Konsentrasi standar : 400 ppm
Volume injeksi
: 10-20 µL
Temperatur kolom : Suhu ruang Standar yang digunakan adalah glukosa dan xilosa yang berkualifikasi
proanalisa.
5. Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil EPS
Isolat-isolat bakteri asam laktat diperoleh dari penapisan bakteri asam laktat dari susu kambing segar. Sampel diencerkan dengan seri
pengenceran 10 sampai 10
-6
kali lalu sebanyak 100 µL secara aseptis ditebar ke atas media MRS agar difco. Media diinkubasi selama 18-24
jam pada suhu 37°C. Koloni yang diperoleh dimurnikan untuk mendapatkan galur murni. Seleksi dilakukan pada media MRS yang
diperkaya dengan susu skim 90 gL, isolat diambil secara aseptis menggunakan tusuk gigi steril dan ditumbuhkan kepermukaan media.
Setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C koloni yang tumbuh diseleksi berdasarkan fenotip yang ditunjukkan. Isolat-isolat yang
menunjukkan aktivitas positif menghasilkan EPS secara fenotip tampak ropy
dan mucoid. Isolat-isolat yang menunjukkan aktivitas positif menghasilkan EPS diinokulasikan ke dalam 10 mL media MRS cair
Kimmel and Robert, 1988 dan diinkubasi secara aerobik selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Setelah masa inkubasi sel dipisahkan dengan cara
disentrifugasi, 1 mL filratnya ditambahkan 2 mL etanol yang telah didinginkan van Geel-schutten et al., 1998. Isolat yang positif
menghasilkan EPS akan menunjukkan terbentuknya lendir setelah
penambahan etanol dingin pada filtrat. Secara kualitatif EPS yang terbentuk ditimbang setelah dikeringkan menggunakan freeze drying.
Isolat yang menghasilkan EPS terbanyak akan digunakan untuk memproduksi EPS pada tahap selanjutnya.
6. Optimasi Produksi EPS Skala Laboratorium
Media hasil fermentasi jerami padi oleh Actinomycetes dikarakterisasi kandungan gula, jenis gula, dan pHnya. Optimasi yang akan dilakukan
adalah pengaruh pH awal media dengan memberikan pH awal fermentasi 4,0;4,5;5,0;5,5; 6,0; dan 6,5 yang diatur menggunakan buffer asetat.
Sebanyak 100 mL media diinokulasikan dengan 1 mL inokulum bakteri asam laktat 18-24 jam kultur yang telah dipersiapkan sebelumnya lalu
diinkubasi secara aerobik pada suhu 37°C selama 48 jam. Pertumbuhan sel diketahui dengan melakukan sub-sampling setiap 2 jam mulai jam ke 6
inkubasi hingga diperoleh jumlah sel yang mulai menurun fase kematian. Pertumbuhan sel dilihat menggunakan spektrofotometer dengan mengukur
OD pada λ 610 nm. Hasil yang diperoleh diplotkan ke dalam bentuk grafik untuk mengetahui fase pertumbuhan sel dikaitkan dengan waktu
inkubasi. EPS yang dihasilkan selama fermentasi diukur dengan melakukan sub-sampling pada mulai jam ke 12 setiap 4 jam sekali.
Sebanyak 2 mL media hasil sub-sampling disentrifugasi lalu filtratnya ditambahkan 4 mL etanol yang telah didinginkan lalu disimpan pada suhu
dingin. EPS akan terlihat seperti lapisan gel, kemudian dikeringkan menggunakan freeze drying. Secara kuntitatif EPS ditimbang lalu hasil
yang diperoleh diplotkan kedalam bentuk grafik untuk mengetahui pola
produksi EPS oleh bakteri asam laktat pada media. Sehingga diperoleh informasi pH optimum.
7. Isolasi dan Pemurnian EPS
Isolasi dan pemurnian EPS mengikuti prosedur yang dilakukan oleh Garicia dan Marshall 1991. Sel bakteri asam laktat dipisahkan dengan
cara sentrifugasi, filtrat yang diperoleh ditambahkan 13 volume 40 asam trikloroasetik TCA untuk mengendapkan protein, lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary
evaporator , EPS diperoleh dengan menambahkan 3x volume etanol dingin
atau aseton dingin dan dibiarkan selama satu malam pada suhu dingin. EPS akan mengendap dan dipisahkan dengan filtratnya lalu dikeringkan
dengan menggunakan freeze drying. Secara kuantitatif berat EPS yang diperoleh ditimbang untuk mengetahui perolehan rendemen hasil produksi.
8. Karakterisasi EPS
a. Pengukuran Berat Molekul Berdasarkan Metode Viskometri
Viskositas EPS diukur menggunakan viskometer Ostwald. Sebanyak 0,1 g EPS dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 0,5M,
kemudian diambil sebanyak 5 mL dan dimasukkan ke dalam viskometer Ostwald untuk ditentukan waktu alirnya. Pengukuran
dilakukan dengan konsentrasi berbeda dan waktu alir dibaca dengan tiga kali pengulangan Tarbojevich and Cosani, 1996.
Viskositas relatif :
� =
≈
ɳ ɳ
Viskositas spesifik :
ɳ
�
= ɳ − 1
Viskositas kinematika : ɳ
���
= × �
���
Keterangan: k
kin
= koefisien kinematika ostwald 9,671 x 10
-3
cSt per detik t
= waktu alir larutan sampel detik t
= waktu alir pelarut detik
Berat molekul EPS diukur berdasarkan viskositas intrinsik ɳ.
Data yang diperoleh dipetakan pada grafik ɳ
sp
C terhadap C. Viskositas intrinsik adalah titik pada grafik yang menunjukkan
nilai C = 0. Berat molekul ditentukan berdasarkan persamaan Mark-Houwink Hwang et al., 1997 yaitu:
� =
��
�
Keterangan: [
ɳ] = viskositas intrinsik
k = konstanta pelarut k = 3,5 × 10
-4
mLg α
= konstanta α = 0,76
M = berat molekul
b. Analisis Kandungan Gula Pereduksi Total
Sebanyak 40,0 mg EPS ditambahkan ke dalam 1 mL air suling dalam tabung ulir kaca lalu ditambahkan 2 N H
2
SO
4
sampai larut dan dipanaskan pada suhu 100°C selama 2 jam. Analisis total gula
pereduksi dilakukan menggunakan metode Dubois Dubois et al., 1956.
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Kondisi fermentasi yang optimum untuk EPS adalah dengan menggunakan
media fermentasi yang mengandung larutan sukrosa 5, dengan waktu inkubasi 48 jam, pada pH 6, dan menghasilkan EPS sebesar 2,51 mgmL.
2. Karakterisasi EPS yang dihasilkan:
a. Pengukuran viskositas EPS menghasilkan viskositas intrinsik [ɳ] sebesar
2,117 mLg dan berat molekul EPS yang didapat sebesar 94592,99 gmol. b.
Pengukuran kandungan gula total dengan metode Dubois, menghasilkan kadar glukosa 32,64 mgmL untuk isolat LbK-19.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh, maka untuk penelitian
selanjutnya disarankan untuk mengoptimasikan waktu inkubasi isolat LbK-19 agar mendapatkan waktu yang lebih optimum. Mempelajari lebih lanjut
karakterisasi EPS yang dihasilkan secara kimia dan mempelajari tentang kemungkinan pemanfaatan EPS lebih lanjut.
DAFTAR PUSTAKA
Anindyawati, T. 2010. Potensi selulase dalam mendegradasi lignoselulosa limbah pertanian untuk pupuk organik. Berita Selulosa. 45:70-77.
Beg, Q.K., M. Kapoor, K. Mahajan, G.S. Hoondal. 2000. Microbial Xylanases and their industrial applications: a review. Appl. Microbiol. Biothecnol.
56:326-338. Bradford, Marion M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
Bhaskar, P.V. and N.B. Bhosle. 2005. Microbial extracelluler polymeric substances in marine biogeochemical process. Current Sci. 88:45-53.
Clark, J. 2007. Kromarografi Cair Kinerja Tinggi KCKT. http:www.Chem-
is-try.org diakses pada tanggal 04 Maret 2013. 10.07 WIB.
De Vuyst, L., F. De Vin, F. Vaningelgem, and B. Degeest. 2001. Recent developments in the biosynthesis and applications of
heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Int.Dairy J. 11:687-708. Duboc, P., B. Mollet. 2001. Application of exopolysaccharides in the dairy
industry. Int. Dairy J. 11:759-768. Dubois, M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, and F. Smith. 1956.
Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Anal.Chem.
28:350-356. Ekawati, I. 2008. Dekomposisi Komponen Lignoselulosa Jerami Padi oleh
Beberapa Isolat Bakteri. J. Natural vol.7.
Ertesvåg, H., S. Valla. 1998. Biosynthesis and applications of alginates. Polym.
Degrad. Stab. 59:85-91.
Fialho, A.M., L.M. Moreira, A.T. Granja, A.O. Popescu, K. Hoffmann, I. Sá- Correia. 2008. Occurence, production, and applications of gellan: current
state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotehcnol. 79:132-140.
Frengova, G.I., E.D. Simova, D.M. Besshkova, and Z.I. Simo. 2002. Exopolysaccharides prodeced by Lactic acid bacteria of Kefir Grains. Z
Naturforsh. 57c:805-810. Garcia-Garibay, M., M. Marshall. 1991. Polymer production by Lactobacillus
delbrueckii bulgaris. J. Appl. Bacteriol. 70:325-328.
Gritter, R.J., Bobbit J.M., dan Schwarting A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. Terbitan kedua. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Bandung.
ITB. Hal 108-109, 160-179. Gummadi, S.N., K. Kumar. 2005. Production of extracelluler wat
er insoluble β- 1,3-glucan curdlan from Bacillus sp. SN07. Biotechnol. Bioprocess Eng.
10:546-551. Howard, R.L., E. Abotsi, E.L. Jansen van Rensburg, S. Howard. 2003.
Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afr. J. Biotechnol. 2:602-619.
Hwang, J.K., S.P. Hong, and C.T. Kim. 1997. Effect of molecular weight and NaCl concentration on dilute solution properties of chitosan. J. Food
Sci.Nutr. 2:1-5.
Jin, Y., H. Zhang, Y. Yin, K. Nishinari. 2006. Conformation of curdlan as
observed by tapping mode atomic force microscopy. Colloid Polym. Sci. 284:1371-1377.
Johnson, E. L. and R. Stevenson. 1978 . Basic liquid chromatography. Varian. California
Kimmel, S. A. and R.F.Roberts. 1998. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus RR. Int. J. Food Microbiol. 40:87
–92.
Kwon, K.K., H.S. Lee, Jung Sung-Young, J.H. Yim, J.H. Lee, H.K. Lee. 2002. Isolation and identification of biofilm-forming marine bacteria on glass
surfaces in Dae-Ho Dike, korea. The J. of Microbiol. 4:260-266. Lapasin, R.,and S. Pricl. 1999. Rheology of industrial polysaccharides: Theory
and applications. Aspen Publisher: New York. USA. pp.1-118. Llamas, I., J.A. Mata, R. Tallon, P. Philippe Bressollier, M.C. Urdaci, E. Quesada,
V. Béjar. 2010. Characterization of the exopolysaccharide produced by Salpiger mucosus
A3T, a halophilic species belonging to the Alphaproteobacteria
, isolated on the Spanish Mediterranean Seaboard. Mar. Drugs
. 8:2240-2251.
Malik, A., D.M. Ariesanti, A. Nurfactiyani, A. Yanuar. 2008. Skrining gen glukosiltransferase gtf dari bakteri asam laktat penghasil
eksopolisakarida. Makara Sains. 12:1-6. Micheli, L., D. Uccelletti, C. Palleschi, V. Crescenzi. 1999. Isolation and
characterisation of a ropy Lactobacillus strain producing the exopolysaccharide kefiran. Appl.Environ. Microbiol. 53:69-74.
Miller, G.I. 1959. Dinitrosalicylic assay. Analytical Chemistry. 31:426-428. Mozzi, F., G. Rollán, G.S. de Giori, and G.F. de Valdez. 2006. Effect of
galactose and glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in Lactobacillus casei CRL87.
J.Appl.Microbiol . 91:160-167.
Moechtar. 1990. Farmasi Fisik. UGM-Press. Yogyakarta. Noermala, S.R., Purbowatiningrum, R.S., Nies, S.M. 2013. Aktivitas Fusarium
oxysporum dalam Menghidrolisis Eceng Gondok Eichhornia crassipes
dengan variasi Temperatur. 1: 220-225. Parthasarathi, S., K. Saravanakuamr, R. Baskaran, T.R. Kubendran. 2011. A
volumetric and viscosity study for the binary mixtures of dimethylsulfoxide with benzen, ethyl benzene, chlorobenzene and
bromobenzene at temperatures of 303.15, 308.15 and 313.15 K and a Pressure of 0,1MPa. Int. J. of Sci. And Technol. Vol. 1. 2:96-101.
Raymond, R. 2009. “Adipic Acid”, Handbook of Pharmaceutical Excipients.
pp.11-12. Rehm, B. 2009. Microbial exopolisaccharides: Variety and potential
applicatoins. In Microbial production of biopolymers and polymer precursors: applications and perspectives.
Caister Academic: Norfolk, UK. pp. 229-254.
Rohaeti, E., R. Heryanto, M. Rafi, A. Wahyuningrum, dan L.K. Darusman. 2011. Prediksi kadar flavonoid total tempuyung Sonchus arvensis L.
Menggunakan kombinasi spektroskopi IR dengan Regresi kuadrat terkecil parsial. J. Kimia. 5:101-108.
Ruas-Mediedo, P. And C.G. de Los reyes-Gavilan. 2005. Invited review: methods for the screening, isolation, and characterization of
exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 88:843- 856.
Satria, H., Nurhasanah, F. Martasih. 2010. Aktivitas selulase isolat Actinomycetes
terpilih pada fermentasi padat jerami padi. Proseeding SATEK III Universitas Lampung.
