BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliput i pengumpulan sampel, pembuatan simplisia, pemeriksaan saponin, pembuatan
ekstrak, isolasi senyawa sapogenin dari ekstrak, meliputi analisis senyawa sapogenin secara KLT, pemisahan senyawa sapogenin dengan cara KLT
preparatif, uji kemurnian senyawa sapogenin hasil isolasi dengan KLT dua arah serta identifikasi isolat secara spektrofotometri UV, IR, dan spektrometri massa
MS.
3. 1 Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas laboratorium, oven listrik stork, elektromantel EM 2000, hair-dryer, cawan
penguap, termometer, lampu UV 366 nm Dessaga, neraca analitik Vibra AJ, neraca kasar Salter AND, penangas air Yenaco, seperangkat alat kromatografi
lapis tipis Dessaga, spektrofotometer ultraviolet Shimadzu mini 1240, spektrofotometer inframerah Shimadzu, spektrometer massa Shimadzu
QP2010S.
3. 2 Bahan-bahan yang digunakan
Bahan yang digunakan adalah teripang Holothuria sp. dan suspensi darah. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro
analisa yaitu asam klorida pekat, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, etil
Universitas Sumatera Utara
asetat, metanol, toluen, kalium fosfat monobasa, kloroform, natrium hidroksida,
n-heksan, plat pra lapis silika gel GF
254
E. Merck. Etanol 95 hasil destilasi dan air suling laboratorium.
3. 3 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3. 3. 1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membanding kan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan adalah teripang yang masih segar
dari perairan Sabang, Aceh.
3. 3. 2 Identifikasi Hewan
Identifikasi hewan dilakukan di Pusat Penelitian Oceanografi Jakarta. Hasil identifikasi dan gambar hewan dapat dilihat pada lampiran 1-2 halaman 21-
22.
3. 3. 3 Pengolahan Sampel
Teripang dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan lalu ditimbang, diperoleh berat basah 1 ekor
teripang = 1,2 kg. Kemudian teripang dipotong dengan ukuran 5x5 cm dan dikeringkan dalam lemari pengering. Teripang yang sudah kering ini disebut
simplisia hewan. Selanjutnya simplisia diperkecil potongannya dan disimpan dalam wadah plastik kedap udara di tempat yang terlindung dari cahaya.
Universitas Sumatera Utara
3. 4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3. 4. 1 Larutan Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, 1979.
3. 4. 2 Larutan Natrium Hidroksida 0,2 N
Sebanyak 800 mg natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas
karbondioksida hingga 100 ml Depkes, 1979. 3. 4. 3 Larutan Kalium Fosfat Monobasa 0,2 M
Sebanyak 2,72 g kalium fosfat monobasa dilarutkan dalam air suling
bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes, 1979. 3. 4. 4 Larutan Dapar Fosfat pH 7,4
Sebanyak 50 ml kalium fosfat monobasa 0,2 M dicampurkan dengan 39,1 ml natrium hidroksida 0,2 N, lalu diencerkan dengan air suling bebas
karbondioksida hingga 200 ml Depkes, 1979. 3. 4. 5 Larutan Liebermann-Burchard LB sebagai penampak noda
Campurkan 5 ml asam asetat anhidrat dengan 5 ml asam sulfat pekat, kemudian campuran dimasukkan kedalam 50 ml etanol 95. Pengerjaan
dilakukan dalam kondisi dingin dan pereaksi dibuat baru Depkes RI, 1995.
3. 5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan identifikasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan penetapan kadar air.
Universitas Sumatera Utara
3. 5. 1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap teripang segar dan simplisia dengan cara mengamati warna, bau, bentuk dan ukuran. Hasil dapat
dilihat pada lampiran 2-3 gambar 1-2 hal 22-23.
3. 5. 2 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Alat-alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin,
tabung penyambung, pemanas, tabung penerima 5 ml. a Penjenuhan Toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas
bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan, lalu dibiarkan dingin selama 30 menit,
kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml.
b Penetapan Kadar Air
Cara kerja : Kedalam labu yang berisi toluen jenuh di atas dimasukkan 5 g simplisia
yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik
sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian bagian
dalam pendingin dibilas dengan toluen, destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar.
Setelah air dan toluen memisah sempurna, dibaca volume air dengan
Universitas Sumatera Utara
ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung
dalam persen Depkes, 1979 .
3. 6 Pemeriksaan Senyawa Saponin 3. 6. 1 Uji Busa
Sebanyak 0,5 g simplisia dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan
dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih tidak hilang Depkes, 1995.
3. 6. 2 Uji Hemolisis Darah
Sebanyak 0,5 g simplisia dicampur dengan 50 ml larutan dapar fosfat pH 7,4, dipanaskan pada suhu 100
Sebanyak 0,5 g simplisia ditambahkan 10 ml etanol, kemudian dimasuk kan asam klorida 2 N, selanjutnya larutan direfluks selama 10 menit dan disaring
dalam keadaan panas. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin C selama 10 menit, didinginkan lalu di saring.
Kemudian 1 ml filtrat dicampur dengan 1 ml suspensi darah dan didiamkan selama 30 menit. Terjadinya hemolisis total menunjukkan adanya saponin yang
ditandai dengan terbentuknya lapisan bening bewarna merah kekuningan di
bagian tengah larutan Depkes, 1995.
3. 7 Pemeriksaan Senyawa SteroidTriterpenoid 3. 7. 1 Reaksi Warna dengan Pereaksi Liebermann-Burchard LB
Universitas Sumatera Utara
ditambahkan 10 ml n-heksan, dikocok hati-hati dan dibiarkan memisah. Lapisan n-heksan diambil dan diuapkan pada cawan penguap. Pada sisa ditetesi 20 tetes
asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi LB. Hasil positif adanya steroid bila memberikan warna hijau, biru dan triterpenoid bila
memberikan warna merah, merah muda atau ungu Farnsworth, 1966.
3. 8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan menurut badan POM 2004 dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 95.
Cara kerja : Sebanyak 120 g simplisia teripang dimasukkan kedalam wadah gelas
bertutup maserator, lalu sebanyak 1,2 L etanol 95 dituang kedalam maserator sambil sesekali diaduk, lalu ditutup dan dibiarkan 24 jam, kemudian disaring dan
filtrat ditampung. Perlakuan yang sama dilakukan sebanyak 3 kali. Filtrat yang diperoleh digabungkan menjadi satu, kemudian dipekatkan dengan rotari evapora
tor hingga diperoleh ekstrak kental Badan POM, 2004. Bagan proses ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 24.
3. 9 Analisis ekstrak etanol dengan cara KLT
Terhadap ekstrak etanol teripang dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam: plat pra lapis silika gel GF
254
, fase gerak: n-heksan – etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 dengan
penampak noda pereaksi LB.
Universitas Sumatera Utara
Cara kerja: Ekstrak etanol teripang ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF
254
, setelah kering plat dimasukkan kedalam masing-masing bejana yang telah jenuh
dengan uap pengembang, kemudian dikembangkan hingga batas pengembangan. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB. Lalu plat
dipanaskan pada suhu 110
Terhadap ekstrak kloroform teripang dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam plat pra lapis silika gel GF
C selama 10 menit Gritter, 1991.Perubahan warna yang terjadi diamati dan harga Rf dihitung. Kromatogram hasil KLT dapat dilihat
pada lampiran
3.10 Isolasi Senyawa Sapogenin dari Ekstrak Etanol Isolasi senyawa sapogenin dilakukan dengan cara menghidrolisis ekstrak
etanol selama 6 jam dengan penambahan asam klorida 2 N, kemudian hasil hidro
lisis diekstraksi dengan kloroform Harborne, 1987.
Cara kerja: Sebanyak 8 g ekstrak etanol teripang ditambahkan asam klorida 2 N.
Kemudian dihidrolisis dengan cara merefluksnya selama 6 jam, selanjutnya filtrat diekstraksi dengan kloroform sebanyak 3 kali, aglikon sapogenin berada dalam
lapisan kloroform. Ekstrak kloroform hasil hidrolisis digabung dan dipekatkan.
Bagan isolasi senyawa sapogenin dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 24.
3. 11 Analisis Ekstrak Kloroform dengan Cara KLT
254
, fase gerak n-heksan-etil
Universitas Sumatera Utara
asetat dan kloroform-toluen dengan perbadingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 dan penampak noda pereaksi LB.
Cara kerja: Ekstrak kloroform teripang ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF
254
, biarkan mengering. Kemudian plat dimasukkan kedalam masing-masing bejana
yang telah jenuh dengan uap pengembang, lalu dikembangkan sampai garis batas pengembangan. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pe
reaksi LB, lalu plat dipanaskan pada suhu 110 C selama 10 menit. Kromatogram
diamati dan harga Rf dihitung, sehingga diketahui perbandingan fase gerak yang terbaik untuk digunakan pada KLT preparatif Gritter, 1991. Bagan analisis
ekstrak kloroform dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 25.
3. 12 Isolasi Senyawa Sapogenin dengan KLT Preparatif Terhadap ekstrak kloroform teripang dilakukan pemisahan dengan KLT
preparatif menggunakan fase diam silika gel GF
254
Ekstrak kloroform teripang ditotolkan berupa isolat pada plat KLT preparatif berukuran 20 x 20 cm, setelah kering plat dimasukkan kedalam bejana
yang telah jenuh dengan uap pengembang. Kemudian dikembangkan sampai garis batas pengembangan, plat dikeluarkan dan dikeringkan. Pada sisi kanan dan kiri
plat disemprot dengan pereaksi LB dan dipanaskan dengan bantuan hair-dryer hingga diperoleh noda yang jelas. Bagian plat silika yang sejajar dengan noda
yang memberikan reaksi positif dengan pereaksi LB dikerok kemudian dilarutkan , fase gerak kloroform-toluen
80:20 dan penampak noda pereaksi LB. Cara Kerja:
Universitas Sumatera Utara
dengan pelarut metanol, lalu disaring, diuapkan pelarut metanolnya kemudian disimpan kedalam lemari pendingin Hostettmann, 1995. Hasil kromatogram
KLT preparatif dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 29.
3. 13 Uji kemurnian Isolat dengan KLT Terhadap isolat dilakukan uji kemurnian dengan KLT menggunakan plat
pra lapis silika gel GF
254
, fase gerak kloroform-toluen 80:20 dan penampak noda pereaksi LB. Senyawa sapogenin dikatakan murni jika hasilnya telah
menunjukkan satu noda. Cara Kerja:
Senyawa isolat dengan KLT preparatif ditotolkan pada plat pra lapis
silika gel GF
254
, biarkan mengering. Kemudian plat dimasukkan kedalam bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, lalu dikembangkan sampai garis batas
pengembangan. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi LB, lalu plat dipanaskan pada suhu 110
C selama 10 menit Gritter, 1991. Kromatogram diamati dan harga Rf dihitung. Hasil kromatogram dapat
dilihat pada lampiran 9 halaman 30.
3. 14 Uji Kemurnian Isolat dengan KLT Dua Arah
Terhadap isolat dilakukan uji kemurnian dengan KLT dua arah meng gunakan plat pra lapis silika gel GF
254
, fase gerak I kloroform-toluen 80:20 dan fase gerak II kloroform-metanol 30:70 sebagai penampak noda pereaksi LB.
Universitas Sumatera Utara
Cara kerja: Senyawa hasil isolasi dengan KLT preparatif ditotolkan pada plat pra
lapis silika gel GF
254
, setelah kering dimasukkan kedalam bejana yang telah jenuh dengan uap pengembang, dan dikembangkan dengan larutan pengembang I
sampai garis batas pengembangan, kemudian plat dikeluarkan dan dikeringkan. Plat diputar 90
o
dan dikembangkan kembali dengan larutan pengembang II sampai garis batas pengembangan. Plat dikeluarkan, dikeringkan kemudian disemprot
dengan pereaksi LB. Lalu plat dipanaskan pada suhu 110
3.15.2 Identifikasi Isolat dengan Spektrofotometer Inframerah
C selama 10 menit Gritter, 1991. Kromatogram diamati dan harga Rf dihitung. Hasil kromatogram
dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 31.
3.15 Identifikasi Isolat 3.15.1 Identifikasi Isolat dengan Spektrofotometer Ultraviolet
Cara kerja: Isolat dilarutkan dalam pelarut metanol, kemudian dimasukkan kedalam
kuvet yang telah dibilas dengan larutan sampel. Selanjutnya absorbansi larutan sampel diukur pada panjang gelombang 200-400 nm Noerdin, 1985. Spektrum
dapat dilihat pada lampiran 11 halaman 32.
Cara kerja: Isolat hasil isolasi digerus halus kemudian ditambahkan KBr, dihaluskan.
Campuran dimasukkan kedalam alat pellet die dihubungkan dengan alat pompa vakum dan penekan hidrolik 10 menit tekanan 10000 – 15000 pound per inci.
Pompa vakum dimatikan, pellet die dilepaskan dari pompa hidrolik, kemudian
Universitas Sumatera Utara
pellet KBr dikeluarkan. Pellet KBr ditempatkan pada pemegang cuplikan sell holder Noerdin, 1985. Spektrum inframerah isolat dapat dilihat pada lampiran
12 halaman 33.
3.15.3 Karakterisasi Isolat dengan Spektrometer Massa
Karakterisasi isolat secara kromatografi gas-spektrofotometri massa dilakukan dengan cara melarutkan isolat dengan pelarut n-hexan kemudian
dimasukkan melalui tempat penyuntikan kedalam suatu aliran gas pembawa pada pangkal kolom dalam bentuk uap dan mengalami proses pembagian antara fase
gas dan fase tidak bergerak. Hasil pemisahan kromatografi gas difragmentasi sehingga diperoleh fragmen-fragmen pada spektrum. Spektrum massa dapat
dilihat pada lampiran 13 halaman 34.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN