Amplifikasi in vitro Gen Pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp.Strain BAC4.

ABSTRAK

Amplifikasi in vitro Gen Pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4

Kethy Nadia Sepwinda, 2001. Pernbimbing : Sylvia Soeng, dr.; Philips O., S.Si.,M.Si

Penggunaan antibiotika penisilin secara luas untuk mengobati penyakit infeksi bakteri, mengakibatkan timbulnya gejala resistensi. Gejala resistensi ini diakibatkan

oleh adanya inaktivasi penisilin oleh enzim Penisilinase Salah satu

usaha untuk mengatasi gejala tersebut adalah mencari antibiotika jenis baru turunan penisilin yang lebih efektif, yang dapat diperoleh dengan membuat penisilin semisintetik dengan perantaraan senyawa 6-Aminopenisilanat (6-MA). Pada

peneilitan ini telah dilakukan upaya mengamplifikasi gen pengkode Penisilin V

Asilase pada Bacillus sp.strain BAC4 dengan menggunakan teknik PCR. DNA

kromosom Bacillus sp. Strain BAC4 diisolasi, dilanjutkan dengan amplifikasi DNA

kromosom tersebut menggunakan teknik PCR. Primer-primer yang digunakan dalam

proses amplifikasi adalah primer Bact F1 (Forward): 5'- CCC ATA TGT GCA CAA

GTC TTA CAT TGG AAA - 3 ' , dan primer Uni B1 (Reverse) : 3' - AAG GCC TTA

ATT AAG CTC ATG AAT ACT CTC - 5' Siklus PCR yang dilakukan adalah :

denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing selama 1-1,5 menit,

dan extension 72°C selama 1 - 1,5 menit sebanyak 30-35 siklus. Tahap selanjutnya adalah elektroforesis untuk melihat hasil PCR dengan menggunakan gel agarosa

1,5%. Hasil senantiasa berupa smear. Dengan demikian, dapat disumpulkan bahwa

penelitian ini belum menghasilkan pita yang spesifik fragmen gen DNA dari Bacillus

sp. strain BAC4. disarankan untuk dilakukan proses amplifikasi dengan primer-primer baru yang lebih spesifik dean denang kondisi PCR yanglebih tepat.

ABSTRACT

In vitro AmpIification of Coding Gene Penicillin V Acylase from Bacillus sp.

Strain BAC4

Kethy Nadia Sepwinda, 2001. Tutors : Sylvia Soeng, dr. ; Philips O., S.Si., M.Si.

The extended use of penicillin to cure bacterial infection has resumed on

resistance. This is due to the inactivation of peniciliin by the enzyme Penicillinase

- lactamase). One of the attempts to overcome the resistance is to find new

penicillin derived antibiotics which are more effective, which can be obtained

through the production of semisynthetic penicillin using - aminopenicillanic

acid (6 - APA) as the precursor. Effort to amplify PVA gene of Bacillus sp. Strain

BAC4 using PCR technique has been performed. The steps were Bacillus sp.

Strain BAC4 chromosomal DNA isolation, followed by amplification using PCR

technique. Primers used in this process were Bact F1 (forward) : 5 ' - CCC ATA

GCA CAA GTC TTA CAT TGG AAA] - 3 ', and Uni B1 (reserve): 3 ‘ - AAG GCC

TTA A TT AA G CTC A TG A A T A CT CTC - 5 '. The PCR cycle was : denaturation

at I minute, annealing at 40 - 1 1,5 minutes, and extension at

1-1,5 minutes, for 30 - 35 cycles. The next step was electrophoresis using agarose

gel 1,5% to evaluate the PCR result. The results were always smears. It was concluded that the attempt to amplify the gene part using PCR technique has not been successful (no specific band). It was suggested to perform PCR using more specific primers and better PCR condition.

DAFTAR ISI

Halaman Judul.. . . i

Halaman Pengesahan ... 11

Halaman Pernyataan. ... . . . 111

Abstrak.. . . . .1v

Abstract ... V Kata Pengantar ... ... .vl Daftar Isi ... . . . IX Daftar Gambar ... ... .XI Daftar Lampiran . . . x11

... Bab I. Pendahuluan . . . 1.1. Latar Belakang . . . 1

1.2. Identifikasi Masalah ... 1.3. Tujuan Penelitian . . . 3

1.4. Kegunaan Penelitian . . . 1.5. Metodologi Penelitian . . . 1.6. Lokasi dan Waktu ... 3

. . .

...

. . . . . . .4

Bab 11. Tinjauan Pustaka _{. . .} 2.1 .Penisilin ... . . . 5

2.2.Bacillus sp.Strain BAC4 . . . 2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 2.4. Elektroforesis . . . 9

Bab 111. Metode Penelitian 3.1

.IsolasiDNAKromosomBacillussp.

Strain BAC4 ... 1 1 3.2. Amplifikasi Gen Pengkode Penisilin V Asilase Bacillussp. StrainBAC4 . . . .12

3.3 .Elektroforesis Produk PCR . . . 1 3 Bab IV. Hasil dan Pembahasan 4.1. Isolasi DNA Kromosom Bacillus sp. Strain BAC4 ... .14

4.2. Amplifikasi Gen Pengkode Penisilin V Asilase Bacillus sp. Strain BAC4 . . . .14

Bab V. Kesimpulan dan Saran 5.1. Kesimpulan . . . 17

5.2. Saran _{. . .} 17

Daftar Pustaka _{. . .} 18

Lampiran 2 . . . . .

Riwayat Hidup

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Struktur Kimia Penisilin ... 06

Gambar 4.1. Hasil PCR ... 16

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Lampiran Alat . . .

Lampiran 2 Lampiran Bahan . . .

... 20 ... 22

Penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri merupakan salah satu masalah

kesehatan di Indonesia Pengobatan penyakit infeksi ini dapat dilakukan dengan

pemberian obat-obat antibiotika, misalnya penisilin. Penisilin adalah antibiotik

pertama yang ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1929. Sifat toksisitas

penisilin yang rendah dan aktivitas antibakteri yang sangat efektif (Abraham et

al,1941; Florey & Florey,1943) menyebabkan penggunaannya meluas di seluruh

dunia

Penggunaan penisilin yang meluas menimbulkan dampak yang merugikan, yaitu

adanya

gejala resistensi. Gejala ini pertama kali ditemukan oleh Abraham dan Chain

(1940), yaitu adanya inaktivasi Penisilin oleh enzim Penisilinase yang

dihasilkan bakteri.

Enzim

menghidrolisis struktur pada inti

penisilin dan menghasilkan asam penisiloat yang tidak memiliki kemampuan

anti bakteri.

Salah satu usaha untuk mengatasi masalah resistensi ini adalah mencari antibiotik

baru turunan penisilin yang lebih efektif Penisilin G Asilase merupakan enzim yang

dapat menghidrolisis penisilin G menjadi senyawa 6-Aminopenisilanat (6-MA).

Senyawa 6-APA merupakan senyawa intermediet untuk menghasilkan senyawa

penisilin semisintetik yang baru (Valle et al,1986; Meevootisom & Saunders,1987;

Martin et al., 1995). Usaha memintesis Penisilin

ini

dimaksudkan untuk

mendapatkan jenis penisilin yang memiliki potensi yang lebih tinggi, stabil dalam

suasana asam maupun basa, dan memiliki efek samping yang rendah (Crueger &

Crueger, 1984).

Dasar pembentukan 6-APA oleh mikroorganisme adalah melalui hidrolisis

enzimatis yang melibatkan perubahan substrat penisilin, misalnya penisilin G. Cara

enzimatis ini dapat memberikan hasil konversi yang lebih cepat serta spesifisitas

katalisis yang tinggi. Selain itu, penerapan teknologi enzim juga memungkinkan

pengontrolan reaksi sesuai dengan yang diinginkan (Carrington, 1971).

Bacillus sp. Strain BAC4 merupakan bakteri strain lokal yang diketahui

menghasilkan Penisilin G Asilase yang paling tinggi di antara 10 isolat dari 160 isolat

yang berhasil diisolasi

dari

berbagai daerah di Indonesia Bakteri ini termasuk Gram

positif, berbentuk batang dengan pH dan suhu optimum untuk pertumbuhan dan

produksi Penisilin G Asilase adalah 7 & C (Syamsuriputra,l995). Bacillus sp.

strain BAC4 mampu memproduksi Penisilin G Asilase (PGA) secara ekstraseluler

sehingga jenis mikroba ini dipertimbangkan untuk dimanfaatkan sebagai sumber

yang dapat direkayasa. Untuk keperluan rekayasa tersebut dilakukan penelitian

mengenai karakterisasi gen pga (Ratnaningsih et al., 1999) dengan mengamplifikasi

gen tersebut menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

Dari hasil uji aktivitas Penisilin Asilase diperoleh bahwa Bacillus sp. strain BAC4

selain memiliki aktivitas Penisilin G Asilase, juga menunjukkan aktivitas Penisilin

V

Apakah gen pengkode Penisilin

V

Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapat

diamplifikasi dengan primer-primer yang disintesis berdasarkan

urutan

nukleotida

gen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis ?

13. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen pengkode Penisilin

V

Asilase

dari Bacillus sp. Strain BAC4 dengan menggunakan teknik PCR.

1.4. kegunaan penelitian

Usaha amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapat digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan penelitian lanjutan penentuan Urutan nukleotida gen ini dan untuk memproduksi enzim Penisilin Asilase

yang sudah direkayasa secara genetik, sehingga dapat digunakan untuk membuat

antibiotika semisintetik turunan penisilin yang baru, yang dapat digunakan untuk

mengatasi masalah resistensi yang sedang berkembang saat ini.

1.5. Metodologi Penelitian Eksperimental eksploratif

1.6. Lokasi dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengembangan

Ilmu

Kedokteran

Dasar Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha,

dari bulan Maret - Mei 2001.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari DNA kromosom bacillus sp. Strain BAC4 secara in vitro, dengan teknik PCR menggunakan primer yang disintesis berdasarkan urutan nukleotida gen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis,

belurn rnemberikan hasil

5.2. Saran

Untuk memperoleh hasil yang lebih baik perlu dilakukan reamplifikasi dengan menggunakan primer-primer baru yang berbeda dari ptinier-primer yang digunakan dalam penilitian ini. Primer baru yang lebih spesifik tersebut dapat diperoleh melalui perancangan primer-primer berdasarkan data GenBank yang sudah ada

Selain dengan mencari primer-primer baru yang lebih spesifik, reamplifikasi juga sebaiknya dilakukan dengan mencari kondisi PCR yang lebih tepat.

DAFTAR PUSTAKA

Abraham, E.P., et al. 1941. Lancet. 2 :1977.

Abraham, E.P., etal. 1955. Nature

(London).

176 : 551. Brandl, E. 1972. sci Pharm. 40: 1.

Bondareva, N.S., Levitov,

MM.,

and Robinovich,

M.S.

1969. Biokhimiya.

34:478.

Brown, T.A. 1995. Gene Cloning: an introduction. Chapman &

Hall.

CarringtOn, T.R. 19'71. The Development of Commercial Processes for the

Production of 6-MA. Proc.

R.

Soc.

Load.

Crueger, W., dan Crueger, A. 1984. Biotechnology:

a

textbook of industrial

microbiology. Science Tech, Inc.

Innis,

M.A., and Gelfand, H.1994. Optimization of PCR :

PCR

Protocols. A Guide

to Menthod and Applications, Academic Press, Inc., California, 3-12.

Khiong. 1999.

Hibridisasi

Genom Bacillus sp. Strain BAC4 menggunakan

“Probe” Gen Pengkode PeniSilin G Asilase. Tesis Magister. Bidang Khusus

Genetika dan Biologi Molekuler Program Studi Biologi. Program Pascasarjana. Institut Teknologi Bandung.

Mahajan, P.B. 1984. Review Penicillin Acylase. Appl. Biochem & Biotech.

Humania Press Inc.

Martin, L., Prieto, M.A., Cortes, E., dan Garcia, J.L. 1995. Cloning

and

sequencing of the PAC gene and

coding

the penicillin G acylase of Bucillus

megaterium ATCC 14945. Fems Microbiology Letters, 125: 287-292.

Meevotisom, V., dan Saunders,

J.R.

1987. Cloning and expression of penicillin

acylase gene from overproducting strains of Escherichia coli and Bacillus

megaterim. Applied and Microbiology Biotechnology, 25: 372-378.

Mosher, H.Roy, Leo,C., Vining. 1992. Antibiotic Resistance. Encyclopedia of Microbiology. I:97-106.

strain of Bacillus sp: culture enzyme, purification, and

PCR

experiments employing primers derived

from

B. megaterium pga gene. Annual report I.

Graduate team Research Grant. URGE Project Directorate General of Higher Education Ministry of Education and culture. Indonesia.

Riniati.

1999. Usaha amplifikasi dan kloning fragmen gen penisilin G asilase

Bacillus sp.

BAC4

strain lokal. Tesis Magister. Bidang Kimia Organik.

Program Magister Kimia. Institut Teknologi Bandung.

sambrook, J., Fritsch, E.F.,

dan

Manniatis, T. 1989. Molecular cloning, A

laboratorium manual. edition Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold

Spring Harbor.

Soeng et al 2000. Determinasi Spesies Bacillus sp. Strain BAC Penghasil

Penisilin

Asilase

Secara Molekuler Menggunakan

PCR.

Laporan Penelitian.

Bagian Biologi. Fakultas

Kedokteran.

Universitas Kristen Maranatha.

Syamsuriputra, A.A. 1993. Iden tifikasi, Penentuan Kondisi-kondisi Optimum

dan

Pemuliaan Isolat Bakteri Lokal BAC4 Penghasil Penisilin Asilase,

laporan

Mikrobiologi PAU ITB,

Laporan Akhir

Kegiatan Penelitian. 1992. Vol.2 Bandung.

Utami et al. 2001. Spesifisitas substrat Bacillus sp. BAC, strain lokal penghasil

Penisilin Asilase. laporan Penelitian. Bagian Biologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Kristen Maranatha.

Valle, F., Gosset, G., Tenorio, B., Oliver, G.,

dan

Bolivar, F. 1986. Gene (20):

119-122.

Valle, F., Balbas, P., Merino, E., dan Bolivar, F. 1991. The role of penicillin

amidase in nature and

in

industry. TIBS, 16: 36-40.

Vandamme, E.J.,

dan

Voets, J.P. 1974. Microbial penicillin acylase. Advance

Apply Microbiology 1.

Martin et al., 1995). Usaha memintesis Penisilin

ini

dimaksudkan untuk mendapatkan jenis penisilin yang memiliki potensi yang lebih tinggi, stabil dalam suasana asam maupun basa, dan memiliki efek samping yang rendah (Crueger & Crueger, 1984).

Dasar pembentukan 6-APA oleh mikroorganisme adalah melalui hidrolisis enzimatis yang melibatkan perubahan substrat penisilin, misalnya penisilin G. Cara enzimatis ini dapat memberikan hasil konversi yang lebih cepat serta spesifisitas katalisis yang tinggi. Selain itu, penerapan teknologi enzim juga memungkinkan pengontrolan reaksi sesuai dengan yang

diinginkan

(Carrington, 1971).

Bacillus sp. Strain BAC4 merupakan bakteri strain lokal yang diketahui menghasilkan Penisilin G Asilase yang paling tinggi di antara 10 isolat dari 160 isolat yang berhasil diisolasi

dari

berbagai daerah di Indonesia Bakteri ini termasuk Gram positif, berbentuk batang dengan pH dan suhu optimum untuk pertumbuhan dan produksi Penisilin G Asilase adalah 7 & C (Syamsuriputra,l995). Bacillus sp. strain BAC4 mampu memproduksi Penisilin G Asilase (PGA) secara ekstraseluler sehingga jenis mikroba ini dipertimbangkan untuk dimanfaatkan sebagai sumber yang dapat direkayasa. Untuk keperluan rekayasa tersebut dilakukan penelitian mengenai karakterisasi gen pga (Ratnaningsih et al., 1999) dengan mengamplifikasi gen tersebut menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

Dari hasil uji aktivitas Penisilin Asilase diperoleh bahwa Bacillus sp. strain BAC4 selain memiliki aktivitas Penisilin G Asilase, juga menunjukkan aktivitas Penisilin

V

Asilase (Khiong,1999.; Utami et al., 2001).

Apakah gen pengkode Penisilin

V

Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapat diamplifikasi dengan primer-primer yang disintesis berdasarkan

urutan

nukleotida gen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis ?

13. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen pengkode Penisilin

V

Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dengan menggunakan teknik PCR.

1.4. kegunaan penelitian

Usaha amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapat digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan penelitian lanjutan penentuan Urutan nukleotida gen ini dan untuk memproduksi enzim Penisilin Asilase yang sudah direkayasa secara genetik, sehingga dapat digunakan untuk membuat antibiotika semisintetik turunan penisilin yang baru, yang dapat digunakan untuk mengatasi masalah resistensi yang sedang berkembang saat ini.

1.5. Metodologi Penelitian Eksperimental eksploratif

1.6. Lokasi dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengembangan

Ilmu

Kedokteran

Dasar

Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha, dari bulan Maret - Mei 2001.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari DNA kromosom bacillus sp. Strain BAC4 secara in vitro, dengan teknik PCR menggunakan primer yang disintesis berdasarkan urutan nukleotida gen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis, belurn rnemberikan hasil

5.2. Saran

Untuk memperoleh hasil yang lebih baik perlu dilakukan reamplifikasi dengan menggunakan primer-primer baru yang berbeda dari ptinier-primer yang digunakan dalam penilitian ini. Primer baru yang lebih spesifik tersebut dapat diperoleh melalui perancangan primer-primer berdasarkan data GenBank yang sudah ada

Selain dengan mencari primer-primer baru yang lebih spesifik, reamplifikasi juga sebaiknya dilakukan dengan mencari kondisi PCR yang lebih tepat.

DAFTAR PUSTAKA

Abraham, E.P., et al. 1941. Lancet. 2 :1977.

Abraham, E.P., etal. 1955. Nature

(London).

176 : 551. Brandl, E. 1972. sci Pharm. 40: 1.

Bondareva, N.S., Levitov,

MM.,

and Robinovich,

M.S.

1969. Biokhimiya.

34:478.

Brown, T.A. 1995. Gene Cloning: an introduction. Chapman &

Hall.

CarringtOn, T.R. 19'71. The Development of Commercial Processes for the Production of 6-MA. Proc.

R.

Soc.

Load.

Crueger, W., dan Crueger, A. 1984. Biotechnology:

a

textbook of industrial microbiology. Science Tech, Inc.

Innis,

M.A., and Gelfand, H.1994. Optimization of PCR :

PCR

Protocols. A Guide

to Menthod and Applications, Academic Press, Inc., California, 3-12.

Khiong. 1999.

Hibridisasi

Genom Bacillus sp. Strain BAC4 menggunakan “Probe” Gen Pengkode PeniSilin G Asilase. Tesis Magister. Bidang Khusus Genetika dan Biologi Molekuler Program Studi Biologi. Program Pascasarjana. Institut Teknologi Bandung.

Mahajan, P.B. 1984. Review Penicillin Acylase. Appl. Biochem & Biotech.

Humania Press Inc.

Martin, L., Prieto, M.A., Cortes, E., dan Garcia, J.L. 1995. Cloning

and

sequencing of the PAC gene and

coding

the penicillin G acylase of Bucillus megaterium ATCC 14945. Fems Microbiology Letters, 125: 287-292.

Meevotisom, V., dan Saunders,

J.R.

1987. Cloning and expression of penicillin

acylase gene from overproducting strains of Escherichia coli and Bacillus megaterim. Applied and Microbiology Biotechnology, 25: 372-378.

Mosher, H.Roy, Leo,C., Vining. 1992. Antibiotic Resistance. Encyclopedia of Microbiology. I:97-106.

Newton, C.A., dan Graham, A. 1997.

PCR.

Edition Scientific Publisher.

strain of Bacillus sp: culture enzyme, purification, and

PCR

experiments employing primers derived

from

B. megaterium pga gene. Annual report I. Graduate team Research Grant. URGE Project Directorate General of Higher Education Ministry of Education and culture. Indonesia.

Riniati.

1999. Usaha amplifikasi dan kloning fragmen gen penisilin G asilase Bacillus sp.

BAC4

strain lokal. Tesis Magister. Bidang Kimia Organik. Program Magister Kimia. Institut Teknologi Bandung.

sambrook, J., Fritsch, E.F.,

dan

Manniatis, T. 1989. Molecular cloning, A laboratorium manual. edition Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold Spring Harbor.

Soeng et al 2000. Determinasi Spesies Bacillus sp. Strain BAC Penghasil Penisilin

Asilase

Secara Molekuler Menggunakan

PCR.

Laporan Penelitian.

Bagian Biologi. Fakultas

Kedokteran.

Universitas Kristen Maranatha.

Syamsuriputra, A.A. 1993. Iden tifikasi, Penentuan Kondisi-kondisi Optimum

dan

Pemuliaan Isolat Bakteri Lokal BAC4 Penghasil Penisilin Asilase,

laporan

Mikrobiologi PAU ITB,

Laporan Akhir

Kegiatan Penelitian. 1992. Vol.2 Bandung.

Utami et al. 2001. Spesifisitas substrat Bacillus sp. BAC, strain lokal penghasil Penisilin Asilase. laporan Penelitian. Bagian Biologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Kristen Maranatha.

Valle, F., Gosset, G., Tenorio, B., Oliver, G.,

dan

Bolivar, F. 1986. Gene (20):

119-122.

Valle, F., Balbas, P., Merino, E., dan Bolivar, F. 1991. The role of penicillin amidase in nature and

in

industry. TIBS, 16: 36-40.

Vandamme, E.J.,

dan

Voets, J.P. 1974. Microbial penicillin acylase. Advance Apply Microbiology 1.