Asosiasi Polimorfisme Gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan Diabetes Mellitus Tipe 2 pada Populasi Masyarakat Bali

1

ASOSIASI POLIMORFISME GEN KCNJ11 DAN ABCC8
DENGAN DIABETES MELLITUS TIPE 2 PADA
POPULASI MASYARAKAT BALI

AGENG WIYATNO

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

2

ASOSIASI POLIMORFISME GEN KCNJ11 DAN ABCC8
DENGAN DIABETES MELLITUS TIPE 2 PADA
POPULASI MASYARAKAT BALI

AGENG WIYATNO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

3

Judul Skripsi : Asosiasi Polimorfisme Gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan
Diabetes Mellitus Tipe 2 pada Populasi Masyarakat Bali
Nama
: Ageng Wiyatno
NRP
: G84070047

Disetujui
Komisi pembimbing

Dr. drh. Safarina G. Malik, M.S.
Anggota

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus :

4

PRAKATA

Assalamualaikum wr.wb
Penulis panjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT. Atas rahmat-Nya
penelitian ini telah selesai. Salawat dan salam mudah-mudahan selalu tercurah
kepada junjungan Nabi Besar Muhammad SAW. Laporan hasil penelitian ini
berjudul “Asosiasi Polimorfisme Gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan Diabetes
Mellitus Tipe 2 pada Populasi Masyarakat Bali”. Penelitian telah dilakukan di
Lembaga Biologi Molekuler Eijkman pada bulan Maret hingga bulan September
2011, dibimbing oleh Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. dan Dr. drh. Safarina G.
Malik, M.S.
Penulis sampaikan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
dan Dr. drh. Safarina G. Malik, M.S. atas kesediaan untuk membimbing penulis.
Terima kasih untuk Prof. dr. Sangkot Marzuki, AM., PhD., DSc. dan Prof. dr.
Herawati Sudoyo, PhD. yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk
melakukan penelitian di Lembaga Eijkman. Tidak lupa terima kasih kepada
Sukma Oktavianthi, Clarissa Asha Febinia, Tri Cita Hutama, Pradiptajati Kusuma,
Yumni Khairina Ghassani dan Leli Nurfitriyani yang membantu penulis dalam
melakukan penelitian ini. Terima kasih untuk Bapak, Ibu dan adik-adikku yang
terus memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis. Mudah-mudahan
penelitian ini berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, Oktober 2011

Ageng Wiyatno

5

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix
DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 2
Protein Integral KATP channels dan Mekanisme Sekresi Insulin ..................... 2
Analisis SNP Menggunakan Metode PCR-RFLP ............................................ 3
Gen KCNJ11 Penyandi Kir6.2 ........................................................................ 4
Gen ABCC8 Penyandi SUR1 ........................................................................... 4
Desa dan Penduduk Nusa Ceningan, Legian, Penglipuran dan Pedawa Bali .. 5
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5
Bahan dan Alat ................................................................................................. 5

Metode Penelitian ............................................................................................ 6
HASIL DAN PEMBAHASAN......... ...................................................................... 9
Karakteristik Klinis dan Sebaran Sampel Secara Umum ................................ 9
Asosiasi Jenis Kelamin dengan kriteria DMT2 ............................................... 9
Asosiasi Kelompok Usia Tertentu dengan kriteria DMT2 ............................ 10
Deteksi SNP E23K Gen KCNJ11 dan SNP A1369S Gen ABCC8 ................ 12
Asosiasi SNP E23K Gen KCNJ11 dan SNP A1369S Gen ABCC8 dengan
kriteria DMT2 ................................................................................................ 13
Haplotipe Gen KCNJ11 dan ABCC8 ............................................................. 15
Asosiasi Haplotipe Gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan kriteria DMT2 .......... 15
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 16
Simpulan ........................................................................................................ 16
Saran .............................................................................................................. 16
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 16
LAMPIRAN .......................................................................................................... 17

6

DAFTAR GAMBAR
Halaman

1 Struktur KATP channel pada membran sel
2 Mekanisme sekresi insulin pada sel

pankreas .......................................... 2

pankreas ................................................... 3

3 Letak empat desa terpilih di Bali ......................................................................... 5
4 Pengaturan suhu dan waktu yang digunakan pada reaksi PCR gen

KCNJ11

dan ABCC8 ........................................................................................................... 8
5 Asosiasi jenis kelamin dengan kriteria DMT2 berdasarkan konsentrasi

FPG

pada masing-masing desa..................................................................................... 9
6 Representasi deteksi polimorfisme SNP E23K gen dan A1369S gen ABCC8

yang dilakukan dengan teknik PCR-RFLP ........................................................ 12

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kriteria individu berdasarkan konsentrasi FPG ................................................... 1

2 Karakteristik klinis dan sebaran sampel secara umum ...................................... 10
3 Asosiasi kelompok usia dan jenis kelamin dengan kriteria DMT2 pada masingmasing desa ........................................................................................................ 11
4 Nilai Frekuensi Alel Minor (MAF) gen KCNJ11 pada masing-masing
populasi .............................................................................................................. 12
5 Nilai Frekuensi Alel Minor (MAF) gen ABCC8 pada masing-masing populasi
............................................................................................................................ 13
6 Asosiasi SNP E23K dan SNP A1369S dengan DMT2 di tiap populasi ............ 14
7 Asosiasi haplotipe gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan kriteria DMT2 ................ 15

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Alur penelitian ..................................................................................................... 21

2 Tahap-tahap perancangan primer ....................................................................... 22

3 Primer untuk deteksi polimorfisme SNP E23K dan A1369S ............................ 23
4 Contoh script perhitungan statistik .................................................................... 24

7

ABSTRAK
AGENG WIYATNO. Asosiasi Polimorfisme Gen KCNJ11 dan ABCC8 dengan
Diabetes Mellitus Tipe 2 pada Populasi Masyarakat Bali. Dibimbing oleh I
MADE ARTIKA dan SAFARINA GOLFIANI MALIK.
Diabetes mellitus Tipe 2 (DMT2) merupakan penyakit yang disebabkan
oleh banyak faktor. Kombinasi faktor genetik, kurangnya aktivitas fisik dan
asupan nutrisi yang berlebih merupakan penyebab utama timbulnya penyakit ini.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) seperti SNP E23K pada gen KCNJ11
dan SNP A1369S pada gen ABCC8 diketahui dapat meningkatkan resiko DMT2.
Kedua gen tersebut memiliki fungsi yang komplementer dalam membentuk KATP
channel yang berperan penting dalam mekanisme sekresi insulin. Penelitian ini
bertujuan untuk menganalisis prevalensi penyakit DMT2 di Bali dan asosiasinya
dengan keberadaan SNP E23K dan A1369S. Analisis terhadap 184 sampel dari
empat desa di Bali (Nusa Ceningan, Legian, Penglipuran dan Pedawa) dilakukan
dengan metode potong lintang (cross sectional), kemudian sampel dipilih dengan

mencocokkan jenis kelamin dan usianya (matched). Analisis asosiasi antara
konsentrasi gula darah puasa (Fasting Plasma Glucose; FPG), letak geografis dan
genetik telah dilakukan. Metode yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan
SNP adalah Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphisms (PCR-RFLP). Prevalensi DMT2 pada total populasi terpilih di
Bali adalah 4,3%, sedangkan prevalensi hiperglikemia sedang adalah 10,9%.
Berdasarkan tingginya prevalensi hiperglikemia sedang, dapat diperkirakan bahwa
prevalensi DMT2 di Bali akan meningkat dua kali lipat dalam kurun waktu 10-15
tahun mendatang. Prevalensi hiperglikemia sedang berasosiasi dengan kelompok
usia 51-65 tahun dengan frekuensi 25% (p=0,007). Prevalensi DMT2 tidak
berasosiasi dengan jenis kelamin (p=0,607). Walaupun tidak signifikan, populasi
yang terletak di daerah pesisir pantai (Nusa Ceningan dan Legian) cenderung
memiliki konsentrasi FPG yang relatif lebih beragam (96,0±29,4 mg/dL)
dibandingkan populasi yang terletak di dataran tinggi (Penglipuran dan
Pedawa)(98,2±13,8 mg/dL). Pada penelitian ini, nilai MAF SNP E23K (26,3%)
mirip dengan MAF SNP A1369S (26,9%). Polimorfisme E23K dan A1369S
beserta kombinasi haplotipe yang terbentuk dari kedua SNPs tersebut tidak
menunjukkan asosiasi yang signifikan dengan DMT2 pada populasi total yang
dianalisis.

1

PENDAHULUAN
Diabetes mellitus Tipe 2 (DMT2)
merupakan penyakit endemik di dunia (Riedel
et al. 2004). Pada tahun 2010, penderita
DMT2 di dunia telah mencapai 300 juta jiwa
dengan peningkatan sebanyak 7 juta jiwa per
tahun (International Diabetes Federation
/IDF 2011). Badan Kesehatan Dunia (WHO)
memperkirakan penderita DMT2 akan
meningkat dua kali lipat antara tahun 2005
hingga 2030. Lebih dari 80% penderita DMT2
terdapat di negara berkembang dengan angka
pertumbuhan yang lebih tinggi daripada di
negara maju (WHO 2011).
Indonesia merupakan negara dengan
jumlah penderita DMT2 terbanyak keempat
setelah India, Cina dan Amerika Serikat
(WHO 2011). Berdasarkan hasil Riset

Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007,
proporsi penyebab kematian akibat DMT2
pada usia 45-54 tahun di daerah perkotaan
menduduki peringkat ke-2, yaitu 14,7% dan di
daerah pedesaan menduduki peringkat ke-6,
yaitu 5,8% dari seluruh penyebab kematian di
Indonesia (Depkes 2010, Mihardja et al.
2009).
Diabetes mellitus Tipe 2 merupakan
penyakit kronis yang hingga saat ini belum
dapat diobati. Penyakit ini muncul akibat
gangguan mekanisme pengaturan glukosa
darah berupa ketidakmampuan pankreas
memproduksi insulin atau sel target tidak
mampu merespon insulin yang diproduksi
(IDF 2011). Manifestasi klinis DMT2
dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan
genetik (O’Rahilly et al. 2005; Gloyn dan
McCarthy 2001). Kurangnya aktivitas fisik
dan tingginya kadar nutrisi yang dikonsumsi
adalah pencetus utama DMT2 (McCarthy
2010; Misra dan Khurana 2008). Secara
genetik, DMT2 dipengaruhi oleh interaksi
kompleks beberapa gen yang mengatur
metabolisme energi di dalam tubuh.
Polimorfisme yang terjadi pada banyak gen
penyandi komponen sel pengatur metabolisme
glukosa berimplikasi secara signifikan
terhadap timbulnya DMT2 (Riedel 2004).
Genome Wide Association Study (GWAS)
melaporkan lebih dari 20 gen sebagai faktor
resiko penyakit DMT2, diantaranya ABCC8,
KCNJ11, PPARγ, UCP2, TCF7L2, CDKAL1,
CDKN2A/B, IGF2BP2, HHEX/IDE, FTO, dan
SLC30A8 (Jablonski et al. 2010; Pirie et al.
2010; Zhao et al. 2010; Feng et al. 2008).
Mutasi pada gen-gen tersebut berpengaruh
terhadap aktivitas komponen sel yang
berperan dalam metabolisme glukosa. Salah

satu komponen sel yang penting dalam
metabolisme glukosa adalah KATP channel
pada sel
pankreas. Protein integral ini
berfungsi mengatur sekresi insulin (Nichols
dan Koster 2002). Kerusakan pada protein ini
dapat mengakibatkan hiperinsulinemia dan
hiperglikemia. Protein integral KATP channel
disandi oleh dua gen, yaitu KCNJ11 yang
menyandi subdomain Kir6.2 dan ABCC8 yang
menyandi subdomain SUR1 (Florez et al.
2004; Schwanstecher et al. 2002). Studi
genetika pada berbagai populasi menunjukkan
bahwa kedua gen tersebut berasosiasi dengan
DMT2 (Florez et al. 2004; Gloyn et al. 2004;
Nielsen et al. 2003; Sakura et al. 1996).
Analisis genetik dibutuhkan untuk
mengetahui keterlibatan latar belakang
genetik sebagai faktor resiko penyakit DMT2
dalam merancang strategi pencegahan,
penanganan dan pengobatan DMT2. Analisis
genetik juga membuka jalan bagi terciptanya
metode pengobatan yang spesifik terhadap
pasien dan klasifikasi subtipe penyakit yang
lebih baik (Vejrazkova dan Bendlova 2005).
Salah satu kriteria diagnosis diabetes
mellitus yakni berdasarkan konsentrasi
glukosa darah puasa (Fasting Plasma
Glucose/FPG) (Tabel 1). Pada kondisi normal,
konsentrasi FPG berada di bawah 110 mg/dL.
Penderita diabetes akan memiliki konsentrasi
FPG di atas 126 mg/dL setelah berpuasa
selama 8 jam. Individu dengan konsentrasi
FPG diantara 110-126 mg/dL perlu berhatihati karena termasuk dalam kriteria
hiperglikemia sedang (WHO-IDF 2006).
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui
prevalensi DMT2 pada populasi empat desa
terpilih di Bali, yaitu populasi Nusa Ceningan,
Legian, Penglipuran dan Pedawa. Penelitian
ini juga bertujuan menganalisis asosiasi
polimorfisme E23K pada gen KCNJ11 dan
polimorfisme A1369S pada gen ABCC8
dengan DMT2 berdasarkan keberadaan Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Tujuan
selanjutnya dari penelitian ini adalah
menganalisis haplotipe yang terbentuk dari
kedua gen tersebut dan asosiasinya dengan
DMT2.
Tabel

1

Kriteria individu berdasarkan
konsentrasi FPG.
Konsentrasi FPG
Kelompok
(mg/dL)
Normal
< 110
Hiperglikemia sedang
110-126
Diabetes mellitus
>126
Sumber : WHO-IDF 2006:5.

2

Hipotesis penelitian ini adalah prevalensi
penyakit DMT2 pada populasi empat desa di
Bali, yaitu Nusa Ceningan, Pedawa,
Penglipuran dan Legian mirip satu sama lain
karena latar belakang genetik yang relatif
homogen. Nilai prevalensi yang diperoleh
berasosiasi dengan polimorfisme E23K pada
gen KCNJ11 dan A1369S pada gen ABCC8
sebagai penyandi subdomain KATP channel.
DMT2 di keempat desa berasosiasi dengan
haplotipe tertentu yang dibentuk oleh
polimorfisme kedua gen tersebut karena
fungsi kedua gen berkaitan erat satu sama
lain. Penelitian ini bermanfaat dalam
merancang
upaya
penanganan
dan
pencegahan DMT2 di masa depan, khususnya
di daerah Bali.

TINJAUAN PUSTAKA
Protein Integral KATP channel dan
Mekanisme Sekresi Insulin
Protein integral KATP channel merupakan
protein kanal yang terletak pada sel jantung,
sel pankreas, sel syaraf, jaringan otot halus
dan ginjal (Minami 2004). Protein ini
memiliki fungsi yang spesifik pada tiap
jaringan. KATP channel berperan sebagai
penghubung antara keadaan metabolik dengan
keseimbangan elektrik sel. KATP channel
merupakan protein heterooktamer yang
bersifat uniport terletak di membran sel.
Protein ini terdiri atas subunit potassium
inwardly rectifying channel (Kir) dan subunit

Sulfonylurea Receptor (SUR) seperti yang
terlihat pada Gambar 1 (Inagaki et al. 1995).
Protein integral KATP channel berperan
penting
dalam
berbagai
mekanisme
biokimiawi, diantaranya sekresi hormon,
penghantaran sinyal neuron, respon sel otot
halus dan perlindungan sel jantung dan otak
terhadap iskemia (Ashcroft et al. 1998). KATP
channel pada sel pankreas berperan dalam
mengatur
jumlah
insulin.
Adenosin
Triphosphat (ATP) yang dihasilkan dari
metabolisme glukosa akan berikatan dengan
reseptor yang terdapat pada subunit Kir6.2
menyebabkan penutupan channel dan terjadi
depolarisasi membran plasma. Terjadinya
depolarisasi
mengaktifkan
pembukaan
Voltage Dependent Calcium Channel (VDCC)
yang menyebabkan masuknya Ca2+ melalui
membran sel. Peningkatan konsentrasi Ca2+ di
dalam sel akan memicu sekresi granulagranula insulin ke aliran darah.
Produksi insulin akan memicu respon
reseptor insulin pada sel target untuk
meningkatkan penyerapan glukosa darah
(Gong 2001). Sebaliknya, pada saat tidak ada
ATP yang tersedia, protein channel ini akan
memompa K+ keluar sel sehingga terjadi
hiperpolarisasi. Pada keadaan tersebut,
penyerapan glukosa berjalan lambat sehingga
dapat melindungi sel dari kerusakan akibat
kurangnya energi seperti yang terjadi pada
iskemik otak dan jantung (Fischer et al. 2008).
Mekanisme sekresi insulin dapat diamati pada
Gambar 2.

Gambar 1 Struktur KATP channel pada membran sel pankreas.
(A) Letak KATP channel pada membran sel dengan beberapa senyawa aktivator dan
inhibitornya; (B) dan (C) KATP channel merupakan protein herterooktamer yang terdiri atas dua
jenis subunit, yaitu Kir6.2 dan SUR1 (Inagaki et al. 1995).

3

Gambar 2 Mekanisme sekresi insulin pada sel pankreas.
Glukosa yang masuk ke dalam sel dipecah menghasilkan ATP yang akan berikatan dengan KATP channel. Akibatnya, KATP channel menutup dan menyebabkan depolarisasi membran. Depolarisasi
membran menyebabkan Voltage Dependent Calcium Channel (VDCC) menjadi aktif dan
memompa Ca2+ ke dalam sel sehingga memicu sekresi granula-granula insulin (Gong 2001).
Kerja KATP channel dikendalikan oleh
perbandingan ATP/ADP dan konsentrasi MgADP di dalam sel (Wasada 2002). Protein
KATP channel pada sel pankreas terdiri atas
delapan buah subunit yang dapat dibagi
menjadi dua jenis, yaitu Kir6.2 yang berperan
sebagai kanal selektif K+ dan SUR1 yang
berperan sebagai pengatur kerja protein
channel (Sakamoto et al. 2007). Subunit
SUR1 merupakan komponen Sulfonylurea
receptor (SUR) yang menyebabkan protein
integral KATP channel dapat dikendalikan
dengan penambahan sulfonylurea (contohnya:
tolbutamida dan glibenklamida) (Hansen et al.
1998). Protein-protein subunit KATP channel
(Kir6.2 dan SUR1) disandi oleh gen KCNJ11
dan ABCC8 (Aguilar-Bryan dan Bryan 1999).
Keberadaan polimorfisme pada kedua gen
dapat mempengaruhi aktivitas KATP channel.
Polimorfisme
tersebut
berupa
Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs) yang dapat
dianalisis
dengan
berbagai
metode,
diantaranya dengan menggunakan metode
Polymerase
Chain
Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphisms (PCRRFLP) (Yokes MB et al. 2001).

Analisis SNPs Menggunakan Metode
PCR-RFLP
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
adalah perbedaan satu basa pada urutan
nukleotida tertentu yang muncul secara
signifikan (lebih dari 1%) pada populasi (Ke
et al. 2008). Polimorfisme tersebut dapat
muncul pada daerah ekson maupun intron
dengan frekuensi 1/100 basa hingga 1/300
basa (Human Genome Project Information
2011). SNPs yang muncul di daerah ekson
dapat mempengaruhi protein yang disandi
oleh gen sehingga mengakibatkan perubahan
karakteristik protein yang disandinya.
Perubahan karakteristik ini dilaporkan
berkaitan dengan berbagai penyakit.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan metode sintesis asam nukleat
secara in vitro untuk mengamplifikasi segmen
DNA
secara
spesifik
berdasarkan
pengulangan siklus termal. Tahap-tahap yang
terjadi pada proses PCR yaitu, denaturasi,
annealing dan ekstensi. Pada tahap denaturasi,
terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi
satu utas DNA. Pada tahap annealing primer
kemudian menempel pada masing-masing
utas DNA. Dengan bantuan enzim Taq

4

polimerase, DNA akan tersusun di sepanjang
utas tunggal sehingga membentuk DNA utas
ganda baru (Sambrook et al. 2001).
Restriction
Fragment
Length
Polymorphisms (RFLP) adalah teknik analisis
DNA untuk membedakan variasi yang
terdapat pada sekuen-sekuen homolog. Prinsip
metode ini adalah pemotongan DNA menjadi
beberapa bagian oleh enzim restriksi. Letak
situs pemotongan enzim restriksi bersifat
spesifik terhadap urutan basa nukleotida
tertentu yang disebut palindrom. Potonganpotongan DNA akan terpisah ketika
dielektroforesis berdasarkan ukurannya. Hasil
visualisasi potongan-potongan DNA tersebut
berupa pita-pita DNA yang dapat diukur
panjangnya menggunakan marka DNA
(Sambrook et al. 2001).
Perbedaan basa pada SNPs menentukan
urutan nukleotida yang dapat dikenali oleh
enzim restriksi. Jika urutan basa membentuk
urutan yang sama dengan situs pengenalan
enzim restriksi tertentu, maka nukleotida
tersebut akan dipotong oleh enzim restriksi
tersebut. Sebaliknya, jika tidak sesuai dengan
situs pengenalannya, maka urutan basa
tersebut tidak akan dipotong. Akibatnya
visualisasi dengan elektroforesis dua jenis alel
yang berbeda akan menghasilkan pita dengan
ukuran yang berbeda (Sambrook et al. 2001).
Gen KCNJ11 Penyandi Kir6.2
Salah satu gen yang banyak dilaporkan
berasosiasi dengan DMT2 adalah gen
penyandi potassium inwardly rectifying
channel (KCNJ11). Gen ini terletak di
kromosom 11p.15.1. dengan panjang 4.083 bp
dari urutan basa ke 17.406.795 hingga
17.410.878, menyandi 390 asam amino
dengan ukuran protein sebesar 43.541 Da.
Gen ini menyandi Kir6.2, yaitu subdomain
pada protein integral KATP channel sel
pankreas yang berfungsi sebagai membran
selektif K+ (Vejrazkova dan Bendlova 2005).
Salah satu SNPs yang ditemukan pada gen
ini adalah polimorfisme E23K (rs5219). Pada
polimorfisme tersebut terjadi perubahan basa
adenin menjadi guanin di nukleotida ke 1222
yang menyebabkan perubahan asam amino
asam glutamat (E) (asam amino negatif)
menjadi lisin (K) (asam amino positif) pada
kodon ke 23. Perubahan tersebut terjadi di
ujung sitosolik N-terminal Kir6.2 yang
menyebabkan penurunan afinitas KATP
channel terhadap ATP sehingga channel
terbuka lebih lama dan tidak terjadi
depolarisasi membran. Akibatnya, VDCC
tidak aktif dan ion kalsium (Ca2+) tidak dapat

masuk ke dalam sel. Tidak adanya kalsium
sebagai pemicu sekresi granula insulin
menyebabkan gangguan sekresi insulin
(Riedel et al. 2004, Schwantecher et al. 2002).
Gen ABCC8 Penyandi SUR1
Gen ABCC8 merupakan anggota dari
subfamili protein ATP Binding Cassette yang
memiliki ukuran DNA sepanjang 4.980 basa
dari urutan basa ke 17.414.431 hingga
17.498.448 menyandi 1.581 asam amino
dengan ukuran 176.992 Da. Pada gen ini
ditemukan sekitar 150 SNPs yang telah
dianalisis di berbagai populasi (Campbell et
al. 2003). Salah satu SNPs yang terbentuk
pada gen ABCC8 adalah SNP A1369S
(rs757110). Polimorfisme tersebut mengubah
basa timin menjadi guanin yang terletak pada
nukleotida ke 4321. Perubahan asam amino
yang terjadi adalah serin (S) yang bersifat
polar menjadi alanin (A) yang bersifat non
polar pada kodon 1369 (Feng et al. 2008).
Perubahan tersebut menyebabkan penurunan
afinitas SUR1 terhadap Magnesium Adenosin
Diphosphat (MgADP) (Hansen et al. 1998).
Meskipun ada penelitian menunjukkan bahwa
SNP A1369S tidak berasosiasi dengan DMT2
(Sakamoto et al. 2007), namun SNP A1369S
dilaporkan memiliki asosiasi yang kuat
dengan SNP E23K pada gen KCNJ11 dengan
nilai OR= 1,17 (p=0,003) >90% (Florez et al.
2004). Beberapa penelitian melaporkan bahwa
pada populasi Kaukasia polimorfisme pada
SUR1 berasosiasi dengan neonatal diabetes
dan penyakit jantung (Lefer et al. 2009;
Giurgea et al 2006; Hansen et al 1997).
Protein subunit yang disandi oleh gen
ABCC8 adalah SUR1yang berfungsi mengatur
kinerja KATP channel, dikendalikan oleh
keberadaan MgADP yang akan meningkatkan
aktivitas KATP channel. Ikatan antara MgADP
dengan subunit SUR1 menyebabkan K+
terpompa keluar sel dan menurunkan jumlah
produksi Ca2+ sehingga mengurangi sekresi
insulin (Campbell 2003). Sebaliknya, senyawa
sulfonylurea (contohnya: tolbutamida dan
glibenklamida)
dan
nonsulfonylurea
(contohnya nateglinida dan repaglinida) dapat
mengaktifkan SUR1 melalui pembentukan
ikatan dengan reseptor sulfonylurea. Ikatan
tersebut menyebabkan protein KATP channel
aktif sehingga terjadi depolarisasi membran
yang akan meningkatkan sekresi insulin
(Bryan et al. 2004). Hingga saat ini, senyawa
sulfonylurea dan nonsulfonylurea merupakan
obat yang digunakan dalam penanganan
diabetes (Kristiansen et al. 2010).

5

Desa dan Penduduk Nusa Ceningan,
Legian, Penglipuran dan Pedawa Bali
Bali merupakan provinsi yang terletak di
sebelah selatan Indonesia, tepatnya di 8°3'40"8°50'48" Lintang Selatan dan 114°25'53"115°42'40" Bujur Timur. Provinsi Bali terbagi
menjadi 9 kabupaten dan 55 kecamatan.
Berdasarkan relif dan topografi, bagian utara
Bali terdiri atas gunung-gunung dan dataran
tinggi, sedangkan bagian selatan berupa
dataran rendah yang dialiri sungai-sungai dan
pulau-pulau kecil. Sekitar 92,3% penduduk
Bali memeluk agama Hindu yang membuat
penduduk Bali cenderung menikah dengan
orang sesama Bali. Oleh karena itu, diduga
bahwa populasi Bali cenderung bersifat
homogen secara genetik. Namun, khusus
untuk daerah pesisir, lebih besar kemungkinan
untuk terpapar pengaruh genetik lain karena
letaknya yang di pesisir.
Nusa Ceningan, Legian, Pedawa dan
Penglipuran merupakan desa yang terletak di
Provinsi Bali, Indonesia (Gambar 3). Keempat
desa ini memiliki karakteristik yang berbeda
dari segi topografi maupun kebudayaannya
(Pemerintah Provinsi Bali 2010). Nusa
Ceningan adalah sebuah pulau kecil yang
terletak di daerah selatan Bali di Kabupaten
Klungkung. Mayoritas penduduk Nusa
Ceningan berprofesi sebagai nelayan, petani
rumput laut dan pedagang. Masyarakat Desa
Nusa Ceningan lebih terbuka terhadap turis
karena Nusa Ceningan terletak dekat dengan
tempat wisata Bali. Namun, dampak dari
turisme terhadap gaya hidup masyarakat Nusa
Ceningan belum banyak diketahui.

Desa Legian terletak di Kecamatan Kuta,
Kabupaten Badung, Bali. Desa Legian
merupakan desa yang terletak di pesisir pantai
sebelah barat daya Pulau Bali, terletak dekat
dengan daerah wisata Pantai Kuta. Penduduk
di Desa Legian mayoritas berprofesi sebagai
pedagang dan buruh. Desa ini berkembang
menjadi salah satu tujuan wisata yang cukup
diminati oleh turis. Dampak turisme terhadap
gaya hidup masyarakat Legian sangat terlihat,
karena masyarakat di sini telah terpapar
westernisasi selama setidaknya 20 tahun
(Malik et al. 2011).
Berbeda dengan Nusa Ceningan dan
Legian, Penglipuran dan Pedawa merupakan
desa yang terletak jauh dari pantai.
Penglipuran merupakan desa yang terletak di
bagian tengah Pulau Bali, Kecamatan Kubu,
Kabupaten Bangli, Bali. Desa ini terletak di
kaki Gunung Batur yaitu sekitar 500-700
meter di atas permukaan laut. Penduduk
Penglipuran mayoritas berprofesi sebagai
petani, hal ini terlihat dari topografi Desa
Penglipuran yang berupa subak/sawah
berundak-undak.
Desa
Penglipuran
merupakan salah satu tujuan wisata di Bali
karena letaknya yang dekat dengan Denpasar
(Murni 2009).
Pedawa terletak di Kecamatan Banjar,
Kabupaten Buleleng Bali. Desa tersebut
terletak di dataran tinggi dan letaknya jauh
dari tempat wisata. Berbeda dengan penduduk
di tiga desa lainnya, penduduk di populasi
Pedawa cenderung terisolasi dari kehidupan
modern dan turisme. Mayoritas penduduk di
Desa Pedawa berprofesi sebagai petani dan
buruh. Potensi pertanian di desa ini sangat
baik. Hal ini terlihat dari organisasi desa yang
berkembang pesat berupa subak. Kebudayaan
di Desa Pedawa masih terus dijaga dan
dilestarikan (Pemerintah Kabupaten Buleleng
2009).

BAHAN DAN METODE

Gambar 3 Letak empat desa terpilih di Bali
Pedawa dan Penglipuran berada di dataran
tinggi, sedangkan Legian dan Nusa Ceningan
berada di pesisir pantai.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini terbagi menjadi kelompok bahan untuk
tahap isolasi DNA, PCR, RFLP dan
elektroforesis. Bahan-bahan untuk tahap
isolasi DNA terbagi menjadi dua, yaitu untuk
isolasi DNA dari darah dan isolasi DNA dari
Guthrie Cards. Bahan-bahan untuk isolasi
DNA dari darah adalah: larutan pelisis sel
darah merah (NH4Cl [Merck, France]; EDTA
[BDH, Canada]; KHCO3 [Merck, France]);
larutan pelisis sel darah putih (Tris-HCL
[Invitrogen, USA], EDTA [BDH, Canada],

6

dan SDS [Sigma, USA]; enzim RNase
(5mg/µL) [Qiagen, Germany]; ammonium
asetat 5 M; isopropanol [Malinckrodt, USA];
etanol 70% [Malinckrodt, USA]; dan buffer
Tris-EDTA yang mengandung Tris-HCL 10
mM pH 7,5 [Invitrogen, USA], EDTA 1 mM
[BDH, Canada]. Bahan yang digunakan untuk
isolasi darah dari Guthrie Cards adalah
larutan PBS (Phosphate Buffer Saline) yang
terdiri atas NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
[Merck, France] yang dilarutkan ke dalam
ddH2O, saponin 5% dan larutan Chelex 20%
dibuat dari Chelex 100% [Bio-Rad, USA].
Bahan-bahan untuk teknik PCR terdiri
atas: PCR buffer (Tris-HCL 10 mM
[Invitrogen, USA] dan KCl 50 mM [BDH,
Canada]); 1,5 mM MgCl2 [Merck, France];
campuran dNTP 10 mM (dATP, dGTP, dCTP,
dan dTTP) [Invitrogen, USA]; masing-masing
primer forward dan reverse SNPs rs5219 dan
SNPs rs727110 sebanyak 4 pmol/µL, [1st
Base Singapore]; 1,25 unit enzim Taq DNA
polimerase [Gibco-BRL, USA].
Bahan-bahan tahap RFLP adalah ultrapure
ddH2O, enzim BanII 5u/µL, enzim MwOI
5u/µL, NEB buffer 3 dan NEB buffer 4
(terdiri atas 50 mM NaCl; 10 mM Tris –HCl;
10 mM MgCl2; dan 1 mM dithiothreitol pH
7,9); 100 ug/mL BSA pH 7,4 [New England
Biolabs, USA]. Bahan untuk elektroforesis
adalah: bubuk agarosa [Seakem LE Agar,
USA]; etidium bromida (EtBr) 10 mg/mL
[Sigma, USA]; buffer Tris-borat EDTA (TBE)
1x (terdiri atas Tris [Invitrogen, USA]; asam
borat [Merck, France]; dan EDTA [BDH,
Canada]); loading buffer 6x (terdiri atas
bromofenol biru 0,25% [Merck, France]; dan
sukrosa 40% (b/v) [Merck, France]).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian
ini adalah vorteks [Thermolyne 37600, USA];
mesin sentrifugasi [Eppendorf 5415C dan
Sorvall RT 6000D, Germany]; neraca digital
[Sartorius AC 121S, Germany]; inkubator
waterbath
[Forma
Scientific,
USA];
spektrofotometer
[Nanodrop
ND-1000
V3.5.2., UK]; mesin thermal cycler
[GeneAmpR PCR System 9700, USA];
thermomixer Eppendorf 1.5 mL; aparatus
elektroforesis wide-mini sub cellR GT [BioRad, USA]; sumber arus listrik [BioRad,USA]; lemari es [National dan Forma
Scientific, USA]; tabung mikrosentrifus(0,2;
0,5, dan 1,5 mL) [Molecular Bio Product,
CA]; gelas ukur (25 mL dan 250 mL) [Duran,
Germany]; labu Erlenmeyer 250 mL [Duran,
Germany]; tabung sentrifugasi (15 mL dan 10
mL) [Falcon, USA]; mikropipet [Eppendorf
dan Finpippett, Germany].

Metode
Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah manusia diambil dari empat
desa di Bali, yaitu Desa Nusa Ceningan,
Legian,
Penglipuran
dan
Pedawa
menggunakan metode potong lintang (crosssectional), yaitu hanya satu kali pengambilan
sampel. Sampel yang diambil dari Desa Nusa
Ceningan, Pedawa dan Penglipuran berupa
sampel darah utuh, sedangkan sampel dari
Desa Legian berupa darah yang diteteskan
pada permukaan Guthrie Cards dan
didiamkan hingga mengering. Pengambilan
sampel dilakukan oleh dokter dan peneliti dari
RS Sanglah/Fakultas Kedokteran Udayana
dan Lembaga Eijkman dengan persetujuan
relawan di populasi Bali. Pengambilan sampel
telah mendapatkan izin dari Komisi Etik
Fakultas Kedokteran Universitas Udayana dan
Komisi Etik Riset Lembaga Eijkman (Malik
et al. 2011).
Pengambilan sampel dilakukan untuk
mengetahui karakteristik dan sebaran sampel
secara umum sehingga asosiasi antara
karakteristik sampel dengan kriteria DMT2
dapat dianalisis. Beberapa karakteristik klinis
diambil dari tiap relawan, yaitu: jenis kelamin,
usia dan konsentrasi glukosa puasa relawan
sebagai parameter DMT2. Sebanyak 46
sampel dipilih dari tiap desa dengan jenis
kelamin dan usia yang dicocokkan (matched).
Sampel-sampel
tersebut
dikelompokkan
menjadi kelompok usia 65 tahun.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini
adalah sampel DNA yang diisolasi dari darah
manusia berusia di atas 25 tahun. Sebanyak 2
mL darah diisolasi dari pembuluh darah
perifer relawan kemudian disimpan pada suhu
4°C hingga tahap isolasi DNA dilakukan,
sedangkan untuk sampel Desa Legian, darah
diteteskan di permukaan Guthrie Cards dan
dibiarkan mengering. Sampel tersebut
dimasukkan ke dalam amplop pada suhu
ruang hingga proses isolasi DNA dilakukan.
Perancangan Primer dan Pemilihan Enzim
Restriksi
Primer yang digunakan pada penelitian ini
terdiri atas dua pasang primer, satu pasang
untuk mendeteksi SNP E23K pada gen
KCNJ11 dan satu pasang lainnya untuk
mendeteksi SNP A1369S pada gen ABCC8.
Primer untuk mendeteksi polimorfisme E23K
diperoleh dari literatur (Hansen et al. 2005;
Nielsen et al. 2003), sedangkan primer untuk
mendeteksi SNP A1369S dirancang oleh
asisten peneliti di Lembaga Eijkman.

7

Tahap-tahap
perancangan
primer
dilakukan dengan bantuan software Primer3,
REHelper, NetPrimer, Blastn, PCRproducts
dan Restriction Digest. Pemilihan enzim
restriksi dilakukan bersamaan dengan
perancangan primer. Tahap perancangan
primer diuraikan dalam Lampiran 2. Primer
yang digunakan adalah sebagai berikut:
- SNP E23K pada gen KCNJ11
 Forward Primer :
5-GACTCTGCAGTGAGGCCCTA-3
 Reverse Primer :
5-ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT-3
- SNP A1369S pada gen ABCC8
 Forward Primer :
5-CGCTACGACAGCTCCCTGAAG-3
 Reverse Primer :
5-GTCTCCTTGGTGGATGAGTGAG-3
Enzim restriksi yang digunakan untuk
memotong produk PCR gen KCNJ11 adalah
BanII, dengan situs restriksi :
5’....GRGCYˇC....γ’
γ’....CˆYCGRG....5’
Enzim restriksi yang digunakan untuk
memotong produk PCR gen ABCC8 adalah
MwoI, dengan situs restriksi :
5’....GCNNNNNˇNNGC....γ’
γ’....CGNNˆNNNNNCG....5’
Keterangan :
R=A/G, Y=C/T, N= A/T/G/C;
= Letak polimorfisme
Isolasi DNA
a) Metode PuregeneR yang Telah
Dimodifikasi (2003)
Sebanyak 6 mL larutan pelisis sel darah
merah dicampur dengan 2 mL darah di dalam
tabung Falcon™ bervolume 10 mL. Tabung
tersebut dibolak-balik sebanyak 2-3 kali
kemudian diinkubasi pada suhu ruang (1525°C) selama 10 menit. Setelah itu, dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit pada 1500 rpm
(Sorvall RT 6000D) untuk mengendapkan sel
darah putih. Supernatan dalam tabung dibuang
dan dua tahap terakhir diulang tanpa melalui
proses inkubasi. Pelet sel darah putih yang
diperoleh
kemudian
divorteks
hingga
homogen dan ditambahkan 500 µL larutan
pelisis sel darah putih. Campuran kemudian
dihomogenasi kembali dengan menggunakan
pipet transfer.
Sebanyak 2 µL enzim RNase A 5 mg/mL
dicampurkan ke dalam larutan kemudian
dihomogenasi dan diinkubasi di suhu 37°C
dalam shaker waterbath selama 45 menit.
Sebanyak 334 µL amonium asetat 5 M
dimasukkan ke dalam larutan agar terjadi

presipitasi protein. Tabung divorteks hingga
homogen kemudian disentrifugasi pada 3.000
rpm (Sorvall RT 6000D) dengan suhu 4°C
selama 15 menit.
Supernatan dengan volume ±800 µL yang
mengandung DNA dituang ke dalam tabung
Falcon™ baru berukuran 15 mL yang berisi
1.540 µL isopropanol. Isopropanol akan
mengikat
air
sehingga
menyebabkan
koagulasi DNA yang dapat diamati berupa
gumpalan-gumpalan berwarna putih. Larutan
dibolak-balik sebanyak 25-30 kali hingga
pelet DNA terlihat. Sentrifugasi dilakukan
kembali dengan kecepatan 3000 rpm (Sorvall
RT 6000D) pada suhu 4°C selama 15 menit.
Supernatan yang berisi pengotor dibuang,
kemudian dilakukan pencucian dengan 166
µL etanol 70%. Tabung disentrifugasi
kembali, kemudian supernatan berupa etanol
70% dibuang. Pelet DNA kemudian
dikeringkan pada suhu ruang selama semalam.
Pelet tersebut selanjutnya direhidrasi dengan
menambahkan 100 µL buffer TE dan
diinkubasi pada suhu 37°C dalam shaker
waterbath selama 2 jam. Pelet DNA yang
telah dilarutkan disimpan pada suhu -20°C.
b) Isolasi DNA dari Guthrie Cards
Daerah pada permukaan Guthrie Cards
yang mengandung darah kering dipotong kecil
dengan ukuran kira-kira 0,7x1cm. Potonganpotongan tersebut dimasukkan ke dalam
tabung Eppendorf 1,5 mL. Saponin 0,5%
ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf
tersebut sebanyak 1 mL. Tabung dibolak-balik
beberapa kali lalu diinkubasi selama semalam
pada suhu 4°C. Setelah melalui proses
inkubasi, tabung disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm (Sorvall RT 6000D) selama 5 detik
kemudian supernatan dibuang. Selanjutnya, ke
dalam tabung ditambahkan Phosphate Buffer
Saline (PBS) sebanyak 1 mL dan diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 4°C kemudian
disentrifugasi pada kecepatan dan waktu yang
sama. Langkah tersebut dilakukan kembali
sebanyak 3 kali ulangan tanpa melalui proses
inkubasi. Supernatan dibuang kemudian
dilakukan penambahan Chelex 20% sebanyak
50 µL dan larutan TE pH 8,0 steril sebanyak
100 µL. Sampel diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 100°C kemudian divorteks selama
1-2 menit. Setelah itu, sampel disentrifugasi
kembali pada 12000 rpm (Sorvall RT 6000D).
Supernatan dipindahkan ke tabung baru
kemudian disentrifugasi pada kecepatan yang
sama selama 10 menit. Supernatan yang
mengandung DNA dipindahkan ke tabung
baru lalu disimpan pada suhu 20°C.

8

Pengukuran Konsentrasi DNA
Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan
dengan prinsip spektrofotometri berdasarkan
Sambrook et al. (2001). Pengukuran
dilakukan dengan spektrofotometer Nanodrop
ND-1000 V3.5.2 pada panjang gelombang
260 nm untuk DNA dan 280 nm untuk protein
pengotor. Nilai perbandingan antara DNA
dengan protein pengotor (A260/A280) berada
diantara 1,8-2,0 (Sambrook et al. 2001).
Setelah konsentrasi DNA diketahui, sampel
DNA diencerkan menjadi 50 ng/µL dengan
menambahkan Ultrapure ddH2O.
Amplifikasi Gen dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Bahan campuran reaksi PCR memiliki
total volume 25 µL dalam tiap tabung, bahan
tersebut terdiri atas ddH2O; PCR buffer 1x;
MgCl2 1,5 mM; dNTP 0,2 mM; forward
primer 4 pmol; reverse primer 4 pmol; 0,5
unit Taq polimerase; dan 50 ng DNA sampel.
DNA tersebut diamplifikasi di mesin PCR
yang sudah diatur waktu dan suhunya seperti
ditampilkan
pada
Gambar
3.
Fase
predenaturasi dilakukan pada suhu 95°C
selama 5 menit, dilanjutkan dengan tahap
denaturasi pada suhu yang sama selama 1
menit. Tahap annealing terjadi pada suhu
60°C selama 30 detik, kemudian diikuti tahap
ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit.
Tahap denaturasi, annealing dan ekstensi
diulang sebanyak 30x, diakhiri dengan tahap
pos ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.

Gambar 4 Pengaturan suhu dan waktu yang
digunakan pada reaksi PCR gen
KCNJ11 dan ABCC8.
Elektroforesis Produk PCR
Produk
PCR
dielektroforesis
menggunakan gel agarose yang terlarut dalam
buffer (TBE) 1X hingga mencapai konsentrasi
1% menggunakan microwave oven. Setelah
agarose terlarut dengan sempurna, selanjutnya

dilakukan penambahan EtBr sebanyak 5 µL
ke
dalam
larutan
tersebut.
Proses
elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 V
selama 30 menit. Jumlah DNA yang diisikan
ke dalam sumur elektroforesis adalah 4 µL
dengan loading buffer sebanyak 2 µL. Hasil
PCR yang telah dikonfirmasi kemudian
dipotong dengan enzim restriksi.
Restriction Fragment Length Polymorphisms
(RFLP)
Produk PCR dipotong dengan enzim
restriksi. Perbedaan satu basa nukleotida atau
lebih menyebabkan enzim tidak dapat
mengenali situs pemotongannya. Karakteristik
ini merupakan prinsip dasar deteksi SNPs
dengan metode RFLP. Enzim restriksi akan
memotong SNPs dengan jenis alel tertentu,
namun tidak memotong alel lainnya.
Akibatnya, produk PCR dengan polimorfisme
yang berbeda akan memiliki ukuran produk
restriksi yang berbeda.
Produk PCR gen KCNJ11 didigesti dengan
3 unit enzim BanII untuk mendeteksi SNP
E23K yang dicampur dalam larutan buffer
NEB 4. Produk PCR gen ABCC8 didigesti
dengan 1 unit enzim MwoI untuk mendeteksi
SNP A1369S yang dicampur di dalam buffer
NEB 3. Produk PCR yang akan didigesti
diinkubasi di dalam thermomixer selama 7
jam pada suhu inkubasi 37°C untuk gen
KCNJ11 dan 16 jam (overnight) pada suhu
60°C untuk gen ABCC8. Hasil restriksi
kemudian dielektroforesis pada gel agarose
2,5% dengan tegangan 80 V selama 1 jam
untuk gen KCNJ11, sedangkan untuk gen
ABCC8 digunakan gel 3% dengan tegangan
80 V selama 1,5 jam. Pada saat elektroforesis,
seluruh DNA hasil restriksi diisikan ke dalam
well agarose yang dicampur dengan loading
buffer sebanyak 2 µL. Hasil elektroforesis
menunjukkan beberapa pita yang dapat
diidentifikasi
ukurannya
dengan
menggunakan marker DNA ϕx174RTDNA
yang dipotong dengan enzim HaeIII.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan menggunakan
perangkat lunak R-Statistics 2.13.0 (Rproject.org©2011). Hasil analisis yang
signifikan diperoleh pada p-value