Penentuan Simultan Empat Senyawa Triterpenoid Dan Analisis Sidik Jari Pegagan (Centella Asiatica) Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

PENENTUAN SIMULTAN EMPAT SENYAWA TRITERPENOID
DAN ANALISIS SIDIK JARI PEGAGAN (Centella asiatica)
MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

FITRI HANDAYANI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul penentuan simultan
empat senyawa triterpenoid dan analisis sidik jari pegagan (Centella asiatica)
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
Fitri Handayani
NIM G451140291

RINGKASAN
FITRI HANDAYANI. Penentuan simultan empat senyawa triterpenoid dan
analisis sidik jari pegagan (Centella asiatica) menggunakan kromatografi cair
kinerja tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH K DARUSMAN dan MOHAMAD
RAFI.
Pegagan merupakan tumbuhan yang umum digunakan sebagai obat
tradisional. Komponen bioaktif utama pada pegagan yaitu senyawa yang masuk
ke dalam kelas triterpenoid diantaranya madekasosida, asiatikosida, asam
madekasat, dan asam asiatat. Senyawa-senyawa tersebut telah digunakan sebagai
senyawa penanda untuk evaluasi kualitas bahan baku dan produk herbal pegagan.
Untuk tujuan memastikan kualitas dan keamanan dibutuhkan suatu metode
kontrol kualitas. Pendekatan senyawa penciri dan analisis sidik jari telah
digunakan dalam pengembangan metode pengendalian kualitas tumbuhan obat
dan produk herbal. Kombinasi dari kuantifikasi multi senyawa dan analisis sidik
jari akan menghasilkan metode analisis yang komprehensif untuk identifikasi dan

diskriminasi spesies tumbuhan yang berkerabat dekat. Tujuan penelitian ini yaitu
mengembangkan metode analisis untuk kuantifikasi simultan empat senyawa
triterpenoid dan analisis sidik jari pada pegagan menggunakan KCKT dengan
detektor larik diode. Analisis sidik jari yang diperoleh dikombinasikan dengan
analisis kemometrika untuk membedakan pegagan dengan tumbuhan yang
berkerabat dekat dan membedakan pegagan berdasarkan usia tanam, dengan
waktu analisis yang lebih singkat.
Sampel diekstraksi dengan metode sonikasi menggunakan metanol sebelum
diinjeksikan ke dalam sistem KCKT. Kondisi KCKT yang digunakan untuk
kuantifikasi simultan dan analisis sidik jari pegagan yaitu fase diam C18 dan fase
gerak asetonitril-air secara elusi gradien selama 40 menit pada suhu kolom 40oC
dengan laju alir 1 mL/ menit dan panjang gelombang deteksi 206 nm. Pengujian
kinerja analitik yang dilakukan terhadap metode ini menunjukkan semua
parameter telah memenuhi kriteria penerimaan sebagai metode yang dapat
diandalkan dan akurat. Metode yang dikembangkan dapat digunakan untuk
kuantifikasi secara simultan empat triterpena pada bahan baku dan produk jadi
pegagan, analisis sidik jari untuk identifikasi dan diskriminasi pegagan dari
beberapa tumbuhan berkerabat dekat, seperti antanan air dan semanggi gunung,
dan juga klasifikasi pegagan sesuai usia tanam. Nilai luas puncak dari 7 senyawa
mayor yang diperoleh dari kromatogram sidik jari sampel digunakan sebagai

variabel untuk diskriminasi pegagan berdasarkan usia tanamnya menggunakan
analisis diskriminan (AD). Keragaman total yang diperoleh dari plot fungsi
diskriminan (FD) adalah sebesar 100%. Berdasarkan hasil AD, semua sampel
dapat diklasifikasi kedalam kelompoknya masing-masing yang menunjukkan
bahwa fungsi diskriminan yang diperoleh mampu membedakan pegagan 3, 4, dan
5 bulan setelah tanam (BST). Kemampuan prediksi model diuji dengan validasi
silang LOOCV dan hasil yang diperoleh sebesar 97.62%, menunjukkan model
dapat memberikan prediksi klasifikasi yang baik untuk sampel uji.
Kata kunci: pegagan, KCKT, klasifikasi, kemometrika

SUMMARY
FITRI HANDAYANI. Simultaneous quantification of four triterpenes and
fingerprint analysis of Centella asiatica using high performance liquid
chromatography. Supervised by LATIFAH K DARUSMAN and MOHAMAD
RAFI.
Centella asiatica is commonly used astraditional medicine. The main
bioactive component presents in C. asiatica are madecassoside, asiaticoside,
madecassic acid, and asiatic acid belongs to triterpene class. These components
have been utilized as the marker components for quality evaluation of raw
material and herbal product of C. asiatica. In order to ensure the quality, efficacy

and safety we will need a quality control method for these purposes. Marker
components and fingerprint analysis are commonly used in the development of
quality control method of medicinal plant and herbal product. By using
combination of the multicomponent quantification and fingerprint analysis, we
will have a comprehensive analytical method for identifying and discriminating a
closely-related species. The purpose of this research, we developed a fingerprint
analysis and simultaneous quantification of four triterpenes in C. asiatica using
HPLC with diode array detector. Fingerprint analysis combined with
chemometrics analysis also used for discriminating C. asiatica closely-related
species and its cultivation ages with shorter analysis time.
All of the samples were sonicated with methanol before injected into the
HPLC system. The fingerprint analysis and simultaneous quantification was
performed using C18 as the stationary phase and acetonitrile-water as the mobile
phase with gradient elution in 40 minutes, a column temperature 40oC with a flow
rate of 1mL/ min and detection wavelength at 206 nm. Evaluation of analytical
performance of this method showed all of the parameters used for evaluation met
the acceptance criteria reliable and accurate method. The developed method could
be used for simultaneous quantification four triterpenes in C. asiatica raw material
and its finished product and fingerprint analysis for identification and
discrimination of C. asiatica from some closely-related plants, i.e H. verticillata

and H. sibthorpiodes, and combination of HPLC fingerprint with chemometrics
analysis for classification of C. asiatica according to its cultivation ages. We used
peak area of 7 common peaks in the fingerprint chromatogram of C. asiatica as
the variable for discrimination of C. asiatica cultivation ages using discriminant
analysis (DA). Discriminant function (DF) plot gave a total variance about 100%.
According to DA plot, all of the samples could be classified into each group
showing that discriminant function obtained could differentiate C. asiatica based
on its cultivation ages i.e 3, 4, and 5 months post-planting (MPP). Evaluation
toward prediction ability of the model obtained was performed by using LOOCV
and we found 97.62% of the samples used correctly classified into their groups.
Keywords: Centella asiatica, HPLC, classification, chemometrics

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENENTUAN SIMULTAN EMPAT SENYAWA TRITERPENOID
DAN ANALISIS SIDIK JARI PEGAGAN (Centella asiatica)
MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

FITRI HANDAYANI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Zainal Alim Mas’ud, DEA

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2015 ini adalah pengembangan
metode analisis kualitatif dan kuantitatif, dengan judul Penentuan Simultan Empat
Senyawa Triterpenoid dan Analisis Sidik Jari Pegagan (Centella asiatica)
Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS
dan Dr Mohamad Rafi, SSi, MSi selaku pembimbing atas segala curahan waktu,
bimbingan, nasehat, saran dan kritik yang membangun, serta dukungannya selama
proses penelitian hingga penyelesaian karya ilmiah ini. Terimakasih kepada Dr
Zainal Alim Mas’ud, DEA selaku penguji luar komisi dan kepada Dr Eti Rohaeti,
MS atas kesediaan mewakili pembimbing I selama proses ujian akhir. Terima
kasih pula kepada Prof Dr Ir Dyah Iswantini P, MScAgr selaku ketua program
studi Departemen Kimia. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada
Taopik Ridwan MSi dan Laela Wulan Sari SSi beserta seluruh staf Pusat studi
Biofarmaka Tropika LPPM IPB (Salina Febriany, MSi, Nunuk Kurniati N,
SFarm, Wiwi Widayanti, Antonio Kausar, SSi, Endi Suherman, Ega Firdaus, dan
M. Yusuf Ibrahim) yang telah membantu selama proses penelitian. Ungkapan
terima kasih penulis sampaikan kepada kakak Cahya Septianti, kakak Aryani

Sabir, Arum Vitasari yang telah membantu selama proses analisis data, dan
teman-teman pascasarjana kimia angkatan 2014 (Firnanelty, Qory Hajrul, Epi
Erpina, Fahmi Fauziyah, dan Dwi Fitri Yani), serta kakak Era Rahmi atas
semangat untuk menyelesaikan penelitian hingga penyelesaian naskah karya
ilmiah ini. Ungkapan terima kasih dan doa juga disampaikan kepada almarhum
Ayah Muhammad Diah, Ibu Rukiah, dan kakakku Nur Usma dan Masrizal, serta
seluruh keluarga untuk doa, kasih sayang, dan dukungan selama studi
berlangsung.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2016
Fitri Handayani

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x

DAFTAR GAMBAR

x

DAFTAR LAMPIRAN

x

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
3
3
3

2

TINJAUAN PUSTAKA
Pegagan
Kandungan Kimia Pegagan
Analisis Sidik Jari
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Evaluasi Kinerja Analitik
Kemometrika

3
3
4
5
6
7
8

3

METODE
Bahan dan Alat
Prosedur Percobaan dan Analisis Data

9
9
9

4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Ekstraksi
Pengoptimuman Kondisi KCKT
Evaluasi Kinerja Analitik
Penentuan Simultan Madekasosida, Asiatikosida, Asam Madekasat, dan
Asam Asiatat dalam Sampel Pegagan
Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi Pegagan
Klasifikasi Pegagan dengan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Analisis
Multivariat

10
10
11
12

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

19
19
19

5

14
16
17

DAFTAR PUSTAKA

20

LAMPIRAN

24

RIWAYAT HIDUP

42

DAFTAR TABEL
1 Uji kesesuaian sistem untuk penentuan madekasosida, asiatikosida, asam
madekasat, dan asam asiatat
2 Linearitas, LD, dan LK untuk analisis kuantitatif madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, dan asam asiatat
3 Penentuan ketelitian, ketepatan, dan stabilitas metode
4 Kadar madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam asiatat
dalam sampel pegagan

13
13
14
15

DAFTAR GAMBAR
1 Tumbuhan pegagan (a), antanan air (b), dan semanggi gunung (c)
2 Struktur kimia dari (a) asiatikosida, (b) asam asiatat, (c) madekasosida,
(d) asam madekasat
3 Kromatogram KCKT dari larutan standar (a) (madekasosida (1),
asiatikosida (4), asam madekasat (5), dan asam asiatat (6) dengan
konsentrasi masing-masing 100 µg/ mL), sampel pegagan (b) (UV 206
nm)
4 Kromatogram KCKT dari pegagan (a), antanan air (b), dan semanggi
gunung (c) (UV 206 nm)
5 Plot skor FD pegagan 3 BST ( ), 4 BST( ), dan 5 BST ( )

2
5

12
16
18

DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Uji kesesuaian sistem menggunakan standar medekasosida, asiatikosida,
asam madekasat, dan asam asiatat (10 µg/ mL)
3 Linearitas standar madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam
asiatat
4 Penentuan LD dan LK berdasarkan S/N
5 Penentuan ketelitian berdasarkan kadar masing-masing analit
6 Penentuan ketepatan berdasarkan perolehan kembali dan SBR (%)
masing-masing analit berdasarkan kadar (µg/ mL)
7 Penentuan stabilitas sampel berdasarkan SBR (%) kadar analit
8 Simpangan baku relatif kedapatulangan dan stabilitas
9 Penentuan kadar madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam
asiatat dalam sampel pegagan
10 Waktu retensi relatif dan luas puncak relatif tujuh puncak mayor pegagan
11 Data luas puncak sampel sebelum dan sesudah transformasi
12 Koefisien kanonik dan hasil klasifikasi analisis diskriminan pegagan

25
26
27
29
29
31
33
34
36
37
39
41

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Centella asiatica merupakan salah satu tumbuhan obat yang telah banyak
digunakan dalam berbagai formula obat serta dapat tumbuh di daerah tropis dan
subtropis. Di Indonesia, C. asiatica dikenal dengan nama pegagan, termasuk salah
satu tumbuhan yang digunakan untuk obat tradisional dan juga dimanfaatkan
sebagai sayuran. Secara tradisional pegagan digunakan untuk mengobati penyakit
kulit, sakit perut, batuk, radang, pegal linu, asma, lepra, demam, dan penambah
darah (BPOM 2010). Beberapa aktivitas biologis pegagan telah banyak
dilaporkan, seperti antioksidan (Jayashree et al. 2003), efek pelindung tukak
lambung (Cheng et al. 2004), mencegah kerusakan kulit (Sommerfeld 2007),
antiinflamasi (Li et al. 2009), antitumor (Pittella et al. 2009), sitotoksik (Alfarra &
Omar 2014), dan dapat meningkatkan memori dan fungsi saraf (Soumyanath
2011). Komponen bioaktif utama pada pegagan yaitu senyawa yang masuk ke
dalam kelas triterpenoid diantaranya madekasosida, asiatikosida, asam madekasat,
dan asam asiatat (Hashim et al. 2011; Rafamantanana et al. 2009). Kadar
komponen bioaktif pegagan bervariasi yang dipengaruhi oleh kondisi tumbuh,
seperti iklim (suhu, kelembaban, cahaya, dan angin) dan kesuburan tanah
(Kristina et al. 2009). Waktu panen dan pengolahan pasca panen juga merupakan
faktor yang dapat memberikan efek dalam perbedaan komposisi dan jumlah
komponen kimia dalam tumbuhan. Oleh karena itu, dalam memastikan
konsistensi khasiat, kualitas, dan keamanan tumbuhan obat mulai dari bahan baku
hingga produk akhirnya, kita akan memerlukan suatu metode analisis yang teliti
dan akurat.
Tumbuhan dapat mengandung senyawa kimia dengan jumlah puluhan
hingga ratusan dan memiliki struktur kimia yang kompleks. Banyak senyawa
yang terdapat dalam tumbuhan, sebagian besar merupakan senyawa yang unik
atau spesifik untuk spesies tersebut, dan aktivitas biologisnya seringkali dikaitkan
dengan efek kumulatif dari beberapa senyawa (Xie et al. 2006). Dalam hal ini, ada
dua pendekatan yang umum digunakan dalam mengembangkan metode analisis
untuk kendali mutu tumbuhan obat menggunakan senyawa kimia yaitu
pendekatan senyawa penciri dan pola sidik jari (Zeng et al. 2008; Demirezer et al.
2014). Pendekatan senyawa penciri masih umum digunakan dalam kendali mutu
tumbuhan obat dengan mengidentifikasi satu atau lebih senyawa kimia yang
terdapat di dalamnya. Pendekatan jenis ini tidak terlalu komprehensif dalam
kendali mutu tumbuhan obat karena hanya mengevaluasi beberapa senyawa kimia
saja padahal tumbuhan obat dapat mengandung puluhan hingga ratusan senyawa
kimia. Alternatif pendekatan lainnya yang mulai banyak digunakan dalam kendali
mutu tumbuhan obat yaitu pendekatan pola sidik jari. Pendekatan ini dapat
mengevaluasi sebagian besar senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan
obat sehingga lebih rasional dalam penilaian kualitas dan produk terkait dari suatu
tumbuhan obat (Zeng et al. 2008). Analisis sidik jari memberikan gambaran yang
komprehensif dari semua senyawa dalam tumbuhan untuk tujuan kualitatif, seperti
identifikasi spesies, autentikasi bahan baku untuk mencegah pemalsuan, serta
untuk mengevaluasi kualitas untuk memastikan konsistensi dan stabilitas bahan

2
baku dan produk herbal (Demirezer et al. 2014; Zeng et al. 2008; WHO 1991; He
et al. 2006). Akan tetapi, terdapat kelemahan dalam menggunakan analisis sidik
jari, yaitu tidak bisa untuk variasi setiap senyawa dan tidak dapat membedakan
perbedaan kecil dalam sinyal dari instrumen analitik. Oleh karena itu, dalam
pengembangan metode untuk identifikasi dan autentikasi spesies harus
dipertimbangkan kombinasi dari kuantifikasi multi senyawa dan analisis sidik jari.
Kombinasi ini telah digunakan sebagai metode kendali mutu untuk bahan baku
dan produk obat herbal (Qiao et al. 2011; Wang et al. 2012; Liu et al. 2013; Liang
et al. 2013; Alaerts et al. 2014; Rafi et al. 2015).
Ada dua spesies yang berkerabat dekat dengan pegagan dan masih termasuk
dalam satu suku (Apiaceae) dengan pegagan, yaitu Hydrocotyle verticillata
(antanan air) dan Hydrocotyle sibthorpiodes (semanggi gunung). Kedua tanaman
ini dimungkinkan sebagai bahan pemalsu bagi pegagan karena memiliki
morfologi yang mirip dan juga beberapa aktivitas biologis ada yang menunjukkan
kemiripan dengan pegagan, seperti antioksidan, antitumor, dan sitotoksik (Yu et
al. 2007; Huang et al. 2008; Husin et al. 2015; UCONN 2016). Secara fisik,
membedakan ketiga spesies ini tidaklah sulit karena masing-masing spesies
memiliki bentuk daun yang berbeda (Gambar 1), akan tetapi menjadi sangat sulit
jika sudah dalam bentuk serbuk. Oleh karena itu,sangat penting untuk dapat
membedakan pegagan dari kedua spesies tersebut dalam hal identifikasi pegagan
untuk menjamin kualitas bahan baku dan produknya. Suatu metode analisis
kualitatif seperti sidik jari kromatografi diperlukan untuk tujuan tersebut.
a

b

c

Gambar 1 Tumbuhan pegagan (a), antanan air (b), dan semanggi gunung (c)
Beberapa metode analisis telah dikembangkan untuk penentuan satu atau
lebih senyawa triterpenoid dan analisis sidik jari untuk pegagan. Teknik analisis
yang sering digunakan untuk kuantifikasi komponen triterpenoid dan untuk
analisis sidik jari adalah kromatografi. Kromatografi lapis tipis (KLT) telah
digunakan untuk identifikasi senyawa triterpenoid (madekasosida, asiatikosida,
asam asiatat) pada pegagan (Bonfill et al. 2005) dan pengembangan metode
analisis menggunakan KLT untuk penentuan kadar asiatikosida pada pegagan
(Chaisawadi & De-Eknamkul 2012). Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
juga telah digunakan untuk penentuan kuantitatif enam triterpena (madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, asam asiatat, asam terminolat, dan asiatikosida B)
dalam ekstrak dan produk komersial pegagan dengan total waktu analisis sebesar
50 menit (Schaneberg et al. 2002). Selain itu, telah dilaporkan juga
pengembangan metode analisis menggunakan KCKT untuk kuantifikasi simultan
madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam asiatat pada pegagan
dengan total waktu analisis 30 menit, akan tetapi pemisahan antara puncak
madekasosida dan isomer-nya (asiatikosida B) masih kurang bagus
(Rafamantanana et al. 2009), dan pengembangan metode analisis sidik jari kimia
untuk menunjukkan variasi dari komponen kimia antar populasi pegagan yang

3
berbeda dari 14 lokasi di Cina dan penentuan kadar asiatikosida pada pegagan
(Zhang et al. 2009). Hingga saat ini belum ditemukan ada yang melaporkan
terkait kombinasi analisis sidik jari dan kuantitatif secara simultan empat
triterpenoid pada pegagan. Oleh karena itu, kami berinisiatif mengembangkan
metode analisis kualitatif dan kuantitatif menggunakan KCKT untuk evaluasi
komposisi kimia pegagan dalam kerangka kendali mutunya.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode kuantifikasi
simultan empat senyawa triterpenoid dan analisis sidik jari pada pegagan
menggunakan KCKT dengan detektor larik diode. Analisis sidik jari yang
diperoleh digunakan untuk membedakan pegagan dari antanan air dan semanggi
gunung serta kombinasinya dengan analisis kemometrika untuk klasifikasi
pegagan sesuai dengan usia tanam.

Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah menghasilkan metode yang dapat digunakan
untuk evaluasi komposisi kimia pegagan dan produk yang terkait dalam kerangka
kendali mutunya. Selain itu, penelitian ini juga memberikan informasi bahwa
metode ini dapat digunakan untuk membedakan pegagan dari antanan air dan
semanggi gunung.

Ruang Lingkup Penelitian
Subjek penelitian ini adalah analisis kuantitatif senyawa madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, asam asiatat secara simultan dan analisis sidik jari
pada pegagan. Analisis sidik jari digunakan untuk membedakan pegagan dari
antanan air dan semanggi gunung serta kombinasinya dengan analisis
kemometrika diaplikasikan untuk klasifikasi pegagan sesuai dengan usia tanam.
Objek penelitian ini adalah sampel pegagan 3 bulan setelah tanam (BST), 4 BST,
dan 5 BST yang berasal dari Bogor, dan sampel pegagan serta produknya dari
beberapa daerah yang berbeda, dan juga sampel semanggi gunung serta antanan
air.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Pegagan
Pegagan termasuk dalam suku Apiaceae merupakan salah satu tumbuhan
herbal yang meiliki batang berupa stolon dan helaian daun berbentuk ginjal

4
dengan tepi daun bergerigi yang tumbuh menjalar di atas permukaan tanah. Di
Indonesia, pegagan dikenal dengan beberapa nama berdasarkan daerah, seperti
antanan (Sunda), kaki kuda (Melayu), sandanan (Papua), sering dimanfaatkan
sebagai sayuran segar, lalapan, dan digunakan juga untuk obat tradisional.
Tumbuhan ini tumbuh liar didaratan rendah baik daerah terbuka, tempat lembap
seperti tegalan, padang rumput, tepi parit, diantara batu-batu, dan tepi jalan
(BPOM 2010).
Pegagan dalam sistematika tumbuhan diklasifikasikan ke dalam divisi
Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, subkelas Rosidae, bangsa Apiales, suku
Apiaceae, marga Centella, dan jenis Centella asiatica (BPOM 2010). Pegagan
memiliki beranekaragam jenis dengan karakteristik yang berbeda-beda. Tiap
daerah memiliki pegagan dengan bentuk daun yang berbeda. Ada yang daunnya
lebar tapi tipis, ada yang daunnya kecil-kecil tapi tebal, ada yang sisi daunnya
bergerigi, dan ada yang bulat persis seperti tombol. Hal ini dikarenakan
perbedaan fenotipe dari tumbuhan pegagan yang dipengaruhi oleh faktor genetik,
lingkungan, dan interaksi antara keduanya (Allard 1960). Menurut Lasmadiwati et
al. (2003) terdapat beberapa jenis pegagan yang telah dibudidayakan dan
diperdagangkan yaitu pegagan besar dan pegagan kecil. Kedua jenis pegagan
tersebut berbeda morfologinya. Perbedaan jenis pegagan ini juga dapat
mempengarui kadar dari senyawa kimia yang dikandungnya karena dipengaruhi
oleh kondisi tumbuh, seperti iklim (suhu, kelembaban, cahaya, dan angin) dan
kesuburan tanah (Kurniawati et al. 2005; Kristina et al. 2009). Waktu panen dan
pengolahan pasca panen juga merupakan faktor yang dapat memberikan efek
dalam perbedaan komposisi dan jumlah komponen kimia dalam tumbuhan.

Kandungan Kimia Pegagan
Pegagan memiliki kandungan senyawa kimia diantaranya alkaloid, saponin,
tanin, fenolik, flavonoid, steroid, dan triterpenoid (Jamil et al. 2006; Kristinaet al.
2009). Senyawa bioaktif pegagan yang paling penting termasuk ke dalam kelas
triterpenoid, yang menimbulkan efek farmakologis utama, yaitu madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, dan asam asiatat (Rafamantanana et al. 2009;
Hashim et al. 2011).
Triterpenoid termasuk golongan terpenoid, dalam biosintesisnya triterpenoid
diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualen (Harborne 1991).
Triterpenoid terdapat pada tumbuhan yang pada umumnya mempunyai kerangka
struktur pentasiklik, selain itu terdapat pula pada hewan yang strukturnya terdiri
dari tetrasiklik. Triterpenoid ada dalam bentuk bebas, ester maupun glikosida
(Mann 1994).
Asiatikosida (Gambar 2a) adalah senyawa golongan glikosida triterpenoid,
yang mengandung glikon yang terdiri dari satu molekul ramnosa dan dua molekul
glukosa. Asiatikosida merupakan salah satu senyawa aktif yang menunjukkan
senyawa identitas pegagan. Rumus molekul senyawa asiatikosida adalah
C48H78O19 (BM 959.12). Aglikon triterpena dari asiatikosida disebut asam asiatat
(Gambar 2b). Asam asiatat memiliki rumus molekul C30H48O5 (BM 488.70)
(Pramono 1992).

5
Madekasosida (Gambar 2c) merupakan salah satu senyawa triterpena utama
pada pegagan, yang struktur kimianya hanya memiliki perbedaan satu gugus
hidroksi saja dengan asiatikosida. Rumus molekul senyawa madekasosida adalah
C48H78O20 (BM 975.12). Asam madekasat (Gambar 2d) merupakan aglikon dari
madekakosida, dengan rumus molekul C30H48O6 (BM 504.70). Asam madekasat
ini memiliki struktur kimia sama dengan asam asiatat, namun perbedaannya hanya
memiliki satu gugus hidroksi saja dengan asam asiatat (Pramono 1992).

Gambar 2. Struktur kimia dari (a) asiatikosida, (b) asam asiatat, (c) madekasosida,
(d) asam madekasat

Analisis Sidik Jari
Profil dan komponen senyawa dari suatu tumbuhan obat dapat dianalisis
secara menyeluruh dengan menggunakan suatu pendekatan yang dikenal sebagai
analisis sidik jari (fingerprint) (Bansal et al. 2013). Analisis sidik jari merupakan
suatu pendekatan analisis yang banyak digunakan dalam mengembangkan suatu
metode analisis untuk tujuan kontrol kualitas tumbuhan obat (bahan baku dan
produk akhir obat herbal) (Rajkumar & Sinha 2010). Analisis sidik jari
memberikan gambaran yang komprehensif dari semua senyawa dalam tumbuhan
untuk tujuan kualitatif, seperti identifikasi spesies, autentikasi untuk mencegah
pemalsuan, serta untuk mengevaluasi kualitas untuk memastikan konsistensi dan
stabilitas bahan baku dan produk herbal (Zeng et al. 2008).
Analisis sidik jari menggunakan teknik kromatografi telah diterima oleh
WHO sebagai salah satu teknik untuk identifikasi dan kontrol kualitas tumbuhan
obat. Sidik jari menunjukkan profil karakteristik dari suatu sampel karena dalam
analisis sidik jari, seluruh kromatogram dianalisis. Perbedaan kualitas sampel
tidak hanya ditemukan di senyawa utama tetapi juga dalam senyawa yang
memiliki konsentrasi rendah. Oleh karena setiap informasi dari semua puncak
digunakan dalam analisis sidik jari, maka puncak yang tumpang tindih harus
dipecahkan atau dipisahkan. Analisis sidik jari mungkin menjadi cara yang
menarik untuk identifikasi dan kontrol kualitas herbal, yang mengandung

6
sejumlah besar senyawa yang tidak diketahui. Setelah dikembangkan, analisis
sidik jari harus dilanjutkan dengan analisis data yang tepat, yang tergantung pada
tujuan (misalnya identifikasi atau kalibrasi multivariat) (Alaerts et al. 2010).
Pengembangan metode untuk kontrol kualitas tumbuhan obat berdasarkan
sidik jari telah banyak dilakukan menggunakan berbagai teknik analisis seperti
spektroskopi inframerah (FTIR), kromatografi gas (KG), elektroforesis kapiler,
kromatografi lapis tipis (KLT), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
Purwakusumah et al. (2014) mengembangkan metode analisis sidik jari
menggunakan FTIR untuk tujuan identifikasi dan autentikasi jahe merah. Dan
juga digunakan oleh Pereira et al. (2014) untuk mendapatkan sidik jari dari obat
(Viagra® and Cialis®). Analisis sidik jari menggunakan KG-spektroskopi massa
juga telah dikembangkan untuk mengidentifikasi dan mengevaluasi kualitas teh
hijau Pu-Erh Yunnan (Shi-Dong et al. 2014). Zhou et al. (2014) menggunakan
elekroforesis zona kapiler dan kromatografi elektrokinetik misel untuk analisis
sidik jari gel tinta pena yang berwarna biru dan hitam. Analisis sidik jari
menggunakan KLT juga telah dikembangkan untuk mengidentifikasi,
mengautentikasi, dan membedakan tiga herbal (Curcuma longa, Curcuma
xanthorrhiza, dan Zingiber cassumunar) (Rafi et al. 2011). Rafi et al. (2015) juga
mengembangkan metode analisis sidik jari menggunakan KCKT untuk autentikasi
dan diskriminasi temu lawak dari kunyit. Metode analisis yang sama (KCKT)
telah digunakan juga oleh Tao et al. (2011) untuk menghasilkan sidik jari dan
penilaian kualitas dari umbi Gastrodia; Wang et al. (2012) untuk mendapatkan
sidik jari Epimedium wushanense dan Epimedium koreanum; Fang et al. (2015)
untuk analisis sidik jari Rhizoma chuanxiong (herbal Cina). Analisis sidik jari
menggunakan KCKT juga digunakan untuk penentuan simultan sepuluh senyawa
dalam Danhong (obat suntik Cina) (Liu et al. 2013). Liang et al. (2013)
menggunakan kromatografi cair kinerja ultra untuk analisis sidik jari
Chrysanthemum morifolium.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi muncul diawal tahun 1960-an, kemudian
mulai dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an. KCKT
merupakan teknik yang cocok untuk analisis senyawa kimia dengan berbagai
polaritas, BM tinggi, serta zat yang labil dan tidak mudah menguap. KCKT
termasuk salah satu teknik analisis yang banyak digunakan untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif dari komponen yang terdapat pada obat-obatan herbal,
tujuannya untuk mengevaluasi kualitas produk. KCKT populer karena sifatnya
yang fleksibel, baik dari segi sifat dapat memisahkan beragam komponen maupun
dari segi memiliki berbagai macam metode yang dapat digunakan, misalnya
KCKT fase normal, fase terbalik, penukar ion, dan lain-lain. Meskipun KCKT
mudah digunakan, ada banyak variabel yang menentukan pemisahan seperti
pelarut, fase stasioner, laju aliran, gradien, suhu, dan lain-lain (Gray 2000).
Pelarut yang biasa digunakan dalam KCKT sebagai fase gerak adalah air,
metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran (Sari 2010). Dalam KCKT, fase diam
berada dalam kolom analitik yang merupakan kolom utama dan tempat terjadinya
pemisahan. Pemisahan komponen kimia dalam sampel terjadi karena sampel

7
berinteraksi dengan fase gerak dan sebagian zat terlarut lainnya dalam sampel
berinteraksi dengan fase diam. Perbedaan interaksi tersebut menyebabkan masingmasing komponen kimia dalam sampel dapat dipisahkan dengan waktu retensi
yang berbeda. Kolom analitik yang paling banyak digunakan berukuran panjang
25 cm, diameter dalam 4.6 µm, dan dikemas dalam partikel 5 µm. Kolom analitik
yang berisi fase diam, jenisnya bervariasi tergantung kebutuhan, misalnya kolom
C8, C18, dan sianopropil. Dalam KCKT, kolom jenis C8 dan C18 yang paling sering
digunakan (Hendayana 2001). Analisis triterpenoid telah banyak dilakukan
dengan sistem KCKT fase terbalik dengan kondisi eksperimen menggunakan jenis
kolom C18, diantaranya oleh Schaneberg et al.(2002) dan Hashim et al. (2011).
Kromatografi fase terbalik dijalankan menggunakan fase gerak polar (misalnya
metanol-air) dan fase diam non polar (misalnya oktadesil-silika) (Sari 2010).
Pengembangan metode analisis KCKT dan validasinya merupakan elemen
penting dalam penemuan, pengembangan, dan pembuatan produk obat herbal.
Metode analisis menggunakan KCKT dikembangkan untuk mengidentifikasi
kualitas atau pemurnian senyawa. Langkah-langkah yang diperlukan dalam
mengembangkan suatu metode analisis menggunakan KCKT adalah mengetahui
tentang informasi sampel yang digunakan, mendefinisikan dengan jelas tujuan
dari pemisahan yang dilakukan, optimasi kondisi pemisahan sampel, melakukan
kalibrasi metode secara kualitatif dan kuantitatif, dan melakukan validasi metode
untuk menetapkan kriteria penerimaan suatu metode (Singh 2013). Kondisi
optimum KCKT juga harus menemukan keterpisahan (resolusi) yang baik dan
memungkinkan kuantifikasi analit dengan akurasi, presisi, dan sensitivitas yang
dapat diterima. Semakin tinggi resolusi dari sistem maka lebih selektif dan sensitif
(Bakes 2000).
Beberapa faktor yang menjadi parameter kritis dalam mengembangkan
suatu metode analisis menggunakan KCKT yaitu preparasi sampel, kondisi
analisis KCKT (seperti panjang gelombang, laju alir, dan fase gerak yang
digunakan), dan standarisasi (meliputi integrasi, panjang gelombang, konsentrasi
standar, dan respon faktor koreksi). Selama tahap pengembangan metode awal,
seluruh komponen individu harus diteliti dan diketahui sebelum dilakukannya
pengoptimalan metode secara keseluruhan. Hal ini bertujuan untuk mengevaluasi
kinerja metode dalam setiap komponen dan memudahkan pengoptimalan metode
keseluruhan. Alokasi waktu yang digunakan untuk setiap tahap juga diperhatikan,
untuk memastikan penggunaan waktu yang efisien. Komponen penting dalam
pengembangan metode KCKT yaitu persiapan sampel, kondisi analisis KCKT,
dan standarisasi. Evaluasi yang dapat dilakukan terhadap metode yang
dikembangkan adalah dengan mengetahui nilai dari setiap parameter validasi
(Singh 2013).

Evaluasi Kinerja Analitik
Evaluasi kinerja analitik adalah penilaian terhadap parameter tertentu
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita 2004). Hasil dari
evaluasi kinerja analitik dapat digunakan untuk menilai kualitas, keandalan dan
konsistensi hasil analisis. Dasar untuk validasi metode diantaranya penggunaan

8
peralatan yang sesuai dengan spesifikasi, bekerja sesuai dengan tahapan yang
benar, dan langkah kalibrasi yang memadai (Kalra 2011). Evaluasi dilakukan
setelah metode dioptimalkan dan stabil dan diverifikasi dengan cara pemeriksaan
berkala menggunakan bahan referensi yang stabil. Beberapa parameter yang
digunakan untuk evaluasi kinerja analitik, diantaranya selektifitas, linearitas,
ketelitian, ketepatan, limit deteksi (LD) dan limit kuantisasi (LK), dan kesesuaian
sistem (system suitability) (Singh 2013).
Kesesuaian sistem merupakan evaluasi pada sistem analisis yang akan
menunjukkan kinerja sistem memenuhi standar yang diperlukan. Pengujian
kesesuaian sistem secara kuantitatif dapat dihitung secara eksperimen dengan
beberapa parameter, seperti jumlah pelat teoretis, faktor kapasitas, waktu retensi,
luas puncak senyawa, resolusi, dan faktor ikutan. Semua parameter dinyatakan
dalam persentase simpangan baku relatif (%SBR). Parameter khas dari suatu
kesesuaian sistem adalah jumlah pelat teoretis 2000, faktor kapasitas 2, resolusi
antara 2 puncak 1.5, faktor ikutan 2, dan %SBR dari semua parameter
menunjukkan ≤5% (AOAC 2013).
Kemometrika
Kemometrika telah digunakan secara luas sejak tahun 1970-an untuk
menggambarkan penerapan analisis statistik terutama analisis multivariat dalam
data kimia. Kemometrika merupakan disiplin ilmu kimia untuk merancang atau
memilih prosedur pengukuran yang optimal dan memberikan informasi yang
relevan dalam menganalisis data dengan menggunakan matematika, statistik, dan
metode lain yang menggunakan logika. Dalam bidang kimia analitik,
kemometrika secara luas telah banyak diaplikasikan (Massart et al. 2003).
Penggunaan kemometrika biasanya ditemukan dalam analisis sidik jari,
yang merupakan metode yang sangat banyak digunakan untuk mengolah
informasi dari data kromatogram KCKT yang rumit. Analisis sidik jari merupakan
teknik analisis yang dikembangkan dengan tujuan kontrol kualitas (autentikasi,
identitas, mutu, dan reabilitas) suatu obat herbal yang berasal dari tumbuhan
(Rajkumar & Sinha 2010). Analisis sidik jari menggunakan suatu instrumen
kromatografi dari suatu obat herbal merupakan pola kromatografi beberapa
komponen kimia aktif farmakologis dan memiliki karakteristik kimia yang mirip
dari suatu ekstrak (Liang et al. 2004).
Aplikasi kemometrika dalam analisis sidik jari telah banyak yang
melaporkan, diantaranya Rafi et al. (2015) telah melaporkan kombinasi analisis
sidik jari KCKT dengan analisis diskriminan (AD) memberikan hasil yang sangat
baik untuk autentikasi dan diskriminasi spesies tumbuhan yang berkerabat dekat;
Bansal et al. (2013) telah menggunakan analisis kemometrika untuk standardisasi
obat herbal. Rachmawati (2012) juga menggunakan analisis komponen utama
(AKU) untuk pengelompokkan sampel berdasarkan asalnya pada kajian
metabolomik rimpang temu lawak menggunakan kromatografi cair-spektroskopi
massa.

9

3 METODE
Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Oktober 2015 sampai Juni 2016.
Bagan alir penelitian terdapat pada Lampiran 1. Tempat penelitian dilaksanakan di
Laboratium Pusat Studi Biofarmaka Tropika LPPM IPB.

Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan yaitu instrumen KCKT tipe LC-20A (Shimadzu
Tokyo, Jepang) dengan detektor larik diode, kolom Shim-pack VP-ODS C18 (150
mm × 4.6 mm i.d.,ukuran partikel 4.6 μm) (Shimadzu Tokyo, Jepang), membran
filter Whatman (ukuran pori 0.22 µm; PTFE; P/N E252, Buckinghamshire,
England), neraca analitik (Sartorius, Bradford, Jerman), sonikator (Branson,
Danbury, USA), peranti lunak XLSTAT versi 2016.06.20 (Addinsoft, New York,
USA), dan alat-alat kaca yang umum digunakan dalam labotarorium kimia.
Bahan-bahan yang digunakan antara lain sampel pegagan 3 BST, 4 BST, 5BST
yang berasal dari Kebun Percobaan Pusat Studi Biofarmaka Tropika LPPM IPB,
Bogor, pegagan yang berasal dari Kuningan, Sleman, dan Boyolali, antanan air
dari Nagrak Sukabumi, dan semanggi gunung dari Bogor, standar madekasosida
(87.5%), standar asiatikosida (88.8%), standar asam asiatat (92.6%), dan standar
asam madekasat (88.1%) (ChromaDex Inc. Santa Ana, CA, USA), metanol, dan
asetonitril HPLC grade (Merck, Darmstadt, Jerman), dan akuades.

Prosedur Percobaan dan Analisis Data
Preparasi Sampel dan Larutan Standar
Serbuk sampel ditimbang sebanyak 100 mg kemudian diekstrak dengan
metanol (5 mL) selama 1 jam pada suhu kamar dengan cara sonikasi. Selanjutnya
larutan sampel disaring menggunakan filter membran 0.22 µm dan ditepatkan
volumenya menjadi 10 mL menggunakan metanol sebelum di injeksikan ke dalam
sistem KCKT. Larutan stok dibuat dari standar madekasosida, asiatikosida, asam
madekasat, dan asam asiatat yang dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi
1000 µg/ mL. Kemudian dibuat deret standar pada masing-masing larutan dengan
6 konsentrasi berbeda dalam rentang konsentrasi 1-200 µg/ mL untuk
madekasosida, 1-250 µg/ mL untuk asiatikosida, 1-150 µg/ mL untuk asam
madekasat dan asam asiatat.
Peralatan dan Kondisi Kromatografi
KCKT yang digunakan adalah tipe LC-20A dengan detektor larik diode.
Kolom yang digunakan yaitu Shim-pack VP-ODS C18 (150 mm x 4.6 mm).
Optimasi kromatogram untuk analisis sidik jari dan kuantisasi empat senyawa
triterpenoid (madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam asitat) pada
pegagan diperoleh dengan pengoptimuman fase gerak sistem elusi gradien dengan
mengkombinasi eluen asetonitril (A) dan air (B), laju alir 1mL/ menit, suhu

10
kolom 40oC, dan panjang gelombang deteksi 206 nm. Selanjutnya, 20 µL sampel
diinjeksikan dengan sistem KCKT pada kondisi optimum analisis.
Evaluasi Kinerja Analitik
Evaluasi kinerja analitik untuk analisis kuantitatif yang dilakukan mengacu
pada AOAC (2013). Evaluasi kinerja analitik untuk penentuan simultan empat
senyawa triterpenoid (madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, dan asam
asiatat) dievaluasi dengan cara melakukan uji kesesuaian sistem, linearitas kurva
kalibrasi, LD, LK, ketelitian, ketepatan, dan stabilitas. Untuk analisis sidik jari
kromatografi, metode ini dievaluasi dengan parameter kedapatulangan dan
stabilitas yang dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (%SBR) dari waktu
retensi relatif (WRR) dan luas puncak relatif (LPR) dari pucak mayor (Gambar
3b). WRR dan LPR dihitung dengan puncak mayor nomor 4. Sampel yang
digunakan untuk evaluasi kinerja analitik adalah sampel dari daerah Bogor.
Analisis Data
Metode kemometrika yang digunakan untuk membuat model diskriminasi
pegagan sesuai usia tanam yaitu analisis diskriminan (AD) menggunakan peranti
lunak statistika XLSTAT versi 2016.06.20 (Addinsoft, New York, USA).

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Ekstraksi
Kondisi optimum untuk analisis sidik jari dan kuantifikasi empat senyawa
triterpenoid yaitu madekasosida, asiatikosida, asam madekasat dan asam asiatat
pada pegagan diawali dengan preparasi sampelnya. Sampel pegagan yang
digunakan untuk pengoptimuman kondisi ekstraksi dan KCKT berasal dari daerah
Bogor, Jawa Barat. Pegagan diekstraksi menggunakan metode sonikasi supaya
seluruh komponen kimia baik senyawa mayor atau minor akan terdeteksi pada
sidik jari kromatografi. Metode sonikasi dipilih karena waktu ekstraksi yang
cepat, sederhana, dapat memberikan jumlah komponen terekstrak lebih tinggi, dan
dapat meminimalisasir jumlah pelarut yang digunakan. Pelarut metanol digunakan
karena pelarut polar ini mampu mengekstrak lebih banyak komponen kimia.
Pengoptimuman kondisi ekstraksi yang dilakukan berupa pemilihan nisbah
sampel terhadap pelarut dan waktu ekstraksi. Kondisi optimum dievaluasi dari
jumlah puncak dan kandungan empat senyawa triterpenoid. Berdasarkan
percobaan yang telah dilakukan menunjukkan pemilihan nisbah sampel:pelarut
100 mg dalam 5 mL metanol dan waktu ekstraksi selama 60 menit memberikan
jumlah puncak yang lebih banyak dan intensitas puncak mayor (madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, dan asam asitat) yang paling tinggi dibandingkan
yang lainnya.

11
Pengoptimuman Kondisi KCKT
Pengoptimuman kondisi untuk analisis kuantitatif dan analisis sidik jari
kromatografi dilakukan untuk mendapatkan baseline dan pemisahan yang baik
dari analit yang diinginkan. Beberapa parameter yang dievaluasi dalam
pengoptimuman yaitu panjang gelombang deteksi dan komposisi fase gerak yang
digunakan. Jumlah puncak, resolusi masing-masing analit, dan waktu analisis total
juga dievaluasi untuk menentukan kondisi optimum KCKT. Laju alir yang
digunakan 1 mL/ menit.
Kromatogram larutan standar madekasosida, asiatikosida, asam madekasat,
dan asam asiatat dan kromatogram sampel, masing-masing ditunjukkan pada
Gambar 3. Pemisahan kromatografi optimum untuk analisis kuantitatif dan
analisis sidik jari diperoleh dengan elusi gradien 20-45% (A) selama 0-20 menit
dan 45-65% (A) selama 20-40 menit dan suhu kolom dipertahankan 40oC.
Kondisi tersebut memberikan nilai resolusi untuk madekasosida, asiatikosida,
asam madekasat dan asam asiatat, masing-masing lebih besar dari 1.5. Hal ini
menunjukkan metode yang dikembangkan dapat digunakan untuk kuantifikasi
keempat analit secara simultan, karena pemisahan setiap puncak sudah baik. Total
waktu analisis yang dibutuhkan lebih singkat untuk kuantifikasi keempat senyawa
triterpena yaitu sebesar 27 menit, dibandingkan metode-metode yang sudah ada
sebelumnya. Beberapa penelitian sebelumnya telah dilaporkan untuk memisahkan
empat senyawa triterpena tersebut (madekasosida, asiatikosida, asam madekasat
dan asam asiatat) dibutuhkan waktu analisis selama 30 menit (Rafamantanana et
al. 2009) dan 50 menit (Schaneberg et al. 2002), dan juga masih adanya
keterpisahan yang kurang baik dengan adanya tumpang tindih antara
madekasosida dan asiatikosida B (Rafamantanana et al. 2009). Panjang
gelombang deteksi maksimum yang dipilih adalah 206 nm karena pada panjang
gelombang ini dapat memberikan sensitivitas yang lebih tinggi dan intensitas
sinyal yang lebih baik untuk semua senyawa yang dipisahkan jika dibandingkan
dengan panjang gelombang yang lain.
Fase gerak yang digunakan pada sistem elusi gradien adalah asetonitril dan
air. Asetonitril dan air termasuk pelarut yang memiliki nilai UV cut-off yang
rendah (190 nm). Oleh karena itu, fase gerak ini sangat baik digunakan untuk
analisis yang memiliki sensitivitas tinggi pada panjang gelombang UV rendah
(206 nm), dan asetonitril memiliki viskositas yang lebih rendah sehingga
mengurangi tekanan balik sehingga dapat menghasilkan keterpisahan setiap
puncak yang baik dalam kromatogram. Selain itu, fase gerak asetonitril dapat
mengahasilkan baseline yang baik, jika dibandingkan dengan menggunakan fase
gerak lain seperti penambahan asam trifluoroasetat (TFA) atau metil ters-butil eter
(MTBE) (UV cut-off 210 nm) dalam fase gerak asetonitril atau air (Schaneberg et
al. 2002) atau penambahan asam fosfat (UV cut-off 220 nm) dalam fase gerak air
(Zhang et al. 2009) membuat baseline yang kurang baik, karena analisis sidik jari
dan kuantifikasi simultan madekasosida, asiatikosida, asam madekasat dan asam
asiatat adalah pada UV rendah 206 nm. Oleh karena itu, hasil optimasi dalam
penelitian ini digunakan fase gerak asetonitril dan air menunjukkan dasar yang
baik dan pemisahan analit yang sangat baik.

12

Waktu (menit)
Gambar 3 Kromatogram KCKT dari larutan standar (a) (madekasosida (1),
asiatikosida (4), asam madekasat (5), asam asiatat (6) dengan
konsentrasi masing-masing 100 µg/ mL), sampel pegagan (b) (UV 206
nm)
Evaluasi Kinerja Analitik
Evaluasi kinerja analitik untuk analisis kuantitatif madekasosida,
asiatikosida, asam madekasat, dan asam asiatat dievaluasi dengan cara
melakukan uji kesesuaian sistem, linearitas kurva kalibrasi, LD, LK,
ketelitian, ketepatan, dan stabilitas. Kesesuaian sistem dievaluasi untuk
mengetahui bahwa kinerja sistem telah memenuhi standar yang dibutuhkan.
Kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menginjeksikan 5 kali ulangan
standar campuran madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, asam asiatat
dengan konsentrasi 10 µg/ mL. Persentase simpangan baku relatif (%SBR)
dari waktu retensi, luas puncak, faktor kapasitas, faktor ikutan, dan jumlah
pelat teoretis dievaluasi untuk menentukan kesesuaian sistem (Lampiran 2).
%SBR untuk semua parameter yang diuji pada kesesuaian sistem diketahui
kurang dari 3,5% (Tabel 1) menunjukkan variasi yang rendah dalam
pemisahan madekasosida, asiatikosida, asam madekasat, asam asiatat dan
kinerja sistem telah memenuhi standar yang dibutuhkan karena %SBR yang
didapatkan