Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan

OPTIMASI PRODUKSI PENISILIN ASILASE (PAc)

MENGGUNAKAN B. megaterium MS941 REKOMBINAN

YANG MENGANDUNG GEN pac DARI B. thuringiensis BGSC

BD1 DENGAN METODE RESPON PERMUKAAN

FENTRI PARAMITHA PUTRI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014

Fentri Paramitha Putri

RINGKASAN

FENTRI PARAMITHA PUTRI. Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac

dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan. Dibimbing oleh KHASWAR SYAMSU dan ASTUTIATI NURHASANAH

Penisilin asilase (PAc, EC 3.5.1.11) adalah enzim yang sangat berperan dalam reaksi hidrolisis benzilpenisilin untuk menghasilkan asam 6-amino penisilanat (6-APA) yang merupakan bahan dasar antibiotika penisilin semisintetis. Ukuran gen btpac-bd1 hasil amplifikasi PCR adalah 2397 bp. Respon surface methodology (RSM) atau metode permukaan respon dengan menggunakan dua variabel yang ditambahkan di media produksi, yaitu dengan xilosa sebagai induser dan CaCl2 sebagai kation divalent, telah digunakan untuk mendapatkan

aktivitas dan aktivitas spesifik enzim PAc maksimal oleh B. megaterium

btpacBD1. Untuk dapat mencapai tujuan ini, kombinasi lima tingkat konsentrasi xilosa (dengan rentang 0.13% s.d 0.87%) dengan lima tingkat konsentrasi CaCl2

(dengan rentang 0.64 mM s.d 4.36 mM) sebanyak 22 percobaan telah diujicobakan.

Kultivasi batch dilakukan menggunakan labu erlenmeyer kocok pada suhu 28°C agitasi 180 rpm selama 48 jam kultivasi dengan volume kerja 100 mL dan 100 µL tetrasiklin sebagai media seleksi. Setiap percobaan diinokulasi dengan 10% inokulum dengan OD578nm sebesar 0.6 – 0.8 (Rajendhran et al. 2002).

Pemisahan enzim dari media kultivasi dilakukan dengan sentrifugasi suhu 4°C 6000 rpm selama 15 menit. Aktivitas enzim PAc pada ekstrak enzim kasar diuji dengan metode Balasingham et al. (1972). Penentuan kadar protein menggunakan metode Bradford (1976) mengggunakan Bovine Serum Albumin sebagai standar. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per milligram protein. Hasil komposisi media optimal diujicoba pada bioreaktor skala 10 Liter dengan volume kerja 5 Liter.

Metode Central Composite Design (CCD) yang digunakan untuk menganalisa pengaruh antara kombinasi xilosa dan CaCl2 ketika B. megaterium

btpacBD1 dikultivasi pada skala labu erlenmeyer menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 memberikan pengaruh yang nyata terhadap aktivitas PAc dari B. megaterium btpacBD1 dan model kuadratik dipilih berdasarkan hasil percobaan dengan (R2=0.86 (nilai p < 0.0001)). Aktivitas spesifik PAc tertinggi tercapai dan saat konsentrasi xilosa dan CaCl2 0.49% dan 2.40 mM pada pH medium sekitar 7.

Pada kondisi itu, aktivitas PAc yang didapatkan sebesar 1.318 ± 0.406 U/mL dengan kadar protein 0.0101 ± 0.01 mg/mL dan aktivitas spesifik 130.669 ± 50.241 U/mg. Verifikasi hasil komposisi media optimal pada labu Erlenmeyer dilakukan dan menghasilkan aktivitas enzim PAc 1.294 ± 0.171 U/mL dengan kadar protein 0.0102 ± 0.0003 mg/mL dan aktivitas spesifik 125.910 ± 13.309 U/mg. Komposisi media optimal digunakan pada skala bioreaktor 10 L. Aktivitas tertinggi (2.0687 ± 0.0820 U/mL) dan kadar protein tertinggi (0.0078 ± 0.0008 mg/mL) didapatkan pada jam ke-48 waktu kultivasi. Sedangkan aktivitas spesifik tertinggi (1260.521± 27.5711 U/mg). dihasilkan pada jam ke-18 waktu kultivasi. Kata kunci : Bacillus megaterium, CaCl2, CCD, Penisilin asilase, xilosa

SUMMARY

FENTRI PARAMITHA PUTRI. Optimization for Penicillin acylase (PAc) Production by Recombinant B. megaterium MS941 containing pac gene from B. thuringiensis BGSC BD1 using Response Surface Methodology Supervised by KHASWAR SYAMSU and ASTUTIATI NURHASANAH

Penicillin G acylase (Penicillin amidohydrolase EC 3.5.1.11/ PAc) catalyzes the conversion of benzylpenicillin, via hydrolysis of the amide bond in the benzylpenicillin side chain, releasing phenylacetic acid and 6-aminopenicillanic acid (6-APA). 6-APA is a key intermediate in the production of various semisynthetic penicillins. The size of btpac-bd1 gene from PCR amplification was 2397 bp. Respon surface methodology (RSM) with two variables added to the production medium, i.e. xylose as inducer and CaCl2 as divalent cations, were

used to obtain the optimum and specific activity of PAc produced by Bacillus megaterium btpacBD1. For this purpose, five different xylose concentrations (ranging from 0.13% to 0.87%) and five different CaCl2 concentration (ranging

from 0.64 mM to 4.36 mM) were analysed in combinations, in a total of 22 experiments.

Batch cultivation was carried out with agitation at 28°C at 180 rpm for 48 hours

in 500 mL buffeled erlenmeyer flasks containing 100 mL of cultivation medium.

Each flask was then inoculated with 10% (v⁄v) inoculum with initial OD578nm

between 0.6 to 0.8 (Rajendhran et al. 2002).To harvest,culture was centrifuged at 4°C and 6000 rpm for 15 min. The PAc activity in the clear supernatant was assayed according to the Balasingham et al. method (1972). Protein assay was performed according to the Bradford method (1976) using bovine serum albumin as protein standard. Specific activity of PAc was expressed as units per mg protein. The optimum medium composition was applied in the scaled up fermentation using a 10 Liter bioreactorwith working volume 5 Liter.

Central composite design used for the analysis of treatment combinations showed that when B. megaterium strain btpacBD1was cultivated in shake flasks, xylose and CaCl2 had significant effects on PAc volumetric activity and the quadratic model was in good agreement with the experimental results (R2= 0.86 (p-value < 0.0001)). The maximum specific activity was reached when xylose and CaCl2 concentrations were 0.49% and 2.4 mM, respectively, and medium pH around 7. Under such conditions, the activity of PAc achieved was 1.318 ± 0.406 U/mL with protein concentration 0.0101 ± 0.01 mg/mL and spesific activity 130.669 ± 50.241 U/mg protein. The validation experiment in shake flasks demonstrated that with such medium composition the volumetric activity achieved was 1.294 ± 0.171 U/mL with protein concentration 0.0102 ± 0.0003 mg/mL and spesific activity of PAc 125.91 ± 13.309 U/mg. The optimum medium composition was applied in 10 L bioreactor. The optimum volumetric activity (2.0687 ± 0.0820 U/mL) and protein concentration (0.0078 ± 0.0008 mg/mL) were achieved 48 h after the start of the cultivation. However, the optimum PAc specific acivity (1260.52 ± 27.5711 U/mg protein) was achieved 18 h after the start of the cultivation.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Bioteknologi

OPTIMASI PRODUKSI PENISILIN ASILASE (PAc)

MENGGUNAKAN B. megaterium MS941 REKOMBINAN

YANG MENGANDUNG GEN pac DARI B. thuringiensis BGSC

BD1 DENGAN METODE RESPON PERMUKAAN

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

Judul Tesis : Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari

B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan Nama : Fentri Paramitha Putri

NIM : P051114041

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Khaswar Syamsu, MScSt Ketua

Dr rer nat Astutiati Nurhasanah Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Bioteknologi

Prof Dr Ir Suharsono, DEA

Tanggal Ujian: (22 Agustus 2014)

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 ini ialah optimasi produksi enzim, dengan judul Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc) Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac

dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Khaswar Syamsu, MSc.St dan Ibu Dr. rer. nat Astutiati Nurhasanah selaku pembimbing, Ibu Dr. Ir, Mulyorini Rahayuningsih, M.Si. selaku dosen penguji, serta Ibu Dr. Niknik Nurhayati yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Is Helianti, M.Sc dan Ibu Dr. Budiasih Wahyuntari, M.Sc. beserta staff Laboratorium Teknologi Bioindustri (Biologi Molekuler non Virus dan Fermentasi) dan staff Laboratorium Bioteknologi (Recovery dan Fermentasi) dari Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, mama, adik-adik, mas galih, muti, sara serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2014

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vii

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 3

Tujuan Penelitian 3

Manfaat Penelitian 3

Ruang Lingkup Penelitian 3

2 TINJAUAN PUSTAKA 5

3 METODE 9

Bahan 9

Alat 10

Prosedur Analisis Data 11

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 15

Hasil 16

Pembahasan 25

5 SIMPULAN DAN SARAN 34

Simpulan 34

Saran 34

DAFTAR PUSTAKA 34

LAMPIRAN 40

DAFTAR TABEL

1. Penelitian produksi PAc 8

2. Rancangan percobaan Central Composite Design dengan dua faktor 13 3. Simbol faktor dan level yang digunakan pada Central Composite Design 13

DAFTAR GAMBAR

1. Reaksi hidrolisis penisilin G dengan enzim PAc (Rajendhran et al. 2004) 5

2. Plasmid pMM1525 (MoBiTeC 2007) 6

3. Diagram alir umum penelitian 9

4. Koloni tunggal B. megaterium btpacBD1 pada media seleksi 16 5. Hasil visualisasi plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi koloni

tunggal B. megaterium btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol positif; 3: Kontrol negatif (air); 4: Plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi 17 6. Hasil visualisasi gen btpac-bd1 hasil PCR dari plasmid hasil ekstraksi

koloni tunggal B. megaterium btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol negatif (air); 3: Kontrol positif; 4: Gen btpac-bd1 hasil PCR. 17 7. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level variabel terkodekan terhadap

aktivitas PAc 19

8. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level terkodekan terhadap aktivitas

spesifik PAc 20

9. Kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 dan aktivitas PAc dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi

150 rpm selama 60 jam. 21

10. Kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 22 11. Grafik hubungan antara rerata aktivitas enzim PAc dengan waktu 22 12. Grafik hubungan antara rerata kadar protein dengan waktu 23 13. Grafik hubungan antara rerata aktivitas spesifik enzim PAc dengan

waktu 23

14. Kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1( ) dan aktivitas PAc (A) kadar protein (B) dan aktivitas spesifik PAc (C) dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi 150 rpm selama

48 jam. 24

DAFTAR LAMPIRAN

1. DNA marker 1 kb dan Oligonucleotide primer xyl3 dan xyl 4 40

2. Sekuens xylA 41

3. MCS plasmid pMM1525 42

4. Data pengukuran kurva standar 6-APA 43

5. Data pengukuran kurva standar protein Bovine Serum Albumin 44 6. Data hasil Analisa Respon pada Optimalisasi menggunakan Central

Composite Design 45

7. Perhitungan statistik data hasil optimasi dengan aktivitas sebagai

respon 46

8. Perhitungan statistik data hasil optimasi dengan kadar protein 48 9. Perhitungan statistik data hasil optimasi dengan aktivitas spesifik

sebagai respon 49

10. Hasil optimalisasi media produksi enzim PAc oleh B. megaterium

btpacBD1 51

11. Data hasil analisa verifikasi komposisi media optimal 52 12. Data hasil analisa OD sel, aktivitas, kadar protein dan aktivitas

spesifik enzim PAc selama 60 jam pada skala bioreaktor 53 13. Data hasil analisa OD sel, aktivitas, kadar protein dan aktivitas

DAFTAR SINGKATAN

6 APA : Asam 6-aminopenilsilanat

CCD : Central Composite Design

LPS : Lipopolisakarida

Larutan CI : Larutan Chloroform Isoamyl alcohol

Larutan PCI : Larutan Phenol Chloroform Isoamyl alcohol

Larutan PDAB: Larutan p-dimethylamino-benzaldehyde

LB : Luria Bertani

LB cair-tet : Luria Bertani cair yang ditambah 1% tetrasiklin (12.5 mg/mL) LB padat-tet : Luria Bertani padat yang ditambah 1% tetrasiklin (12.5 mg/mL) MCS : Multiple Cloning Site

OD : Optical Density

PAc : Penicillin Acylase/ Penisillin Asilase PCR : Polymerase Chain Reaction

Pen-G : Penisilin G

pMMbtpac-bd1 : Plasmid pMM1525 rekombinan yang disisipkan gen btpac-bd1

RSM : Response Surface Methodology

Tc : Tetracyclin

XylA : Promotor Xilose A

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Antibiotika yang paling banyak digunakan (sekitar 19% dari pasar antibiotik dunia) adalah penisilin G (Pen-G) (Parmar et al. 2000). Pen-G bekerja dengan menghambat kerja enzim transpeptidase sehingga pembentukan peptidoglikan dinding sel bakteri tidak terjadi pada fase produksi (Madigan et al. 2003). Saat ini penggunaan penisilin telah mengarah pada resistensi patogen karena digunakan dalam jumlah besar dan secara terus-menerus. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa bakteri patogen dapat memproduksi enzim β-laktamase yang mampu menghidrolisis cincin β-laktam menjadi penisilin yang tidak aktif/ penicilloic acid (Navarro et al. 2004). Selain itu, pen-G merupakan antibiotik yang sensitif terhadap β-laktamase dan tidak stabil terhadap asam sehingga menimbulkan alergi pada beberapa penggunanya (Madigan et al. 2005). Oleh karena itu, dikembangkan antibiotik-antibiotik turunan pen-G melalui modifikasi struktur penisilin dengan membentuk produk penisilin semisintetik yang memiliki sifat-sifat yang lebih baik dari pada penisilin alami agar efektifitas antibiotik ini dapat diperoleh kembali (Wilson 1982; Hammond 1978).

Dalam industri, enzim yang dapat menghidrolisis Pen-G adalah penicillin G acylase (PGA) atau penisilin asilase (PAc) yang bekerja dengan memutus ikatan amida pada rantai samping sehingga menghasilkan inti molekul penisilin atau asam 6-aminopenilsilanat (APA) (Wilson 1982; Greenwood 1995). Zat 6-APA merupakan bahan baku utama untuk produksi penisilin semisintetik seperti metilsilin, ampisilin dan amoksisilin serta inhibitor β-laktamase (asam klavulanat) (Wilson 1982). Ampisilin dan amoksisilin adalah antibiotik yang dapat bekerja pada membran sel bakteri gram positif maupun negatif. Zat 6-APA dapat diproduksi melalui proses fermentasi, hidrolisis penisilin secara kimiawi, dan enzimatik. Proses hidrolisis pen-G menjadi 6-APA menggunakan enzim PAc dijadikan pilihan karena mudah dilakukan dan paling menguntungkan (Crueger dan Crueger 1984; Shewale dan Sivaraman 1989; Carrington 1971).

Langkah awal yang dilakukan untuk menghidrolisis pen-G menjadi 6-APA diperlukan enzim PAc. Peningkatan produksi PAc banyak dilakukan melalui optimasi rekayasa genetika dan optimasi bioproses berdasarkan komposisi media atau kondisi kultivasi. Penggunaan teknik rekayasa genetika telah berhasil mengembangkan strain yang menghasilkan PAc dalam jumlah besar, yaitu dengan teknologi DNA rekombinan dengan cara kloning gen pac ke dalam plasmid. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan untuk mengubah urutan-urutan tertentu yang berkaitan dengan pengendalian ekspresi gen secara tepat dan terarah.

Bakteri gram negatif penghasil enzim PAc adalah Escherichia coli (Cole 1969), Kluyvera citrophila (Barbero et al. 1986), Providencia rettgeri (Proteus rettgeri) (Klei et al. 1995) dan Alcaligenes faecalis (Verhaert et al. 1997). Sedangkan bakteri gram positif berasal dari golongan Arthrobacter viscosus

(Ohashi et al. 1989) dan Bacillus megaterium (Chiang dan Bennet 1967). Selain

B. megaterium, bakteri gram positif lain yang berpotensi dan dapat dieksplorasi untuk memproduksi enzim PAc adalah B. thuringiensis serovar Huazhongensis BGSC galur 4 CC1, 4 BD1, 4 AJ1 dan 4 AW1. Berdasarkan data sekuens genom yang tersedia di GenBank keempat galur B. thuringiensis tersebut memiliki gen

2

penyandi enzim PAc. Hasil analisa mikrobiologi menggunakan Serratia mercescens menunjukkan keempat galur B. thuringiensis tersebut menghasilkan enzim PAc yang mampu menguraikan Pen-G (Nurhayati 2009).

Namun bakteri yang memproduksi enzim PAc secara komersial adalah

E.coli dan B. megaterium (Vandamme dan Voets 1974). B. megaterium dengan aktivitas protease ekstraseluler yang relatif rendah telah dikembangkan sebagai sel inang untuk produksi protein rekombinan (Wittchen dan Meinhart 1995). Berbeda dengan ekspresi protein rekombinan pada E. coli yang biasanya terjadi secara intraseluler, ekspresi pada B. megaterium dapat dilakukan secara ekstraseluler, menggunakan vektor ekspresi yang tepat (misalnya yang dilakukan oleh Malten et al. 2006). Berbeda dengan ekspresi intraseluler di E. coli, proses panen dilakukan dengan sentrifugasi dingin karena sekresi protein langsung ke media kultivasi sehingga tahap lisis sel dengan sonikasi seperti pada E.coli tidak perlu dilakukan (Hammond 1978). Kekurangan E. coli lain adalah keberadaan lipopolisakarida (LPS) sebagai salah satu komponen membran luar pada bakteri gram negatif yang bersifat racun bagi manusia (endotoksin).

Kloning gen pac diamplifikasi dari DNA genom B. thuringiensis BGSC BD1. Produk amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu gen btpac-bd1

disisipkan ke DNA plasmid pMM1525 dengan menghilangkan sinyal peptida di dalam plasmid. Hal ini dilakukan karena berdasarkan urutan DNA gen btpac-bd1, diduga enzim PAc yang dihasilkan telah memiliki sinyal peptida sendiri yang mengarahkan untuk sekresi protein rekombinan keluar sel. Hasil konstruksi plasmid rekombinan diberi nama pMMbtpac-bd1 (Nurhayati 2009).

Menurut Yang et al. (2006), B. megaterium YYBm1 menghasilkan PAc tertinggi dengan penambahan xilosa 0.5% dan 2.5 mM CaCl2. Pemanfaatan

xilosa dapat mendorong promotor xylA untuk meningkatkan produksi enzim rekombinan yang lebih tinggi (Yang et al. 2006). Ion Ca2+ merupakan kation bivalen yang merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang mempermudah interaksi dengan substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim (Susanti 2003). Kasche et al.

(2005) menambahkan bahwa Ca2+ adalah kofaktor untuk transportasi membran. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian Yang et al. (2006) salah satunya adalah metode penelitian. Berbeda dengan penelitian Yang et al. (2006) yang melakukan penelitian dengan metode diskrit dengan melakukan percobaan berulang-ulang, penelitian ini menggunakan teknik optimasi menggunakan metode permukaan respon (Response Surface Methodology atau RSM) melalui

software Design-Expert yang menggunakan bantuan model statistika dan matematika untuk mengetahui respon dari kombinasi yang dilakukan. Oleh karena itu, permasalahan utama dalam penelitian ini adalah belum diperolehnya konsentrasi xilosa dan CaCl2 serta waktu kultivasi optimal pada produksi PAc.

Tujuan dari optimasi adalah untuk meminimumkan usaha yang diperlukan atau biaya operasional dan memaksimumkan hasil yang diinginkan. berbeda dengan metode diskrit dengan melakukan percobaan berulang-ulang, penggunaan RSM melalui software Design-Expert dapat meningkatkan keakuratan dan meminimalisasi terjadinya kesalahan. Dalam optimasi ini, permasalahan akan diselesaikan untuk untuk meningkatkan keakuratan, meminimalisasi kesalahan dan mendapatkan hasil sesuai dengan batasan yang diberikan (Box dan Draper 2007).

3 Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian pada latar belakang, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut :

1. Apakah kultur stok bakteri B. megaterium btpacBD1 masih mengandung gen

bt-pacbd1

2. Bagaimana pengaruh besarnya kombinasi konsentrasi xilosa dan CaCl2

terhadap kultivasi produksi enzim PAc rekombinan

3. Bagaimana pengaruh komposisi media terpilih saat dilakukan kultivasi pada skala bioreaktor

4. Kapan waktu kutivasi terbaik untuk proses panen enzim PAc Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mendeteksi keberadaan gen btpac-bd1

2. Mendapatkan komposisi media kultivasi optimal untuk produksi enzim PAc rekombinan berdasarkan konsentrasi xilosa dan CaCl2 dengan metode Central Composite Design (CCD)

3. Memproduksi enzim PAc rekombinan pada skala bioreaktor 4. Mendapatkan waktu panen enzim PAc terbaik

Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah untuk menghasilkan enzim PAc rekombinan yang dapat menghidrolisis antibiotik Pen-G sehingga menghasilkan zat 6-APA yang dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan penisilin semisintetik yang memiliki sifat dan kualitas yang lebih baik dari penisilin alami.

Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup penelitian seleksi dan optimasi media kultivasi untuk produksi enzim PAc oleh B. megaterium btpacBD1 rekombinan adalah sebagai berikut:

1. Penyiapan inokulum meliputi peremajaan sel pada media Luria Bertani padat yang ditambahkan tetrasiklin (12.5 mg/mL) sebanyak 1% (LB padat-tet) dan persiapan prekultur pada media LB cair-tet sebagai media seleksi. 2. Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 dilakukan dengan seleksi B.

megaterium btpacBD1 dengan marka genetik, ekstraksi plasmid pMMbtpac-bd1 dan Polymerase Chain Reaction (PCR)

3. Kultivasi produksi PAc menggunakan metode CCD dilakukan di inkubator kocok di dalam baffled erlenmeyer 500 mL dengan volume kerja 100 mL LB cair-tet (pH 7) pada suhu 28oC dan agitasi 180 rpm selama 48 jam. 4. Kultivasi produksi PAc dengan bioreaktor berkapasitas 10 liter dengan

volume kerja 5 Liter media hasil optimasi CCD (pH 7) pada suhu 28oC dan agitasi 150 rpm dengan aerasi 1 vvm selama 60 dan 48 jam.

5. Analisa parameter produksi yang meliputi Optical Density (OD), aktivitas enzim PAc (U/mL), kadar protein (mg/mL) dan aktivitas spesifik enzim PAc (U/mg) dilakukan setiap 6 jam.

4

2 TINJAUAN PUSTAKA

Penisilin G

Penisilin G (Pen-G) dikenal sebagai benzilpenisilin yang merupakan substrat dari enzim PAc untuk pengujian aktivitas enzim. Pen-G berbentuk garam kalium atau natrium yang berupa bubuk putih sampai sedikit kuning, tidak berbau, agak higroskopis relatif stabil di udara. Penisilin dapat menjadi non aktif apabila terkena pengaruh panas, sistein, NaOH, penicilinase (enzim yang terdapat dalam banyak bakteri yang dapat merusak penisilin) dan asam hidroklorat. Zat lain yang dapat merusak Penisilin antara lain adalah logam-logam berat seperti Cu, Ag, Fe, dan Zn (Sarah 2002).

Pen-G merupakan suatu antibiotika yang tidak dapat diberikan melalui mulut karena sifatnya yang tidak stabil dengan asam hidroklorat di lambung, bekerja pada lingkup kerja yang sempit (hanya efektif pada bakteri gram positif). Bakteri patogen yang resisten terhadap pen-G adalah Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pneumococcus, B. antrachis, B. substilis, B. diptheria, Listeria monocytogenes, Clostridia, Gonococcus dan Meningococcus

(Wattimena et al. 1991) dan juga dapat menimbulkan alergi gatal-gatal serta reaksi efek samping yang menyebabkan penyakit (diare dan superinfeksi dari kandidiasis). Selain itu pen-G juga sangat sensitif terhadap enzim β-laktamase yang dapat memutus ikatan pada cincin β-laktam. Sifat dari antibiotika ini akan hilang jika cincin terputus karena β-laktamase, karena proses penghambatan enzim transpeptidase pada pembentukan lapisan peptidoglikan dinding sel bakteri tidak dapat terjadi. Selain itu, munculnya resistensi bakteri terhadap antibiotika dipengaruhi oleh adanya gen resistensi yang terdapat dalam plasmid, transposon, atau dalam kromosom bakteri (Morin dan Gorman 1995; Madigan et al. 2003). Penisilin Asilase (PAc, EC 3.5.1.11)

Penisilin asilase (PAc) dikenal sebagai penisilin amidase, penisilin transferase dan penisilin amidohidrolase dengan nomor golongan enzim (EC 3.5.1.11) Berdasarkan jenis substrat yang dihidrolisis, enzim ini terbagi menjadi: (1) penisilin G asilase yaitu dengan substrat benzilpenisilin; (2) penisilin V asilase yaitu dengan substrat fenoksimetilpenisilin; (3) Ampisilin asilase yaitu dengan substrat D-α aminobenzilpenisilin (ampisilin). Enzim ini dapat dihasilkan oleh E. coli secara intraselular. Pada gram positif enzim ini dihasilkan oleh B. megaterium

dan Micrococcus roseus. Pada B. megaterium, PAc ini dihasilkan secara ekstraselular (Chiang dan Bennet 1967; Huber et al. 1972; Vandamme 1973; Meevotisom et al. 1983).

5

Gambar 1. Reaksi hidrolisis penisilin G dengan enzim PAc (Rajendhran et al. 2004)

Xilosa

Xilosa disebut gula kayu karena merupakan senyawa gula yang pertama kali diisolasi dari kayu. Rumus kimia xilosa adalah C5H10O5 dengan berat molekul

150,13 g/mol dan titik leleh 144 – 145°C. Xilosa merupakan salah satu penyusun utama dari hemiselulosa, yang terkandung sekitar 30% dalam tanaman. D-xilosa dapat diperoleh melalui hidrolisis hemiselulosa (xilan) baik secara enzimatis maupun asam. Xilosa diklasifikasikan sebagai monosakarida tipe aldopentosa yang memiliki 5 atom karbon dan satu gugus aldehid.

Kalsium klorida (CaCl2)

Kalsium klorida merupakan tipe ion halida yang terdiri dari kalsium (Ca) dan klorin (Cl). Garam ini berwarna putih, tidak berbau, tidak berwarna dan tidak mudah terbakar. Kalsium klorida dapat berfungsi sebagai sumber ion kalsium dalam larutan yang mudah larut dalam air (tidak seperti senyawa kalsium lain). Zat ini dapat berguna untuk menggantikan ion dari larutan. Hasil penelitiam Yang

et al. (2006) menunjukkan bahwa penambahan CaCl2 sebesar 2.5 mM akan

meningkatkan biomassa dari B. megaterium YYBm1 dan biomassa akan menurun jika ditambahkan CaCl2 sebesar 5 mM. Ion Ca2+ merupakan kation bivalen yang

merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang mempermudah interaksi dengan substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim (Susanti 2003). Hal ini berdasarkan penelitian Duggleby et al. (1995) yang menunjukkan bahwa Ca2+ mempengaruhi formasi dari enzim PAc aktif. Hal ini diperkuat oleh (Kasche et al. 2005: Ignatova

et al. 2005) yang menyatakan bahwa Ca2+ adalah kofaktor untuk translokasi membran yang berperan dalam pelipatan dan pematangan enzim di periplasma. Bacillus megaterium dalam Sistem Ekspresi Protein Rekombinan

Bakteri gram positif B. megaterium mempunyai kelebihan untuk produksi protein rekombinan karena tidak memproduksi protease alkalin ekstraseluler yang memungkinkan sebuah sistem kloning yang sangat baik dan ekspresi dari protein asing tanpa adanya degradasi dan dinding sel yang bebas dari endotoksin (Meinhardt et al. 1989; Rygus dan Hillen 1991).

6

Kloning gen pac dari DNA B. thuringiensis BGSC BD1 (btpacBD1) dilakukan dengan menyisipkannya ke dalam B. megaterium MS941 menggunakan DNA plasmid pMM1525 untuk membentuk konstruk plasmid DNA rekombinan pMMbtpac-bd1 (Nurhayati 2009). Tahap dasar proses kloning adalah memasukkan fragmen DNA asing dengan ukuran yang spesifik ke dalam vektor dan dimasukkan ke dalam sel inang. Vektor ekspresi memiliki elemen genetik yang dapat mengkontrol proses transkripsi, translasi dan sekresi protein rekombinan yang akan diekspresikan dalam sel inang. Vektor memiliki sekuen pengatur transkripsi dan translasi gen asing untuk dapat mengekspresikan protein rekombinan (Glick dan Pasternak 2003; Sambrook dan Russell 2001).

Plasmid pMM1525 adalah suatu shuttle vector E.coli dan Bacillus yang dirancang untuk mengekspresikan gen asing, sehingga dapat dikenali oleh sel inang B. megaterium. Vektor ini dilengkapi dengan sinyal peptida yang memungkinkan disekresikannya enzim rekombinan keluar sel (ekstraseluler). Selain itu, adanya sekuens 6x His-tag membuat protein rekombinan dapat dideteksi dan dipurifikasi dari hasil ekspresi gen. Plasmid pMM1525 juga mengandung gen xylose-dependent repressor (xylR) yang merupakan gen pengkode protein represor yang akan menghambat transkripsi gen pac jika tidak terdapat xilosa Dengan adanya gen xylR, protein represor yang dihasilkan akan semakin banyak, sehingga pengontrolan ekspresi gen juga akan semakin kuat. Setelah ditambahkan suatu induser yang berupa xilosa, maka xylose repressor

pada plasmid akan dibebaskan dengan menginaktivasi protein represor dengan cara berikatan dengan protein represor tersebut. Protein represor yang tidak aktif tidak dapat berikatan dengan operator sehingga RNA polimerisase sel inang B. megaterium akan mentranskripsi sekuen gen yang berada di bawah sekuen promotor xylA yang memungkinkan terjadinya transkripsi gen pac jika diinduksi oleh xilosa. Hasil transkripsi tersebut kemudian ditranslasi menjadi protein rekombinan yang diinginkan (MoBiTec 2007).

Gambar 2. Plasmid pMM1525 (MoBiTeC 2007)

Plasmid pMM1525 berupa DNA ekstrakromosomal bakteri yang berupa lingkaran heliks ganda, untuk membentuk konstruk plasmid DNA rekombinan

7 yang dirancang sebagai vektor ekspresi yang baik untuk sel prokariot. Plasmid pMM1525 (Gambar 4) mempunyai : (1) Promotor xlyA (PxlyA)untuk dikenali oleh

RNA polimerase Bacillus megaterium; (2) Sekuen operator xyl untuk meningkatkan pengikatan terhadap protein represor; (3) Gen xylR untuk mengkode protein repressor; (4) Multiple cloning site (MCS) yang dapat didigesti oleh berbagai enzim-enzim restriksi (antara lain BsrGI dan Xmal) sehingga beberapa pilihan enzim tersedia untuk menginsersikan gen pada posisi ini; (5)

Ribosome binding site (RBS) untuk meningkatkan laju translasi; (6) pBR/ColE1 untuk titik replikasi; (7) Gen TetR (Bac) untuk penyandi gen resistensi tetrasiklin

Bacillus; (8) Gen TetR’ , Tet R” untuk gen penyandi resistensi terhadap antibiotik tetrasiklin (9); Gen AmpR untuk gen penyandi resistensi ampisilin; (10) Sekuen purifikasi tag (6xHis, Strep or strep/6xHis-double) untuk deteksi dan purifikasi protein rekombinan yang dihasilkan (MoBiTec 2007).

Produksi Enzim PAc

Mikroorganisme penghasil PAc dapat beradaptasi dengan variasi komposisi media dan parameter kultivasi yang cocok. Untuk mengoptimasi produksi PAc, kondisi kultivasi dengan mengubah parameter yang saling terkait telah dilakukan (Liu et al. 2000; Maresova et al. 2001) dan berbagai komponen yang dibutuhkan seperti nutrien, sumber karbon dan sumber nitrogen juga telah dilakukan di jenis bakteri yang berbeda (Pinotti et al. 2000; Rajendhran et al.

2002, 2003; Yang et al. 2006; Leonita 2013; Putri 2013). Upaya peningkatan produktivitas PAc dari Bacillus megaterium ATCC 14945 masih terus dilakukan salah satunya melalui rekayasa genetika (Panbangred et al. 2000; Yang et al. 2006; Cecchini et al. 2007; Nurhayati 2009).

Hasil penelitian Rao dan Garcia (1997) menunjukkan bahwa produksi PAc oleh K. citrophila dan diinduksi oleh PAA terbukti mengalami represi katabolit oleh sumber karbon yang menggunakan glukosa. Menurut Szentirmai (1964), produksi PAc meningkat jika senyawa penginduksi PAA ditambahkan ke dalam media pertumbuhan, tetapi produksi akan terhambat jika bakteri ditumbuhkan dalam media yang mengandung nutrisi yang dapat langsung diproses untuk metabolisme seperti glukosa, fruktosa dan gliserol. Menurut Valle et al. (1991), B. megaterium mungkin menghasilkan PAc ekstraseluler untuk mendegradasi PAA yang dapat digunakan sebagai sumber karbon. Namun represi katabolit tidak terjadi pada produksi enzim PAc oleh B. megaterium btpacBD1. Berdasarkan hasil penelitian Leonita (2013) yang menggunakan modifikasi media produksi Rajendhran et al. (2002) yaitu tanpa penggunaan senyawa PAA sebagai induser melaporkan bahwa aktivitas spesifik optimal oleh B. megaterium btpacBD1 adalah sebesar 1018.83 U/mg selama 36 jam kultivasi dengan penambahan xilosa 4% pada media kompleks. Hasil penelitian Rajendhran et al. (2003) menunjukkan bahwa aktivitas spesifik optimal oleh strain Bacillus sp. adalah 10.1 U/mg selama 16 jam kultivasi (fase stasioner). Mardiah et al. (2010) melaporkan bahwa enzim PAc dapat diproduksi dari bakteri B. megaterium NRLL B-1368 pada media cair yang ditambah induser asam fenil asetat (PAA) setelah 12 jam kultivasi sebanyak 1.5 g/L media. Aktifitas enzim PAc sebesar 9.978 U/mL dan aktifitas spesifik 1.2316 U/mg protein selama 48 jam.

8

Tabel 1. Penelitian produksi PAc Metode

Penelitian

Bakteri Non Bakteri

Tipe liar Rekombinan Tipe liar

Diskrit Acevedo dan Cooney

(1973) Panbangred et al. (2000)

Mardiah et al.

(2010) Rao dan Garcia (1997) Liu et al. (2000)

Moeis et al. (2000) Maresova et al. (2001) Pinotti et al. (2000) Yang et al. (2006) Agustien et al. (2008) Cecchini et al. (2007) Supartono et al. (2003) Leonita (2013)

Ignatova et al. (2005) Putri (2013) Supartono et al. (2008) Savidge (1986) El Enshasy et al. (2009)

Mardiah et al. (2010)

RSM Rajendhran et al. (2002) Putri (2014) Rajendhran et al. (2003)

Rancangan Optimasi Media

Metode optimasi untuk rancangan percobaan statistik yang paling umum digunakan adalah Response Surface Methodology (RSM). Dengan RSM suatu model empiris dibangun berdasarkan data yang diperoleh dari percobaan yang telah dirancang sebelumnya. Central composite design diperkenalkan oleh Box dan Wilson pada tahun 1951 yang merupakan suatu rancangan yang terdiri dari rancangan faktorial tingkat dua dengan dua level (tertinggi dan terendah) ditambah dengan beberapa titik yang memungkinkan untuk meramalkan adanya efek interaksi antar faktor yang dicoba. Kelompok titik tambahan yang pertama disebut starting point yang merupakan matriks bujur sangkar yang diagonal utamanya bernilai ± 2k/4, dimana k adalah jumlah faktor yang dioptimasi. Sedangkan kelompok titik tambahan kedua disebut center point yang merupakan kombinasi dari semua titik tengah faktor yang akan dioptimasi. Central composite design banyak digunakan peneliti untuk merancang percobaan optimasi setelah faktor-faktor yang mempunyai pengaruh terhadap hasil akhir yang diinginkan diketahui melalui percobaan berdasarkan rancangan faktorial yang lain (Box dan Draper 2007).

3

METODE

Ruang lingkup penelitian yang dilakukan meliputi tahap pembuktian keberadaan gen btpac-bd1, persiapan inokulum, optimasi xilosa dan CaCl2 dengan

9

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan selama 12 bulan mulai bulan Maret 2013 sampai dengan Maret 2014 di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Puspitek, Serpong, Tangerang Selatan.

Bahan

Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri rekombinan Bacillus megaterium btpacBD1 yang berasal dari kultur koleksi Laboratorium Teknologi Bioindustri (LTB-BPPT).

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah SET buffer, lisozim. NaOH-SDS segar, kalium asetat 5M dingin, larutan PCI (phenol: chloroform: iso amyl alcohol), larutan CI (chloroform: iso amyl alcohol), larutan isopropanol, etanol 70%, DNAse, gel agarosa 1% dan larutan EtBr.

Mix PCR yang terdiri dari primer xyl 3 10 M, primer xyl 4 10 M, 10x

KAPA Buffer (B) with Mg2+, dNTP, KAPA Tag polymerase, hasil ekstraksi sel dan ddH2O. Komposisi media yang terdiri dariMOPS (pH 7.0), Tricin (pH 7.0),

MgCl2.6H2O, K2SO4, FeSO4.7 H2O, CaCl2, MnCl2.4H2O, NaCl, KCl, NH4Cl,

K2HPO4, glukosa, trace element solution, dan vitamin solution. (NH4)

6Mo7O24.4H2O, H3BO3, CoCl2, CuSO4, MnCl2, ZnSO4, biotin, niacin amida,

p-amino benzoat, Ca-panthotenate, pyridoxal / HCl, folacid, riboflavin, asam DL-6,8-thioctic, tiamin diklorida, MgSO4.7H2O, CaCl2.H2O, NaCl, yeast ekstrak,

Komposisi media terbaik Mikroba rekombinan terkonfirmasi

Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 dengan seleksi dengan marka genetik, ekstraksi plasmid dan PCR

Optimasi xilosa dan CaCl2 dengan metode CCD menggunakan

parameter optimasi: aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik

Validasi komposisi media pada skala bioreaktor 10 L Persiapan prekultur dan inokulum

Penentuan waktu panen enzim pada skala bioreaktor selama 60 jam

10

tripton, xilosa, agar, dan tetrasiklin dalam etanol 100%, gliserol, garam fisiologis, etanol 95%, aquades, larutan asam asetat 20%, NaOH 50mM, metanol, penisilin G 0.5 M, pDAB (4 Para Dimetil Amino Benzaldehid), larutan buffer Na – fosfat 0.05 M pH 7 dan larutan Bradford (5x).

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Refrigerated Centrifuge

[Hitachi CR226], Rotor RIOA2, Cold Microsentrifuge Sorvall, Fresco, [Hettich Zentrifugen-micro 200R], deep freezer -80°C, Inlab pH meters (USA), Autoclave,

Laminar airflow, Inkubator kocok [GFL dan New Brunswick Scientific], Bioreaktor [Biostat], Spectrophotometer, Mastercycler personal, Electrophoresis,

Milipore dan alat gelas lain.

Prosedur Analisis Data

Pembuktian Keberadaan Gen btpac-bd1

Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 bertujuan untuk mengkonfirmasi mikroba yang digunakan pada penelitian merupakan mikroba rekombinan. Tahap yang dilakukan adalah dengan seleksi Bacillus megaterium btpacBD1 rekombinan dengan marka genetik, ekstraksi plasmid pMMbtpac-bd1 dan Polymerase Chain Reaction (PCR) koloni tunggal B. megaterium btpacBD1.

Seleksi Mikroba Rekombinan dengan Marka Genetik

Seleksi mikroba rekombinan dilakukan untuk mendapatkan koloni tunggal dari kultur seleksi isolat B. megaterium btpacBD1 rekombinan. Selain itu, koloni tunggal juga dapat digunakan untuk membuat kultur stok dalam gliserol 75% dan inokulum. Isolat diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasi ke dalam 25 mL media LB padat yang ditambahkan 1% tetrasiklin 12.5 mg/mL (LB-tet padat) sebagai media seleksi menggunakan metode cawan kuadran secara aseptis di laminar air flow. Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada 37°C selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal. Komposisi media per liter terdiri dari 5 g NaCl, 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak dan 15 g agar yang dilarutkan dalam air mili-Q (pH 7) (Yang et al. 2006).

Prosedur Deteksi Plasmid Rekombinan pMMbtpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid (Voskuil dan Cambliss 1993) dan PCR

Tujuan ekstraksi dan PCR adalah untuk mendeteksi keberadaan plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1. Proses ekstraksi dilakukan dengan menginokulasi 1 koloni tunggal pada 40 mL LB cair yang ditambahkan 1% tetrasiklin 12.5 mg/mL (LB-tet cair) dengan komposisi media yang hampir sama dengan LB padat, namun tanpa penambahan agar dan diinkubasi pada inkubator kocok dengan agitasi 70 rpm pada suhu 37°C selama 20 – 24 jam hingga Optical Density atau kerapatan sel bakteri (OD) pada panjang gelombang 578 nm mencapai 0.6 – 0.8. Selanjutnya, kultur disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan endapan disuspensi dengan 100 µL SET buffer yang mengandung 10

11 mg lisozim. Lalu 200 µL campuran diambil dan diinkubasi pada 37°C selama 10 menit. Setelah diinkubasi, campuran ditambahkan 350 µL NaOH-SDS segar dan diresuspensi hingga larutan menjadi jernih. Setelah jernih, campuran ditambahkan 350 µL larutan kalium asetat 5M dingin dan divortex selama 10 detik. Kemudian campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya, 200 µL supernatan diambil dan diekstraksi dengan 200 µL larutan PCI (phenol:chloroform:isoamylalcohol dengan perbandingan 25:24:1). Campuran divorteks selama 1 menit dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Lalu akan terbentuk 3 fase, 70 µL fase bening diambil dan diekstraksi dengan larutan CI (chloroform:isoamylalcohol dengan perbandingan 24:1). Campuran divorteks dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Lalu akan terbentuk 2 fase, 40 µL fase bening diambil dan dipresipitasi dengan 40 µL larutan isopropanol. Kemudian campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang dan endapan yang merupakan DNA plasmid dicuci dengan ethanol 70%. Campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan endapan dikeringkan dengan vacuum evaporator selama 10 menit. Setelah endapan kering, DNA plasmid dilarutkan pada 50 µL air mili-Q yang mengandung 20 mg/mL DNAse. DNA plasmid hasil ekstraksi lalu di dielektroforesis pada gel agarosa 1% selama 25 menit. Lalu gel direndam pada larutan EtBr selama 10 menit. Gel dibilas dengan aquades dan hasil visualisasi dilihat. Jika terdapat pita tunggal, DNA plasmid hasil ekstraksi akan diuji selanjutnya dengan uji polymerase chain reaction (PCR).

Hasil ekstraksi plasmid rekombinan selanjutnya di uji PCR menggunakan primer xyl3 (5’-TTA TCC ACC GAA CTA AGT TGC TG-3’) dan primer xyl 4

(5’-TGG AGT GGT GAA TCC GTT AG-3’10 M) untuk mengamplifikasi gen

pac. Komposisi campuran PCR dengan total volume 50 mL mengandung 0.5 µL primer xyl3 10 M, 0.5 µL primer xyl4, 5.0 µL 10x KAPA Buffer (B) with Mg2+, 0.5 µL dNTP, 0.2 µL KAPA Tag polymerase, 2,0 µL hasil ekstraksi sel dan 41.3 µL ddH2O. Tahapan proses amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycler

adalah sebagai berikut: suhu 95°C selama 5 menit (Pre-denaturasi), suhu 94°C selama 1 menit (denaturasi), suhu 61°C selama 30 detik (Annealing/ penempelan), suhu 72°C selama 2 menit (Extension/ pemanjangan) dan suhu 72°C selama 10 menit (Final Extension). Proses akan diulang sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% selama 25 menit. Lalu gel direndam pada larutan EtBr selama 10 menit. Gel dibilas dengan aquades dan hasil visualisasi dilihat.

Penyiapan Inokulum

Penyiapan inokulum dilakukan untuk mengadaptasi sel bakteri agar siap untuk dikultivasi pada media produksi. Seed culture dibuat dengan menginokulasi satu koloni tunggal hasil peremajaan isolat ke 15 mL media LB-tet cair yang diinkubasi pada inkubator kocok dengan agitasi 180 rpm, suhu 37°C sampai OD mencapai 0.6 – 0.8. Lalu 90 mL media LB-tet cair baru diinokulasi dengan 10 mL

seed culture. Tahap pengambilan dan pengukuran OD sel dihentikan setelah OD mencapai 0.6 – 0.8. Selanjutnya 10 mL inokulum diambil untuk proses produksi.

12

Penentuan Batas Atas dan Batas Bawah Konsentrasi Xilosa

Optimasi konsentrasi xilosa dilakukan karena ekspresi gen pac pada B. megaterium btpacBD1 rekombinan diatur oleh promotor xyl untuk dapat menghasilkan enzim PAc. Penggunaan konsentrasi xilosa yang terlalu tinggi dikhawatirkan dapat membuat membran sel bakteri pecah sehingga perlu ditentukan konsentrasi xilosa yang tepat untuk menghasilkan enzim PAc yang optimal tanpa merusak sel B. megaterium selama proses kultivasi.

Batas atas dan batas bawah konsentrasi xilosa (X1) yang digunakan adalah

0.3% dan 0.7%. Hasil penelitian Yang et al. (2006) menjelaskan bahwa penambahan xilosa terbaik adalah sebesar 0.5%. Komposisi media produksi per liter terdiri dari 12.36 g MOPS (pH 7), 1.65 g Trisin (pH 7), 0.11g MgCl2.6H2O,

0.05 g K2SO4, 0.01 g FeSO4.7H2O, 0.02 g MnCl2.4H2O, 2.92 g NaCl, 0.75 g KCl,

0.01 g NH4Cl, 0.27 g K2HPO4 dan 4 g glukosa yang dilarutkan dalam air mili-Q

(pH 7) dan disterilisasi di autoklaf pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit. Setelah steril lalu ditambahkan 0.1 mL trace element solution (10X), 0.1 mL

vitamin solution (10X) dan 10 mL untuk 6 grup as. amino solution (10X). Tetrasiklin (12.5 mg/mL) sebanyak 1% ditambahkan sebagai media seleksi. Komposisi trace element solution (10X) per 100 mL terdiri dari 3.708 mg (NH4)

6Mo7O24.4H2O, 24.73 mg H3BO3, 7.137 mg CoCl2 , 2.497 mg CuSO4, 15.832 mg

MnCl2 dan 2.875 mg ZnSO4 yang dilarutkan dalam air mili-Q (pH 7) dan

disterilisasi di autoklaf pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit. Komposisi vitamin solution (10X) per 100 mL terdiri dari 6 mg biotin, 20 mg niacin amida, 20 mg p-amino benzoat, 10 mg Ca-panthotenat, 100 mg pyridoxal/HCl 20 mg folacid, 50 mg riboflavin, 50 mg as.DL-6,8-thioctic dan 10 mg thiamin diklorida yang dilarutkan dalam air mili-Q (pH 7) dan disterilisasi syringe. Enam kelompok asam amino solution per liter terdiri dari 2.5 mg Gly dan 1.25 mg Ser (I), 2 mg Val, 1 mg Ile dan 0.5 mg Leu (II), 2.5 mg Ala (III), 0.4 mg Glu, 0.75 mg Gln, 2.5 mg Arg dan 1.25 mg Pro (IV), 1 mg His (V), serta 0.25 mg Asn, 0.25 mg Cys, 2.5 mg Lys, 1.25 mg Met, 1.25 mg Thr, 0.75 mg Asn (VI) yang dilarutkan dalam air mili-Q (pH 7) dan disterilisasi pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit.

Penentuan Batas Atas dan Batas Bawah Kadar CaCl2

Batas atas dan batas bawah konsentrasi CaCl2 (X2) yang digunakan adalah

3.5 mM dan 1.5 mM. Hasil penelitian Yang et al. (2006) menjelaskan bahwa penambahan 2.5 mM CaCl2 meningkatkan biomassa B. megaterium YYBm1

dengan aktivitas spesifik, 489.9 U/g CDW. Sedangkan penambahan 5 mM dapat mengganggu pertumbuhan biomassa dan aktivitas spesifik yaitu 287.3 U/g CDW. Rancangan untuk Optimasi Media

Setelah didapatkan batas atas dan batas bawah untuk konsentrasi xilosa (X1)

dan CaCl2 (X2) (Tabel 3). Nilai interval dimasukkan ke pengolahan data software Design Expert 9 (Stat Ease Inc, USA) dan diperoleh kombinasi lima tingkat konsentrasi xilosa (dengan rentang 0.13% s.d 0.87%) dengan lima tingkat konsentrasi CaCl2 (dengan rentang 0.64 mM s.d 4.36 mM) sebanyak 22 percobaan

13 Tabel 2. Rancangan percobaan Central Composite Design dengan dua faktor

Run X1: Xilosa X2: CaCl2 Xilosa (%) CaCl2 (mM)

1 1 -1 0.7 1.5

2 1 1 0.7 3.5

3 -1 1 0.3 3.5

4 -1 -1 0.3 1.5

5 -1 -1 0.3 1.5

6 0 0 0.5 2.5

7 0 0 0.5 2.5

8 -1 1 0.3 3.5

9 1 -1 0.7 1.5

10 1 1 0.7 3.5

11 1 -1 0.7 1.5

12 -1 1 0.3 3.5

13 -1 -1 0.3 1.5

14 1 1 0.7 3.5

15 0 0 0.5 2.5

16 - α 0 0.13 2.5

17 0 0 0.5 2.5

18 0 - α 0.5 0.64

19 α 0 0.87 2.5

20 0 Α 0.5 4.36

21 0 0 0.5 2.5

22 0 0 0.5 2.5

Dimana, -1 adalah batas bawah, 0 adalah titik tengah, 1 adalah batas atas dan α adalah starting point. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 500 mL dengan volume kerja 100 mL pada pada inkubator kocok dengan suhu 28°C agitasi 180 rpm selama 48 jam.

Tabel 3. Simbol faktor dan level yang digunakan pada Central Composite Design

Faktor Level

Simbol -1.861 -1 0 1 1.861

Xilosa X1 0.13 0.3 0.5 0.7 0.87

CaCl2 X2 0.64 1.5 2.5 3.5 4.36

Hasil percobaan diplotkan pada persamaan polinomial ordo dengan model: Y = ao+ a1X1 + a2X2– a11X12– a22X22 + a12X1X2

Dimana Y adalah respon yang muncul, X1 adalah konsentrasi xilosa (%) ,

X2 adalah konsentrasi CaCl2 (mM), ao adalah konstanta, a1, a2 adalah koefisien

pengaruh linier xilosa dan CaCl2, a12 adalah koefisien pengaruh interaksi xilosa

14

Produksi PAc Rekombinan Skala Bioreaktor

Kombinasi terbaik hasil analisa RSM akan digunakan untuk uji coba produksi PAc pada skala bioreaktor. Proses kultivasi dilakukan dengan sistem curah pada bioreaktor 10 Liter dengan volume produksi 5 Liter dengan penambahan inokulum 500 mL. Kultivasi dilakukan dengan suhu 28°C pada agitasi 150 rpm dan aerasi 1 vvm.

Penentuan Waktu Panen Enzim Terbaik

Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan waktu panen enzim terbaik. Sampel diambil setiap 6 jam selama 60 jam dan diuji aktivitasnya. Selanjutnya, proses produksi pada bioreaktor dilakukan berdasarkan waktu panen enzim kutivasi terbaik dengan aktivitas PAc tertinggi berdasarkan penelitian pendahuluan..

Proses Panen Ekstrak Enzim Kasar (EEK) PAc Rekombinan

Proses panen enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi kultur pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C (Rajendhran et al. 2003). Supernatan diambil sebagai EEK yang akan dianalisa aktivitas dengan metode Balasingham et al. (1972) dan kadar protein dengan metode Bradford (1976). Prosedur Analisa Kerapatan bakteri atau Optical Density (OD)

Analisa dilakukan setiap 6 jam waktu kultivasi dengan mengambil 1 mL kultur dan absorbansi diukur pada panjang gelombang 578 nm (Yang et al. 2006). Jika lebih dari 1, maka perlu diencerkan dengan media. Kurva pertumbuhan menunjukkan hubungan antara jumlah sel dan aktivitas enzim dengan waktu sehingga dapat diketahui kapan aktivitas enzim PAc tertinggi.

Prosedur Uji Aktivitas PAc

Analisa dilakukan menggunakan berbagai zat kimia yang bertujuan untuk mengetahui banyaknya enzim yang dihasilkan selama proses kultivasi melalui banyaknya Penisilin G (pen-G) yang telah terhidrolisis selama proses analisa. Subtrat dibuat dengan menimbang 200 mg pen-G dalam 1 mL buffer Na-fosfat 0.05M (pH 7) dan larutan stop PDAB 0.5% (acetic acid 20% + NaOH 50 mM + PDAB 0.5% dengan perbandingan 4:2:1). Selanjutnya dibuat kurva standar 6-APA dengan variasi konsentrasi : 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.06; 0.07; 0.08; 0.09 dan 0.1 ( g/mL). Variasi konsentrasi dibuat dengan menggunakan larutan standar 6-APA 125 g/mL. Masing-masing diinkubasi selama 5 menit dan ditambahkan 875 L larutan PDAB 0.5%. Lalu absorbansi diukur pada panjang gelombang 415 nm (Lampiran 4).

Uji aktivitas dilakukan dengan mengambil 100 L substrat pen-G dan ditambahkan 25 L sampel enzim. Campuran ini diinkubasi pada suhu 50°C selama 5 menit di thermomixer, lalu ditambahkan 875 L reagen PDAB 0.5% dan diinkubasi selama 1 menit 30 detik selanjutnya absorbansi diukur pada panjang gelombang 415 nm. Pengukuran blanko dilakukan dengan menginkubasi 25 L

15 enzim pada suhu 50°C selama 5 menit. Lalu ditambahkan 875 L reagen PDAB 0.5% dan diinkubasi selama 1 menit. Campuran ditambahkan 100 L substrat pen-G dan diinkubasi selama 1 menit. Lalu absorbansi diukur pada panjang gelombang 415 nm (Balasingham et al. 1972).

Hasil pembacaan selanjutnya dikonversikan ke dalam persamaan linear standar 6-APA dengan rumus:

Aktivitas enzim PAC (U/mL) = ([6-APA] x 1000) (BM x t x ve)

Dimana, [6-APA] adalah konsentrasi 6-APA yang dihasilkan, 1000 adalah faktor konversi dalam µmol, BM adalah berat molekul pen-G (216.25), t adalah waktu inkubasi pada suhu optimal (5 menit) dan Ve adalah volume ekstrak enzim kasar yang digunakan (25 µL = 0.025 mL).

Prosedur Analisa Kadar Protein

Analisa kadar protein dilakukan dengan menggunakan pereaksi Bradford dengan pengenceran 5 kali untuk mengetahui kadar protein pada enzim PAc dan media produksi. Kurva standar protein (Micro Assay) (Lampiran 5)dibuat dengan menganalisis absorbansi sampel yang berupa enzim murni dengan menimbang 2 mg Bovin Serum Albumin (BSA) yang dilarutkan dalam 10 mL mili-Q dengan variasi konsentrasiμ 0; 2.5; 5; 10; 15; 20 dan 25 ( g/mL). Selanjutnya, 800 L sampel ditambah 200 L pereaksi Bradford, divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm. Tahap diatas dilakukan untuk analisa kadar protein pada enzim PAc (duplo) dan blanko dengan mengganti sampel larutan BSA yang sudah didilusi. Pada enzim PAc sampel diganti dengan EEK, sedangkan pada blanko sampel diganti dengan media produksi (Bradford 1976).

Hasil absorbansi yang diperoleh dikonversikan ke dalam persamaan linear dari kurva standar BSA, kemudian besarnya absorbansi adalah sebanding dengan kadar protein dalam sampel.

Prosedur Penentuan Aktivitas Spesifik

Konsentrasi protein dan aktivitas PAc yang diperoleh digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim PAc. Aktivitas spesifik (U/mg) adalah hasil rasio aktivitas enzim (U/mL) dengan kadar protein (mg/mL).

Prosedur Analisa Bioinformatika Sinyal Peptida pada Gen btpac-bd1

Prosedur analisa bioinformatika dilakukan untuk mengetahui keberadaan sinyal peptida pada B. megaterium btpacBD1 (Petersen et al. 2011). Susunan basa nukleotida gen btpac-bd1 telah didepositkan pada Genbank dengan nomor akses ZP_04085306.1. Selanjutnya susunan basa nukleotida dianalisa menggunakan software SignalP: 4.1, portable version (Denmark) dan dapat diakses pada

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. Lalu, data hasil prediksi analisa sinyal peptida didapatkan.

16

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Pembuktian Keberadaan Gen btpac-bd1

Data hasil pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 disajikan pada Gambar 4, Gambar 5 dan Gambar 6.

Seleksi Mikroba Rekombinan dengan Marka Genetik

Seleksi mikroba rekombinan dilakukan dengan menginokulasi kultur koleksi B. megaterium btpacBD1 dalam LB-tet padat (media seleksi). Koloni-koloni tunggal terlihat pada cawan petri setelah diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Gambar 4). Koloni tunggal yang tumbuh diduga merupakan B. megaterium btpacBD1 yang tersisipi plasmid pMMbtpac-bd1 rekombinan yang mempunyai gen penyandi resisten terhadap antibiotik tertrasiklin.

Gambar 4. Koloni tunggal B. megaterium btpacBD1 pada media seleksi

Deteksi Plasmid Rekombinan pMMbtpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid dan PCR

Data visualisasi plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1 hasil ektraksi koloni tunggal B. megaterium btpacBD1 pada gel agarosa 1% ditunjukan dengan pita tunggal yang berukuran yang lebih besar dari 10 kpb dengan konformasi plasmid yang relaxed open circular (Gambar 5). Adanya pita tunggal DNA ini menunjukkan keberadaan plasmid pMMbtpac-bd1 sehingga dapat diuji PCR untuk mendeteksi keberadaan gen btpac-bd1. Data visualisasi produk hasil amplifikasi PCR pada gel agarosa 1%. menunjukkan adanya pita tunggal yang berukuran antara 2000 pb dan 3000 pb (Gambar 6). Adanya pita tunggal DNA ini

17 menunjukkan keberadaan gen btpac-bd1 sehingga kultur koleksi B. megaterium

btpacBD1 merupakan mikroba rekombinan yang telah terkonfirmasi sehingga dapat digunakan untuk ekspresi protein rekombinan dan optimasi komposisi media untuk produksi enzim PAc.

Gambar 5. Hasil visualisasi plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi koloni tunggal B. megaterium

btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol positif; 3: Kontrol negatif (air); 4: Plasmid pMMbtpac-bd1 hasil ekstraksi

Gambar 6. Hasil visualisasi gen btpac-bd1 hasil PCR dari plasmid hasil ekstraksi kultur B. megaterium

btpacBD1. 1: Marker 1 kb; 2: Kontrol negatif (air); 3: Kontrol positif; 4: Gen btpac-bd1 hasil PCR.

10000

6000 3000

2000

250

pb 1 2 3 4

3000

Relaxed open circular Supercoiled

Circular (single

strand)

18

Optimasi Media dengan metode Central Composite Design

Sebanyak 22 unit percobaan telah dilakukan. Aktivitas enzim PAc, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc adalah sebagai respon pada setiap percobaan disajikan pada Lampiran 6. Pada saat penelitian, sampel diambil dan diuji aktivitas enzim PAc, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc setiap 6 jam selama 48 jam kultivasi. Namun, hanya jam ke-48 yang memberikan model yang mewakili respon yang dapat digunakan untuk optimasi komposisi media produksi PAc rekombinan dari B. megaterium btpacBD1. Data hasil analisa model permukaan respon pada jam ke-48 disajikan pada Lampiran 7–11 dan Gambar 7 dan 8.

Respon: Aktivitas Enzim PAc

Sebelum uji aktivitas PAc rekombinan, dilakukan pengukuran kadar 6-APA untuk pembuatan kurva standar. Dari kurva standar 6-APA pada Lampiran 4 dan diperoleh persamaan matematika Y=0.459X+0.001 R2=0.991. Dari persamaan tersebut, maka nilai konsentrasi 6-APA dapat diketahui sehingga dapat dilakukan perhitungan sesuai dengan rumus aktivitas PAc.

Lampiran 7 menjelaskan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (nilai p <0.0001) pada tingkat kepercayaan 95%. Uji lanjut ketidakcocokan model (lack of fit) pada Lampiran 7 menunjukkan bahwa hanya model kuadratik yang secara tidak nyata menunjukkan ketidakcocokan (nilai p > 0.1142 dan R2 = 0.86 pada Lampiran 7.

Selanjutnya dilakukan analisa ANOVA terhadap model permukaan respon kuadratik (Lampiran 7). Hasil analisa kembali menjelaskan bahwa model kuadratik secara nyata (nilai p <0.0001) dapat menjelaskan data yang ada dengan uji lanjut ketidakcocokan model menunjukkan nilai p : 0.1142. Dengan demikian model kuadratik adalah model yang mewakili respon dan digunakan untuk optimasi komposisi media produksi PAc rekombinan dari B. megaterium.

Lampiran 7 (lanjutan) juga menjelaskan tentang perkiraan pengaruh setiap peubah dan interaksinya disertai dengan hasil uji beda nyata. Peubah yang mempunyai pengaruh nyata terhadap model pada tingkat kepercayaan 99% ditunjukkan dengan nilai p < 0.01. Dengan demikian model yang dapat menjelaskan data yang diperoleh adalah:

Y= 1.132 – 0.324 X12– 0.129 X22– 0.257 X1X2

Dimana Y adalah aktivitas PAc (U/mL), X1 adalah konsentrasi xilosa (%)

dan X2 adalah konsentrasi CaCl2 (mM). Persamaan diatas menunjukkan bahwa

xilosa dan CaCl2 mempunyai pengaruh yang nyata terhadap aktivitas enzim PAc

di dalam cairan kultivasi. Baik xilosa dan CaCl2 berpengaruh secara kuadratik.

Hasil ini menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl2 mempuyai hubungan langsung

19 Plot permukaan respon sebagai fungsi dari dua peubah akan lebih memudahkan untuk melihat pengaruh dari peubah-peubah tersebut mengingat model yang digunakan adalah kuadratik. Pengaruh antar variabel terhadap aktivitas enzim PAc disajikan pada Gambar 7.

Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Original Scale Aktivitas (U/ml)

Design points above predicted value

Design points below predicted value 1.8

0.027 X1 = A: xilosa X2 = B: CaCl2

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 0.5 1 1.5 2 A k ti v it a s ( U /m l)

A: xilosa (%)

B: CaCl2 (mM

Gambar 7. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level

variabel terkodekan terhadap aktivitas PAc

Respon: Kadar Protein

Berdasarkan hasil pengukuran kadar protein standar BSA (Bovine Serum Albumin), maka diperoleh kurva standar pada Lampiran 5 dan diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan matematika Y=0.018X+0.193 R2=0.995. Dari persamaan tersebut, maka kadar protein pada ekstrak enzim kasar dapat diketahui.

Lampiran 8 menjelaskan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor tidak memberikan pengaruh yang nyata (nilai p: 0.0191) pada tingkat kepercayaan 95% sehingga uji selanjutnya tidak perlu dilakukan.

Respon: Aktivitas Spesifik Enzim PAc

Lampiran 9 menjelaskaan bahwa hasil uji ANOVA terhadap model permukaan respon menunjukkan bahwa model kuadratik dan rancangan faktorial 2 faktor secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (p-value <0.0001) pada tingkat kepercayaan 95%.

Uji lanjut ketidakcocokan model (lack of fit) pada Lampiran 9 menunjukkan bahwa hanya model kuadratik yang secara tidak nyata menunjukkan ketidakcocokan (nilai p > 0.2688 dan R2 = 0.79 pada Lampiran 9 (lanjutan)). Selanjutnya dilakukan analisa ANOVA terhadap model permukaan respon

20

kuadratik. Hasil analisa kembali menjelaskan bahwa model kuadratik secara nyata (nilai p <0.0001) dapat menjelaskan data yang ada (Lampiran 9).

Lampiran 9 juga menjelaskan tentang peubah yang mempunyai pengaruh nyata terhadap model pada tingkat kepercayaan 99% ditunjukkan dengan nilai p < 0.01. Dengan demikian model yang dapat menjelaskan data yang diperoleh adalah:

Y= 11.191 – 3.368 X12– 1.519 X22– 2.025 X1X2

Dimana Y adalah aktivitas spesifik PAc (U/mg), X1 adalah konsentrasi

xilosa (%) dan X2 adalah konsentrasi CaCl2 (mM). Persamaan diatas menunjukkan

bahwa xilosa dan CaCl2 mempunyai pengaruh yang nyata terhadap aktivitas

enzim PAc secara kuadratik. Berikut adalah plot pengaruh antar variabel terhadap aktivitas spesifik enzim PAc (Gambar 8).

Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Original Scale Akt.Spesifik (U/mg)

Design points above predicted value

Design points below predicted value

178.022 1.95

X1 = A: xilosa X2 = B: CaCl2

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 50 100 150 200 A k t. S p e s if ik ( U /m g )

A: xilosa (%)

B: CaCl2 (mM

Gambar 8. Pengaruh xilosa dan CaCl2 dengan level

terkodekan terhadap aktivitas spesifik PAc

Optimasi menggunakan perangkat lunak Design Expert versi 9 dilakukan untuk mendapatkan komposisi media yang dapat menghasilkan enzim PAc dengan aktivitas dan aktivitas spesifik tertinggi. Pada komposisi media yang mengandung 0.49% xilosa dan 2.40 mM CaCl2, secara teoritis akan menghasilkan

aktivitas tertinggi 1.318 ± 0.406 U/mL dengan kadar protein 0.0101 ± 0.001 mg/mL dan aktivitas spesifik 130.669 ± 50.241 U/mg (Lampiran 10). Komposisi media hasil optimasi diverifikasi sebanyak 2 kali ulangan sebanyak 6 erlenmeyer untuk produksi enzim PAc dari B.megaterium. Verifikasi komposisi media optimal menghasilkan aktivitas enzim PAc 1.294 ± 0.171 U/mL dengan kadar protein 0.0102 ± 0.0003 mg/mL dan aktivitas spesifik 125.910 ± 13.309 U/mg (Lampiran 11).

21 Produksi Skala Bioreaktor

Penentuan Waktu Panen Enzim Terbaik

Data hasil penentuan waktu panen enzim terbaik (berupa plot data hasil pengukuran nilai absorbansi OD sel dan aktivitas PAc) yang diproduksi selama 60 jam dilakukan untuk mengetahui kapan waktu produksi enzim PAc dengan aktivitas tertinggi (Gambar 9 dan Lampiran 12).

Gambar 9. Kurva pertumbuhan B. megaterium

btpacBD1( ) dan aktivitas PAc ( ) dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi 150 rpm selama 60 jam.

Gambar 9 dan Lampiran 12 menjelaskan bahwa kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 dan aktivitas volumetrik (U/mL) ditentukan setiap 6 jam selama 60 jam. Fase eksponensial (log) terjadi antara jam 0 – 30 jam setelah kultivasi. Fase adaptasi (lag) tidak terdeteksi mungkin disebabkan oleh rentang waktu pengambilan sampel yang lebih panjang dari fase lag. Selanjutnya, fase stasioner terjadi antara jam 30 – 42 sebelum memasuki fase kematian, yaitu antara jam 48 – 60 waktu kultivasi. Aktivitas mulai terbentuk pada fase eksponensial (antara jam 18 – 42) dan mencapai aktivitas tertinggi pada fase kematian (jam ke-48) yaitu sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL). Selanjutnya, aktivitas PAc mengalami penurunan yang signifikan.

Berdasarkan aktivitas PAc tertinggi yang dihasilkan, jam ke-48 dipilih sebagai waktu terbaik untuk panen enzim PAc sehingga waktu kultivasi untuk proses produksi PAc selanjutnya dilakukan selama 48 jam.

Kurva pertumbuhan Bacillus megaterium btpacBD1

Data hasil pengukuran nilai absorbansi OD sel kemudian diterjemahkan dalam kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1 (Gambar 10). Gambar 10 menunjukkan bahwa kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1selama 48 jam menunjukkan pola kurva pertumbuhan yang relatif sama dengan Gambar 9

22

Gambar 10. Kurva pertumbuhan B. megaterium btpacBD1

Pengukuran Aktivitas, Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Enzim PAc pada Skala Bioreaktor

Data hasil analisa aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAc pada setiap waktu kultivasi disajikan pada Lampiran 13 dan Gambar 11 sampai Gambar 15. Data hasil analisa aktivitas enzim PAc selama 48 jam kultivasi disajikan pada Gambar 11.

Gambar 11. Grafik hubungan antara rerata aktivitas enzim PAc dengan waktu

Gambar 11 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa aktivitas PAc menunjukkan pola yang sama dengan Gambar 9. Aktivitas PAc meningkat pada jam ke-18, setelah itu antara jam 18 – 42 aktivitas PAc relatif konstan (secara statistik tidak menunjukkan perbedaan berarti) dan aktivitas PAc tertinggi terjadi pada jam ke-48 yaitu sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL yang berarti bahwa 1 mL enzim ekstrak kasar (EEK) dapat mendegradasi senyawa penisilin G menjadi 6-APA sebesar 2.0687 ± 0.0820 µmol per menit pada kondisi suhu 50°C.

23

Gambar 12. Grafik hubungan antara rerata kadar protein dengan waktu

Gambar 12 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa kadar protein meningkat secara signifikan pada jam ke-30. Selanjutnya, kadar protein tertinggi didapatkan pada jam ke-48 yaitu sebesar 0.0078 ± 0.0008 mg/mL.

Gambar 13. Grafik hubungan antara rerata aktivitas spesifik enzim PAc dengan waktu

Gambar 13 dan Lampiran 13 menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim PAc tertinggi terjadi pada jam ke-18 yaitu sebesar 1260.521 ± 27.5711 U/mg. Artinya, tiap 1 mg protein dalam EEK memiliki aktivitas sebesar 1260.521 ± 27.5711 Unit. Setelah itu, aktivitas spesifik PAc mengalami penurunan yang signifikan setelah jam ke-18.

Menurut Syamsuriputera (1995), kurva aktivitas PAc berhubungan dengan kurva pertumbuhan Berikut adalah kurva yang menunjukkan hubungan antara OD sel dengan aktivitas volumetrik PAc (Gambar 14A), kadar protein (Gambar 14B) dan aktivitas spesifik PAc (Gambar 14C).

24

Gambar 14. Kurva pertumbuhan B. megaterium

btpacBD1( ) dan aktivitas PAc ( ) (A) kadar protein ( ) (B) dan aktivitas spesifik PAc ( ) (C) dalam media optimal pada 28°C dengan aerasi 1.0 vvm dan agitasi 150 rpm selama 48 jam.

25 Gambar 14A dan 14B menunjukkan bahwa aktivitas enzim PAc dan kadar protein mulai terbentuk pada fase log dan meningkat secara signifikan pada fase kematian (jam ke-48) yaitu masing-masing sebesar 2.0687 ± 0.0820 U/mL dan 0.0078 ± 0.0008 mg/mL. Gambar 15C menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim PAc tertinggi terjadi pada fase log yaitu sebesar 1260.521 ± 27.5711 U/mg dan pada fase selanjutnya mengalami penurunan yang signifikan.

Analisa Bioinformatika Sinyal Peptida pada Gen btpac-bd1

Data hasil prediksi analisa bioinformatika menggunakan software signalP

version 4.1 pada gen btpac-bd1 disajikan pada Gambar 15.

Gambar 15. Hasil prediksi sinyal peptida pada gen btpac-bd1

Gambar 15 menjelaskan bahwa keberadaan sinyal peptida yang berkaitan dengan proses sekresi enzim PAc pada B. megaterium btpacBD1 tidak terdeteksi atau sangat lemah.

Pembahasan

Deteksi Plasmid Rekombinan pMMbtpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid dan PCR

PAc rekombinan diperoleh dengan cara kultivasi menggunakan isolat

Bacillus megaterium btpacBD1. Untuk memastikan keberadaan plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1 di dalam B. megaterium btpacBD1 rekombinan, maka perlu dilakukan uji keberadaan plasmid rekombinan tersebut dengan ekstraksi plasmid dan PCR. Media seleksi dalam penelitian ini yaitu media LB yang sudah ditambahkan tetrasiklin (tc) 1% dari total volume (LB cair-tet).

26

Tetrasiklin (tc) berfungsi sebagai antibiotik yang digunakan untuk menyeleksi bakteri rekombinan sehingga hanya B. megaterium btpacBD1 rekombinan yang dapat tumbuh dalam media ini karena plasmid pMM1525 yang digunakan sebagai vektor mempunyai gen penyandi resisten tc. Oleh karena itu, penambahan tc pada media dilakukan agar dapat menyeleksi bakteri rekombinan yang membawa plasmid, mempertahankan sifat resistensi dan mencegah kontaminasi, sehingga bakteri yang tumbuh dalam media produksi adalah bakteri yang mengandung plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1.

Sebelum melakukan ekstraksi plasmid rekombinan, perlu dilakukan seleksi mikroba B. megaterium btpacBD1 menggunakan marka genetik di dalam media LB padat-tet. Koloni tunggal yang tumbuh diduga membawa plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1. Koloni tunggal akan diproses untuk mengekstraksi plasmid rekombinan. Ekstraksi plasmid dilakukan karena pita tunggal tidak tervisualisasi saat proses PCR koloni dilakukan.

Koloni tunggal diinokulasi pada media LB cair-tet pada inkubator kocok pada suhu 37°C agitasi 70 rpm selama 20-24 jam hingga OD sel mencapai 0.6-0.8 pada panjang gelombang 578 nm (fase eksponensial). Selanjutnya, kultur disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan endapan diproses untuk mengekstraksi plasmid rekombinan.

Ekstraksi plasmid dilakukan dengan metode lisis alkali. Metode ini digunakan karena sel B. megaterium tidak dapat lisis jika dilakukan tanpa penambahan lisozim, tidak seperti sel E coli yang dapat lisis hanya dengan pemanasan di dalam buffer (Laemmli 1970).

Sel dipanen pada fase eksponensial karena sel bakteri relatif masih muda, sehingga memudahkan pemecahan membran sel. Lisis sel bakteri dilakukan secara kimia menggunakan lisozim yang merupakan suatu senyawa yang dapat merusak protein tanpa merusak molekul DNA maupun RNA. Proses lisis sel ini dipercepat dengan penambahan NaOH-SDS, yang akan menghilangkan molekul lipid sehingga membran sel perlahan akan pecah.

Sebagian besar protein dan RNA tidak larut sehingga penambahan larutan PCI diharapkan dapat mengekstrak protein dan memurnikan DNA. DNA dipisahkan dari debris sel dan protein melalui ekstraksi menggunakan larutan CI. Kloroform akan mendenaturasi protein dan melarutkan lipid serta memisahkan fase organik dan fase air dan pemisahan kedua fase ini disempurnakan oleh isoamilalkohol. Presipitasi protein akan terjadi tetapi DNA dan RNA tetap berada dalam fase air. Selanjutnya RNase akan mendegradasi molekul RNA (Susanti dan Ariani 2004).

Keberhasilan reaksi PCR dapat dipengaruhi oleh konsentrasi komponen seperti enzim DNA polimerase, DNA cetakan, primer, dNTP, buffer, serta kondisi reaksi PCR (Sambrook dan Russell 2001). Komposisi campuran PCR yang digunakan terdiri dari 0.5 µL primer xyl3 10 M, 0.5 µL primer xyl4 10 M, 5.0

µL 10x KAPA Buffer (B) with Mg2+, 0.5 µL dNTP, 0.2 µL KAPA Tag polymerase, 2,0 µL hasil ekstraksi sel dan 41.3 µL ddH2O steril.

Cetakan DNA (DNA template) yang digunakan dalam proses PCR adalah plasmid rekombinan hasil ektraksi yang mengandung gen pac. Menurut Sambrook dan Russell (2001), cetakan DNA yang digunakan dalam proses PCR dapat berupa bagian dari DNA genomik, fragmen DNA, plasmid rekombinan atau sampel lain yang mengandung DNA.

27 Primer yang digunakan dalam reaksi PCR yaitu primer forward (xyl3) dan primer reverse (xyl4). Kedua primer ini merupakan primer spesifik gen pac

sehingga hanya plasmid yang mengandung gen pac saja yang dapat teramplifikasi dan menghasilkan fragmen DNA. Primer akan memotong rantai DNA antara 18-24 nukleotida yang dirancang berpasangan dengan rantai DNA template.

Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) digunakan sebagai sumber nukleotida dalam reaksi PCR. KAPA Taq polymerase memiliki keaktifan dalam suhu tinggi, sehingga penambahan enzim tidak perlu dilakukan pada setiap siklus. Komponen lain seperti 10x buffer with Mg2+ berperan sebagai buffer untuk mempertahankan kestabilan pH. Sedangkan Mg2+ berperan sebagai kofaktor DNA

Taq polymerase. Air ddH2O steril ditambahkan sebagai pelarut.

Siklus PCR yang digunakan dalam penelitian adalah sebanyak 30 siklus. Menurut Yuwono (2006), umumnya PCR dilakukan dengan mengulang siklus reaksi sebanyak 20–30 siklus. Jika siklus terlalu banyak, konsentrasi produk yang tidak spesifik akan meningkat, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.

Tahapan dalam PCR terdiri dari pra denaturasi, denaturasi, annealing dan

extension (polimerisasi). Pra denaturasi dilakukan diawal reaksi pada suhu 95°C selama 5 menit untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifkan DNA Taq Polymerase. Tahap denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit akan membuka untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA. Hal ini disebabkan oleh tingginya suhu denaturasi sehingga ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen terputus. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan.

Selanjutnya annealing yaitu saat penempelan primer pada cetakan DNA berjalan pada 61°C selama 35 detik. Suhu annealing mempengaruhi kespesifikan penempelan primer. Pada tahap ini, primer xyl3 dan primer xyl4 akan menuju daerah yang spesifik yang memiliki komplemen dengan primer dan ikatan hidrogen akan terbentuk.

DNA Taq polymerase akan membentuk ikatan hidrogen yang sangat kuat dan tidak akan terputus apabila terjadi reaksi polimerisasi. Nilai temperature of melting (Tm) adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA mengalami denaturasi (Yuwono 2006). Primer untuk PCR yaitu xyl3 dan xyl4 memiliki nilai Tm masing-masing 61°C dan 60.4°C. Proses extension pada suhu 720C selama 2 menit. Primer yang telah menempel akan mengalami pemanjangan oleh DNA polimerase sehingga menghasilkan dua pasang untai ganda.

Pita tunggal hasil elektroforesis dihasilkan karena etidium bromida (EtBr) akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan EtBr akan memendarkan sinar ultraviolet, jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA. Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan fragmen DNA gen btpac-bd1 hasil amplifikasi PCR berukuran antara 2000 bp dan 3000 bp (Gambar 4). Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Leonita (2013) dan Putri (2013) yang menyatakan bahwa pita tunggal hasil PCR koloni B. megaterium

BD1 dan CC1 rekombinan menunjukkan gen btpac-bd1 dan gen btpac-cc1 adalah fragmen DNA berukuran diatas 2000 pb. Sekuen nukleotida dari 2397 p bfragmen DNA penyandi penisilin asilase B. thuringiensis BD1 telah didepositkan pada

51 Lampiran 10. Hasil optimalisasi media produksi enzim PAC oleh B. megaterium

btpacBD1

Faktor Name Level Low Level High Level Std. Dev. Coding

X1 xilosa 0.49 0.30 0.70 0.000 Actual

X2 CaCl2 2.40 1.50 3.50 0.000 Actual

Solusi hasil permukaan respon

Predicted Predicted

Respon Mean Median Observed Std Dev

Aktivitas 1.31873 1.28705 - 0.406313

Protein 0.0101374 0.0100882 - 0.00141004

52

Lampiran 11. Data hasil analisa verifikasi komposisi media optimal Aktivitas

Ulang- An

Blanko (B) Sampel (S)

S S-B nilai x Akt STDEV B1 B2 _{B S1 S2 S3} (U/mL)

1 0,082 0,082 0,082 0,102 0,1 0,095 0,099 0,017 0,035 1,290 2 0,083 0,083 0,083 0,104 0,105 0,097 0,102 0,019 0,039 1,451 3 0,081 0,081 0,081 0,102 0,095 0,106 0,101 0,020 0,041 1,531 4 0,066 0,062 0,064 0,075 0,085 0,076 0,079 0,015 0,030 1,101 5 0,066 0,062 0,064 0,077 0,085 0,08 0,081 0,017 0,034 1,263 6 0,064 0,066 0,065 0,076 0,079 0,085 0,080 0,015 0,031 1,128

Rerata 1,294 0,171

Kadar Protein

Ulangan Absorbansi S S-B Nilai x STDEV

S1 S2 S3 ( g/mL) (mg/mL)

blanko 0,203 0,204 0,202 0,203

1 0,567 0,601 0,572 0,580 0,377 10,111 0,010111 2 0,601 0,583 0,6 0,595 0,392 10,926 0,010926 3 0,597 0,577 0,585 0,586 0,383 10,463 0,010463 4 0,573 0,587 0,572 0,577 0,374 9,963 0,009963 5 0,58 0,569 0,587 0,579 0,376 10,037 0,010037 6 0,587 0,574 0,575 0,579 0,376 10,037 0,010037

Rerata 0,010256 0,000373

Aktivitas Spesifik

Ulangan Aktivitas Spesifik STDEV

(U/ g) (U/mg)

1 0,128 127,539

2 0,133 132,781

3 0,146 146,359

4 0,111 110,559

5 0,126 125,803

6 0,112 112,420

53 Lampiran 12. Data hasil analisa OD sel, aktivitas, kadar protein dan aktivitas

spesifik enzim PAC selama 60 jam pada skala bioreaktor

Waktu OD sel : 578 nm

Aktivitas (U/mL)

0 0,0960 0

6 1,7850 0

12 2,8550 0

18 3,8750 1,075

24 4,4850 0,967

30 5,0990 0,551

36 5,2850 1,142

42 5,4450 1,075

48 4,1910 2,163

54 4,081 0,497

54

Lampiran 13. Data hasil analisa OD sel, aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik enzim PAC selama 48 jam pada skala bioreaktor

Waktu (jam)

OD Sel : 548 nm

Rerata STDEV Ulangan I Ulangan II Ulangan III

0 0,0960 0,0900 0,0890 0,0917 0,0038

6 1,7850 1,7570 1,8560 1,7993 0,0510

12 2,8550 3,0170 3,3560 3,0760 0,2557

18 3,8750 3,6570 3,9460 3,8260 0,1506

24 4,4850 4,2570 4,4200 4,3873 0,1175

30 5,0990 5,0490 5,0440 5,0640 0,0304

36 5,2850 5,0970 5,2480 5,2100 0,0996

42 5,4450 5,4090 5,4160 5,4233 0,0191

48 4,0760 4,0130 4,0860 4,0583 0,0396

Aktivitas Waktu

(jam)

Aktivitas (U/mL)

Rerata STDEV

Ulangan I Ulangan II Ulangan III

0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0

18 1,0750 1,0480 1,0750 1,0660 0,0156

24 0,9670 1,0210 0,8060 0,9313 0,1118

30 0,9540 1,2090 1,1690 1,1107 0,1371

36 1,1420 1,0480 1,0480 1,0793 0,0543

42 1,0750 1,3030 1,2220 1,2000 0,1156

55 Lampiran 12 (Lanjutan)

Kadar Protein

Waktu (jam)

Kadar Protein (mg/mL)

Rerata STDEV Ulangan I Ulangan II Ulangan III

0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0

18 0,0008 0,0008 0,0009 0,0008 0,0000

24 0,0025 0,0023 0,0002 0,0017 0,0013

30 0,0069 0,0067 0,0062 0,0066 0,0004

36 0,0065 0,0066 0,0065 0,0065 0,0000

42 0,0068 0,0074 0,0067 0,0069 0,0004

48 0,0086 0,0076 0,0071 0,0078 0,0008

Aktivitas Spesifik

Waktu (jam)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Rerata STDEV Ulangan I Ulangan II Ulangan III

0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0

18 1289,5590 1257,3200 1234,6840 1260,5210 27,5772 24 386,8680 448,2000 402,9870 412,6850 31,7953 30 138,4460 170,4540 188,9450 165,9483 25,5492 36 175,1620 181,3440 161,1950 172,5670 10,3221 42 158,5520 176,7880 182,8510 172,7303 12,6475 48 250,6130 265,8540 282,6140 266,3603 16,0065

56

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Depok pada tanggal 24 Agustus 1989 dari Ayah Rustam Effendi dan Ibu Maryani Eko Safitri. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung pada tahun 2007 dan lulus pada tahun 2011. Penulis telah menjadi asisten praktikum beberapa mata kuliah (Biologi Umum, Botani Umum, Parasitologi, Taksonomi Hewan I dan Taksonomi Hewan II) sejak tahun 2008. Pada tahun 2010, penulis melakukan kerja praktik dan magang di Loka LitBang P2B2, Departemen Kesehatan, Ciamis, Pangandaran. Penulis lulus dengan predikat dengan pujian (cum laude) dan merupakan Wisudawan Terbaik 2 tingkat Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Unila Periode 1 2011/2012. Pada tahun 2012, penulis melanjutkan program magister di Program Studi Bioteknologi angkatan 2011 Genap pada Sekolah Pascasarjana IPB. Tesis ini akan dipublikasi pada Jurnal Microbiology Indonesia yang terakreditasi DIKTI.