
superheliks DNA, juga diperlukan untuk replikasi, transkrip dan perbaikan DNA
(Setiabudy, 2007).
2.1.3 Efek samping
Secara umum, efek samping paling sering akibat golongan obat ini ialah
mual, muntah, rasa tidak enak di perut, pusing dan sakit kepala (Setiabudy, 2007).
2.2 Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada
tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna
dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas
yang berisi kalsium karbonat. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan
5
Universitas Sumatera Utara
dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, analisis
kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, industri dan lain sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Penggunaan kromatografi
Menurut Gritter, dkk., (1985) penggunaan kromatografi adalah sebagai berikut:
- Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya
senyawa tertentu dalam cuplikan.
- Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing
komponen campuran.
- Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran
dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.2.2 Puncak asimetris
Puncak asimetris yakni membentuk pucak yang berekor (tailing) dan
adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut yang
lebih besar (Johnson dan Stevenson, 1978).
Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan
konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi
perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi
pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih
akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).
6
Universitas Sumatera Utara
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang
sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisis berbagai cuplikan
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Ditjen POM, 1995).
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson,
1991).
2.3.1 Kelebihan KCKT
Menurut Muson (1991), kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
− Resolusinya baik
− Mudah melaksanakannya
− Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
− Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya
tidak
begitu
tergantung
pada
keahlian
operator
dan
reprodusibilitasnya lebih baik
7
Universitas Sumatera Utara
− Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
− Waktu analisis umumnya singkat
2.3.2 Cara kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam
fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis
kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.3.3 Komponen KCKT
detektor
kolom
injektor
oven
pompa
Wadah
Data processor
Gambar 2 Instrument Dasar KCKT
2.3.3.1 Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
wadah yang ada labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
8
Universitas Sumatera Utara
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)
yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.3.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.3.3 Injektor
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), ada 3 jenis dasar injektor yaitu:
a. Hentikan aliran/stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
9
Universitas Sumatera Utara
b. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak, umumnya sama dengan
yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarutpelarut kromatografi cair. Di samping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran (loop valve)
Injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak
ke dalam kolom( Johnson dan Stevenson, 1978).
Gambar 3 Tipe Injektor Putaran (De Lux Putra, 2007)
2.3.3.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok:
10
Universitas Sumatera Utara
a. Kolom analitik: diameter khas adalah 2 – 6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat,
umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan
pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi (De Lux
Putra, 2007).
2.3.3.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan
dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1978).
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer
karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor
ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan (Johnson
dan Stevenson, 1978).
11
Universitas Sumatera Utara
2.3.3.6 Pengolahan data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan
Stevenson, 1978).
2.3.4 Guna kromatogram
Menurut Johnson dan Stevenson (1978), guna kromatogram adalah sebagai
berikut:
1. Kualitatif: waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang
sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif: luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan
dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
2.3.5 Fase gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat
yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak
(De Lux Putra, 2007).
Menurut De Lux Putra (2007), fase gerak harus:
− Murni, tidak ada pencemar/kontaminan
− Tidak bereaksi dengan pengemas
− Sesuai dengan detector
− Melarutkan cuplikan
− Mempunyai viskositas rendah
12
Universitas Sumatera Utara
Gelembung udara yang ada harus dihilangkan (degassing) dari pelarut,
karena udara yang keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise
sehingga data tidak dapat digunakan ( De Lux Putra, 2007).
2.3.6 Elusi gradien dan isokratik
Menurut De Lux Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua
sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).
2. Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi).
2.3.7 Jenis pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT
dibedakan atas:
a.
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya
silika gel, aluminium, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b.
Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang
banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8).
Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Mulja
dan Suharman, 1995).
13
Universitas Sumatera Utara
2.4 Kriteria Optimasi
Optimasi dalam KCKT disyaratkan untuk menentukan kondisi yang
optimal guna menghasilkan pemisahan yang baik pada kondisi percobaan tersebut
dilakukan. Meskipun demikian, kondisi terbaik sistem KCKT sulit untuk
ditemukan. Ada pun tujuan dipersyaratkan optimasi pada sistem KCKT antara
lain:
− Menghemat biaya penelitian
− Mendapatkan hasil pemisahan yang baik dengan waktu yang singkat
− Menciptakan pemisahan terbaik yang mungkin dihasilkan
− Menyeleksi/memilih komposisi fase gerak dan kolom yang menunjukkan
pemisahan yang baik pada waktu yang singkat
− Memperoleh kombinasi optimum pada kecepatan elusi/laju alir, ukuran
sampel, dan resolusi dari larutan sampel
− Melokasikan kriteria optimasi untuk tempat/daerah percobaan tersebut
dilakukan.
Keberhasilan suatu pemisahan analit sangat dipengaruhi oleh pemilihan
sistem kromatografi dan komposisi fase gerak yang tepat. Meskipun dari segi
instrumennya sering diabaikan. Proses pemisahan dikatakan baik bergantung pada
kondisi kolom, detektor, dan pompa instrumen KCKT. Ditinjau lebih luas lagi,
pemilihan komposisi
fase gerak merupakan aspek utama dalam optimasi.
Pemilihan fase gerak ini tidak hanya mempertimbangkan proses ekstraksi/isolasi
sampel oleh pelarut karena adanya parameter seperti laju alir dan suhu kolom
yang menjadi pertimbangan penting dalam pemilihan komposisi fase gerak yang
digunakan (Berriddge, 1985).
14
Universitas Sumatera Utara