37
Karakterisasi PAB
1
dengan elektroforesis dilakukan menggunakan teknik SDS-PAGE Wibawan et al. 1992.
Penanda baku yang digunakan untuk elektroforesis mengandung karbonil anhidrase 29 kDa, albumin telur 45 kDa,
albumin sapi 66 kDa, fosforilasi 97,4 kDa, -galaktosidase 116 kDa dan
miosin 205 kDa. Sebanyak 25,0 L bilasan protein dan 5,0 L penanda
molekular baku Biorad, Ltd. dicampurkan dengan 5,0 L penyangga contoh Tris-HCl 1 molL pH 6,8, SDS 2, gliserol 10, 2-merkaptoethanol 0,05,
bromfenolbiru 0,002. Campuran dimasukkan ke sumur penampung pada jel poliakrilamida dalam rendaman running buffer dan dilewatkan pada tegangan 80
volt dan kuat arus 0,065 A selama 40-50 menit. Setelah contoh mencapai batas bawah jel, jel dilepaskan dari cetakannya untuk diwarnai.
Jel difiksasi menggunakan larutan ethanol-asam asetat 10,0 ml ethanol, 10,0 ml asam asetat
dan 80,0 ml air suling. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan Coomassie Blue 0,25 selama 18 jam pada suhu 25
o
C. Setelah masa pewarnaan dicapai, dilakukan perendaman dalam larutan pemucat 10,0 ml metanol, 10,0 ml asam
asetat dan 80,0 ml air suling. Bila pita terlihat kontras dengan jel, maka jel diangkat dan direndam dalam air suling, disimpan pada suhu empat derajat Celcius
untuk menentukan pita protein yang dibentuk.
6. Produksi Anti-Protein APAB
1
Sebanyak 0,2 ml ekstrak PAB
1
yang diperoleh dari organ hati bebek dan ayam disuntikkan ke kelompok kelinci yang berbeda melalui v. auricularis untuk
mendapatkan anti-protein Gambar 6a. Penyuntikan diulang booster pada hari ke-8, 15 dan 22. Setiap hari ke-5 setelah penyuntikan, dilakukan pengambilan
darah sebanyak 3,0-5,0 ml melalui a. auricularis dengan tujuan pemanenan serum Gambar 6b.
7. Uji Keberadaan Anti-Protein APAB
1
Pemeriksaan dengan teknik AGPT dilakukan pada semua serum yang dipanen untuk memantau keberadaan APAB
1
dalam serum Wibawan et al. 1992.
38
Karena titer APAB
1
dinilai masih terlalu rendah, maka masa pemeliharaan hewan coba diperpanjang selama tujuh hari. Di akhir masa pemeliharaan, seluruh
kelompok hewan coba dikorbankan untuk mendapatkan serum dalam jumlah yang banyak.
Sebanyak 0,4 g agarose dan 1,2 g PEG 6000 dilarutkan secara merata ke
dalam 20,0 ml PBS dan 20,0 ml air suling dalan gelas erlenmeyer bervolume 100 ml. Empat puluh mililiter PBS dengan kadar yang digandakan ditambahkan ke
dalam erlenmeyer yang lainnya. Keduanya dididihkan selama 5-10 menit dan kemudian dicampurkan. Sebanyak 40 L NaN3 10 ditambahkan ke dalamnya.
Larutan agar dituang ke cawan dan dibiarkan membeku. Pembuatan enam lubang satu di tengah dan lima lubang yang mengelilinginya dilakukan menggunakan
puncher setelah agar membeku. Agar untuk lubang sumur diangkat secara hati- hati agar lubang terbentuk dengan sempurna.
Sebanyak 25 L larutan PAB
1
dari bebek dan ayam dimasukkan ke lubang tengah. Serum yang akan diperiksa diencerkan dua kali dan setelah itu sebanyak
25 L serum tersebut dimasukkan ke beberapa lubang sebelah luarnya. Agar diletakkan di dalam kotak dengan kondisi lembab dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam. Keberadaan APAB
1
akan diperlihatkan dengan munculnya garis
a b
Gambar 6. Penyuntikan PAB
1
kepada hewan coba kelinci melalui v. auricularis a. Serum diambil setiap lima hari setelah penyuntikan untuk dilakukan
pemantauan keberadaan dan titer APAB
1
b
39
presipitasi yang terbentuk di tengah-tengah agar di antara lubang PAB
1
dan serum. Tidak terbentuknya garis presipitasi menandakan di dalam serum tidak
terdapat APAB
1
.
8. Pemeriksaan Histologik Ikatan PAB
