Pengembangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa untuk Penetapan Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dari Plasma Manusia dan Sediaan Tablet

(1)

TESIS

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK

PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN

PIRAZINAMID DARI PLASMA MANUSIA DAN SEDIAAN

TABLET

OLEH:

NERDY

NIM 107014007

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK

PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN

PIRAZINAMID DARI PLASMA MANUSIA DAN SEDIAAN

TABLET

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

NERDY

NIM 107014007

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

PERSETUJUAN TESIS

Nama Mahasiswa : Nerdy Nomor Induk Mahasiswa : 107014007

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Pengembangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa untuk Penetapan Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dari Plasma Manusia dan Sediaan Tablet

Tempat dan Tanggal Ujian Lisan Tesis : Medan, 21 Juli 2012 Menyetujui:

Komisi Pembimbing, Ketua,

Prof. Dr.rer.nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt. NIP 19530619 198303 1 001

Anggota,

Prof. Dr. Daryono Hadi Tjahjono, M.Sc., Apt. NIP 19650709 199203 1 001

Medan, Agustus 2012

Ketua Program Studi, Dekan,

Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 19540909 198201 1 001 NIP 19531128 198303 1 002

(4)

PENGESAHAN TESIS

Nama Mahasiswa : Nerdy Nomor Induk Mahasiswa : 107014007

Program Studi : Magister Farmasi

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji Tesis pada hari Sabtu tanggal 21, bulan Juli, tahun 2012

Mengesahkan: Tim Penguji Tesis

Ketua Tim Penguji : Prof. Dr.rer.nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt. Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. Daryono Hadi Tjahjono, M.Sc., Apt.

Prof. Dr. M. Timbul Simanjuntak, M.Sc., Apt. Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.

(5)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul “Pengembangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa untuk Penetapan Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dari Plasma Manusia dan Sediaan Tablet” yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:

1. Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTM&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K), selaku Rektor Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

2. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3. Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister Ilmu Farmasi pada Farmasi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan Magister Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

4. Bapak Prof. Dr.rer.nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., dan Bapak Prof. Dr. Daryono Hadi Tjahjono, M.Sc., Apt., sebagai komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, arahan, masukkan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran tulus dan ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian tesis ini.

5. Bapak Prof. Dr. Matheus Timbul Simanjuntak, M.Sc., Apt., dan Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., sebagai komisi penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukkan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin baik.

6. Bapak Prof. Dr.rer.nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., sebagai Kepala Laboratorium Penelitian beserta staf yang telah banyak memberikan bantuan sarana penelitian bagi penulis guna kelancaran bagi penulis dalam penelitian

7. Papa Phoa Tjeng In, Mama Lina dan Abang Nardo sebagai keluarga tercinta penulis yang banyak memberikan bantuan baik dalam bentuk moril dan materil bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian tesis ini.

8. Teman seperjuangan S1 angkatan 2007 khususnya peminatan Sains dan Teknologi Farmasi (terutama Martianus Perangin-Angin, Vintha Sari Uly, Jimmy Tessa, Syafridah, Darwin dan Meiva Amelia Lubis), teman

(6)

seperjuangan S2 angkatan 2010 dan 2011 (terutama Floriana Sundari Loung, Puji Lestari Wulandari dan Elysa) yang selalu mendukung penulis. Serta buat semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.

Medan, 21 Juli 2012 Penulis,

(Nerdy)

(7)

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN PIRAZINAMID DARI PLASMA

MANUSIA DAN SEDIAAN TABLET ABSTRAK

Obat-obat yang digunakan dalam pengobatan tuberkulosis dapat dibagi kedalam 2 kategori, yaitu: obat anti tuberkulosis primer dan obat anti tuberkulosis sekunder. Obat anti tuberkulosis primer lebih tinggi kemanjurannya dan lebih baik keamanannya dari obat anti tuberkulosis sekunder. Obat anti tuberkulosis primer adalah rifampisin, isoniazid, pirazinamid dan etambutol. Rifampisin, isoniazid dan pirazinamid merupakan kombinasi obat anti tuberkulosis.

Menurut Undang-Undang Republik Indonesia nomor 36 tahun 2009 tentang kesehatan pasal 105 ayat 1 bahwa sediaan farmasi yang berupa obat dan bahan baku obat harus memenuhi syarat Farmakope Indonesia atau buku standar lainnya. Pemantauan terapi obat perlu dilakukan untuk mengetahui bahwa kadar obat dalam tubuh berada pada rentang terapi.

Penetapan kadar rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet dapat dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi. Untuk mendapatkan hasil analisis kromatografi cair kinerja tinggi yang baik memerlukan optimasi. Penelitian yang dilaksanakan ini meliputi optimasi terhadap jenis campuran fase gerak, perbandingan fase gerak, laju alir fase gerak dan suhu oven kolom pada metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa. Penelitian ini diharapkan sebagai pengembangan metode yang dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet. Penelitian ini juga meliputi pengujian validasi yang dilaksanakan dengan beberapa pengujian seperti: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali, uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif, uji spesifitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi dan uji linearitas.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang telah dikembangkan dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet. Kondisi optimum yang diperoleh adalah jenis campuran fase gerak larutan asam format 0,1% dalam air destilasi ganda yang telah dimurnikan (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring nitrat selulosa 0,2 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit) dan larutan asam format 0,1% dalam metanol (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring politetraflouroetilen (PTFE) 0,5 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit) dengan laju alir fase gerak 0,5 mL/menit, pada perbandingan fase gerak 90%:10% hingga menit 3, dimana isoniazid dan pirazinamid telah terelusi (dan memisah), kemudian diubah menjadi perbandingan fase gerak menjadi 30%:70% pada menit 3,1 dan dipertahankan hingga rifampisin terelusi (hingga menit 10) serta suhu oven kolom 35o

Kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet memenuhi persyaratan uji validasi metode. Pengujian validitas metode meliputi uji akurasi dengan parameter

(8)

persentase perolehan kembali, uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif, uji spesifitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi dan uji linearitas. Dari hasil pemeriksaaan kadar sediaan tablet yang beredar di pasaran yang mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid diketahui bahwa sediaan tablet Rimcure 3 FDC® (P.T. Sandoz) memenuhi persyaratan Farmakope Amerika Serikat edisi ke-30 tahun 2007.

Kata kunci : Rifampisin, Isoniazid, Pirazinamid, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa, Pengembangan Metode, Optimasi, Validasi

(9)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY METHOD DEVELOPMENT FOR DETERMINATION

OF RIFAMPICIN, ISONIAZID AND PYRAZINAMIDE FROM HUMAN PLASMA AND TABLET PREPARATION

ABSTRACT

The drugs used in the treatment of tuberculosis can be divided into two categories, i.e.: primary anti-tuberculosis and secondary anti-tuberculosis. The primary anti-tuberculosis have a higher efficacy and better safety than those of secondary anti-tuberculosis drugs. Primary anti-tuberculosis drugs are rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol. In their use rifampicin, isoniazid and pyrazinamide are usually combined.

According to the Law of the Republic of Indonesia number 36 year 2009 on health of article 105 paragraph 1 that pharmaceutical preparation and pharmaceutical raw materials must meet the requirements set out by Indonesia Pharmacopoeia or other relevant standard. Therapeutic drug monitoring needs to be done to find out that the drug level in the body has to be within the therapeutic range.

The concentration of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in human plasma and tablet preparations can be determined by high performance liquid chromatographic method. To obtain good results of the high performance liquid chromatography analysis, the optimization of chromatographic conditions is essential. The research undertaken includes the optimization of the type of mobile phase, the composition of mobile phase, flow rate and column temperature of high performance liquid chromatography mass spectrometry. This research is expected to improve the method that can be used for the determination of a mixture of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in human plasma and tablet preparation. The study also includes validation procedure such as: the determination of accuracy by the recovery percentage parameter, the determination of precision by the relative standard deviation parameter, the determination of specificity, the determination of limit of detection, the determination of limit of quantitation and the determination of linearity.

The results showed that high performance liquid chromatography mass spectrometry method which has been developed in this study can be used for the determination of a mixture of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in human plasma and tablet preparation. Optimum conditions obtained for type of mobile phase was 0.1% formic acid solution in doubly distilled water that has been purified (after being mixed and then filtered through a cellulose nitrate membrane

filter 0.2 μm and sonicated for 30 minutes) and 0.1% formic acid solution in

methanol (after being mixed and then filtered through a polytetraflouroethylene

(PTFE) membrane filter 0.5 μm and sonicated for 30 minutes) with a flow rate 0.5

mL/min, the 90%:10% ratio up to 3 minutes, after isoniazid and pyrazinamide was eluted (and separate), then changed into 30%:70% ratio at 3.1 minutes and maintained until rifampicin eluted (up to 10 minutes) at column temperature 35o

The optimum conditions of high performance liquid chromatography mass spectrometry method is used for the determination of mixture of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in human plasma and tablet preparation meet the C.

(10)

requirements of the method validation test. The method validity testing included the accuracy test with recovery percentage parameter, the precision test with relative standard deviation parameter, the specificity test, the limit of detection test, the limit of quantitation test and the linearity test. From the results of quatitative determination of tablet preparation obtained from the marketplace that contain a mixture of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide known that tablet preparation Rimcure 3 FDC® (P.T. Sandoz) meets the requirements of the United States Pharmacopoeia 30th edition in 2007.

Key words : Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide, High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Method Development, Optimization, Validation

(11)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

PERSETUJUAN TESIS ... ii

PENGESAHAN TESIS ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... viii

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xvii

DAFTAR GAMBAR ... xx

DAFTAR LAMPIRAN ... xxiii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Kerangka Pemikiran Penelitian ... 4

1.3 Perumusan Masalah ... 7

1.4 Hipotesis ... 7

1.5 Tujuan Penelitian ... 8

1.6 Manfaat Penelitian ... 9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 10

2.1 Tuberkulosis ... 10

2.2 Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 10

2.2.1 Rifampisin ... 12

2.2.1.1 Pengunaan dan Cara Pemberian ... 13

(12)

2.2.1.3 Efek Samping ... 14

2.2.2 Isoniazid ... 14

2.2.2.1 Pengunaan dan Cara Pemberian ... 15

2.2.2.2 Farmakokinetika ... 15

2.2.2.3 Efek Samping ... 16

2.2.3 Pirazinamid ... 17

2.2.3.1 Pengunaan dan Cara Pemberian ... 17

2.2.3.2 Farmakokinetika ... 18

2.2.3.3 Efek Samping ... 18

2.3 Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 19

2.4 Spektrofotometri Infra Merah ... 24

2.5 Kromatografi ... 25

2.5.1 Kromatografi Cair ... 27

2.5.1.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 28

2.5.1.2 Pemisahan dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 28

2.5.1.3 Konsep Umum Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 30

2.5.1.3.1 Waktu Tambat (tR 2.5.1.3.2 Faktor Kapasitas (k’) ... 32

) ... 30

2.5.1.3.3 Selektivitas (α) ... 33

2.5.1.3.4 Efisiensi Kolom (N) ... 34

2.5.1.3.5 Resolusi (Rs 2.5.1.3.6 Faktor Ikutan (T ) ... 35

f) dan Faktor Asimetri (As 2.5.1.4 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 38

(13)

2.5.1.4.1 Wadah Fase Gerak

(Reservoir) ... 38

2.5.1.4.2 Pompa (Pump) ... 39

2.5.1.4.3 Tempat Injeksi Sampel (Injector) ... 39

2.5.1.4.4 Kolom (Column) ... 41

2.5.1.4.5 Detektor (Detector) ... 41

2.5.1.4.6 Perekam atau Rekorder (Recorder) ... 41

2.6 Validasi Metode ... 42

2.6.1 Akurasi (Kecermatan) ... 42

2.6.2 Presisi (Keseksamaan) ... 43

2.6.3 Spesifisitas (Selektifitas) ... 43

2.6.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 44

2.6.5 Linearitas ... 45

2.6.6 Rentang (Kisaran) ... 45

2.6.7 Kekuatan (Ketahanan) ... 46

2.6.8 Kekasaran (Ketangguhan) ... 46

BAB III METODE PENELITIAN ... 47

3.1 Alat ... 47

3.2 Bahan ... 49

3.3 Prosedur Penelitian ... 49

3.3.1 Penyiapan Bahan ... 49

3.3.1.1 Larutan Asam Format 0,1% dalam Air Destilasi Ganda yang telah Dimurnikan 49

3.3.1.2 Larutan Asam Format 0,1% dalam Metanol ... 49

3.3.1.3 Larutan Asam Asetat 1% dalam Air Destilasi Ganda yang telah Dimurnikan 50

(14)

3.3.1.4 Larutan Asam Asetat 1% dalam Metanol ... 50 3.3.1.5 Fase Gerak ... 50 3.3.1.6 Pembuatan Larutan Induk Baku

Rifampisin ... 51 3.3.1.7 Pembuatan Larutan Induk Baku

Isoniazid ... 51 3.3.1.8 Pembuatan Larutan Induk Baku

Pirazinamid ... 52 3.3.2 Prosedur Analisis ... 52

3.3.2.1 Identifikasi Baku Rifampisin, Baku Isoniazid dan Baku Pirazinamid dengan Spektrofotometer Infra Merah Fourier Transform (Fourier Transform Infra Red (FTIR)) ... 52 3.3.2.2 Penyiapan Alat Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi Spektrometri Massa ... 53 3.3.2.3 Penentuan Kondisi Optimum ... 53 3.3.2.4 Analisis Kualitatif Rifampisin,

Isoniazid dan Pirazinamid dalam Plasma Manusia dan Sediaan Tablet ... 55 3.3.2.5 Analisis Kuantitatif Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Sediaan Tablet ... 55 3.3.2.6 Analisis Secara Statistik ... 56 3.3.3 Validasi Metode Analisis Kuantitatif Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Plasma Manusia dan Sediaan Tablet ... 57 3.3.3.1 Pengujian Akurasi (Kecermatan)

Metode Analisis Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid ... 57 3.3.3.2 Pengujian Presisi (Keseksamaan)

Metode Analisis Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang Mengandung

(15)

Campuran Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid ... 61 3.3.3.3 Pengujian Linearitas Metode Analisis

Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang Mengandung Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid . 61 3.3.3.4 Pengujian Batas Deteksi dan Batas

Kuantitasi Metode Analisis Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 63 3.3.3.5 Pengujian Akurasi (Kecermatan)

Metode Analisis Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid . 64 3.3.3.6 Pengujian Presisi (Keseksamaan)

Metode Analisis Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid . 64 3.3.3.7 Pengujian Linearitas Metode Analisis

Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 65 3.3.3.8 Pengujian Batas Deteksi dan Batas

Kuantitasi Metode Analisis Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid ... 66 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 68

4.1 Identifikasi Baku Rifampisin, Baku Isoniazid dan Baku Pirazinamid dengan Spektrofotometer Infra Merah Fourier Transform (Fourier Transform Infra Red (FTIR)) ... 68 4.2 Penentuan Kondisi Optimum ... 75

4.2.1 Optimasi Jenis Campuran Fase Gerak dan

Perbandingan Fase Gerak ... 75 4.2.2 Optimasi Laju Alir Fase Gerak ... 78 4.2.3 Optimasi Suhu Oven Kolom ... 82

(16)

4.3 Analisis Kualitatif Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Plasma Manusia dan Sediaan Tablet ... 83 4.4 Analisis Kuantitatif Sediaan Tablet Rimcure 3 FDC®

4.5 Validasi Metode Analisis Kuantitatif Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dalam Plasma Manusia dan Sediaan Tablet ... 90

(P.T. Sandoz) yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 89

4.5.1 Pengujian Akurasi (Kecermatan) Metode Analisis Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang

Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 90 4.5.2 Pengujian Presisi (Keseksamaan) Metode Analisis

Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang

Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 97 4.5.3 Pengujian Spesifitas Metode Analisis Kuantitatif

Sampel Plasma Manusia yang Mengandung

Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid 98 4.5.4 Pengujian Linearitas Metode Analisis Kuantitatif

Sampel Plasma Manusia yang Mengandung

Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid 98 4.5.5 Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Metode Analisis Kuantitatif Sampel Plasma Manusia yang Mengandung Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 103 4.5.6 Pengujian Akurasi (Kecermatan) Metode Analisis

Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung

Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid 104 4.5.7 Pengujian Presisi (Keseksamaan) Metode Analisis

Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung

Campuran Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid 105 4.5.8 Pengujian Spesifitas Metode Analisis Kuantitatif

Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran

Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid ... 106 4.5.9 Pengujian Linearitas Metode Analisis Kuantitatif

Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran

(17)

4.5.10 Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Metode Analisis Kuantitatif Sediaan Tablet yang Mengandung Campuran Rifampisin, Isoniazid dan

Pirazinamid ... 111

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 113

5.1 Kesimpulan ... 113

5.2 Saran ... 114

(18)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Perubahan perbandingan fase gerak (USP XXX, 2007). ... 20

Tabel 2.2. Perubahan perbandingan fase gerak (Dorneanu, 2010). ... 21

Tabel 2.3. Perubahan perbandingan fase gerak (Dionex, 2010). ... 22

Tabel 2.1. Perubahan perbandingan fase gerak (Song, 2007). ... 24

Tabel 4.1. Hasil identifikasi sidik jari dari baku rifampisin (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (Moffat, et al., 2004). ... 70

Tabel 4.2. Hasil identifikasi gugus fungsi dan ikatan antar atom dari baku rifampisin (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (McMurry, 1993; Silverstein, et al., 1984). ... 70

Tabel 4.3. Hasil identifikasi sidik jari dari baku isoniazid (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (Moffat, et al., 2004). ... 72

Tabel 4.4. Hasil identifikasi gugus fungsi dan ikatan antar atom dari baku isoniazid (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (McMurry, 1993; Silverstein, et al., 1984). ... 72

Tabel 4.5. Hasil identifikasi sidik jari dari baku pirazinamid (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (Moffat, et al., 2004). ... 74

Tabel 4.6. Hasil identifikasi gugus fungsi dan ikatan antar atom dari baku pirazinamid (P.T. Indofarma) yang dibandingkan terhadap literatur (McMurry, 1993; Silverstein, et al., 1984). ... 74

Tabel 4.7. Perubahan perbandingan fase gerak pada laju alir 0,3 mL/menit. ... 79

Tabel 4.8. Perubahan perbandingan fase gerak pada laju alir 0,5 mL/menit. ... 79

Tabel 4.9. Perubahan perbandingan fase gerak pada laju alir 0,7 mL/menit. ... 80

(19)

Tabel 4.10. Data hasil perhitungan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari sediaan tablet Rimcure 3 FDC®

Tabel 4.11. Luas area baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku

pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 94 (P.T. Sandoz) setelah dilakukan uji statistik. ... 90

Tabel 4.12. Luas area baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku

pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 95 Tabel 4.13. Luas area baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam

pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 96 Tabel 4.14. Data hasil pengujian persentase perolehan kembali

(recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku

pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 97 Tabel 4.15. Luas area baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam plasma

manusia pada berbagai konsentrasi untuk pengujian

linearitas. ... 100 Tabel 4.16. Luas area baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam plasma

manusia pada berbagai konsentrasi untuk pengujian

linearitas. ... 101 Tabel 4.17. Luas area baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma

manusia pada berbagai konsentrasi untuk pengujian

linearitas. ... 102 Tabel 4.18. Data hasil pengujian persentase perolehan kembali

(recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dari tablet Rimcure 3 FDC® (P.T. Sandoz) dengan metode penambahan bahan baku

(20)

Tabel 4.19. Luas area baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai

konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 108 Tabel 4.20. Luas area baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam campuran

air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 109 Tabel 4.21. Luas area baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam

campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai

(21)

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1.1. Skema hubungan antara variabel bebas dan variabel

terikat pada sistem kromatografi cair kinerja tinggi. ... 6

Gambar 2.1. Rumus struktur rifampisin. ... 12

Gambar 2.2. Rumus struktur isoniazid. ... 14

Gambar 2.3. Rumus struktur pirazinamid. ... 17

Gambar 2.4. Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi didalam kolom kromatografi cair kinerja tinggi (Meyer, 2004). ... 29

Gambar 2.5. Kromatogram puncak tunggal yang diperoleh dari analisis kromatografi cair kinerja tinggi (Ornaf dan Dong, 2005). ... 31

Gambar 2.6. Kromatogram dua puncak yang diperoleh dari analisis kromatografi cair kinerja tinggi (Meyer, 2004). ... 31

Gambar 2.7. Kromatogram hasil analisis kromatografi cair kinerja tinggi dengan berbagai selektifitas dan efisiensi (Kazakevich dan LoBrutto, 2007). ... 34

Gambar 2.8. Bentuk puncak kromatogram (Meyer, 2004). ... 36

Gambar 2.9. Pengukuran derajat asimetris puncak (Dolan, 2003). ... 37

Gambar 2.10. Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi (McMaster, 2007). ... 38

Gambar 2.11. Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual (manual injector) (Meyer, 2004). ... 40

Gambar 4.1. Spektrum infra merah baku rifampisin (P.T. Indofarma). ... 69

Gambar 4.2. Spektrum infra merah rifampisin dari literature (Dibbern, et al., 2002). ... 69

Gambar 4.3. Spektrum infra merah baku isoniazid (P.T. Indofarma). 71

Gambar 4.4. Spektrum infra merah isoniazid dari literature (Dibbern, et al., 2002). ... 71

(22)

Gambar 4.5. Spektrum infra merah baku pirazinamid (P.T.

Indofarma). ... 73 Gambar 4.6. Spektrum infra merah pirazinamid dari literatur

(Dibbern, et al., 2002). ... 73 Gambar 4.7. Kromatogram hasil analisis campuran baku rifampisin

(P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) serta data hasil

pendeteksian spektrometri massa dengan jenis

pendeteksian pemindaian (scanning) dari setiap puncak yang terdeteksi. ... 86 Gambar 4.8. Kromatogram hasil analisis plasma manusia yang

mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid serta data hasil pendeteksian spektrometri massa dengan jenis pendeteksian pemindaian (scanning) dari setiap puncak yang terdeteksi. ... 88 Gambar 4.9. Kromatogram hasil analisis sediaan tablet yang

mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dan data hasil pendeteksian spektrometri massa dengan jenis pendeteksian pemindaian

(scanning)) dari setiap puncak yang terdeteksi. ... 89 Gambar 4.10. Kromatogram hasil pendeteksian campuran baku

rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T.

Indofarma) dalam plasma manusia. ... 93 Gambar 4.11. Kurva kalibrasi baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam

campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 94 Gambar 4.12. Kurva kalibrasi baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam

campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T.

(23)

Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 95 Gambar 4.13. Kurva kalibrasi baku pirazinamid (P.T. Indofarma)

dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 96 Gambar 4.14. Kromatogram hasil pendeteksian campuran baku

rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia pada berbagai konsentrasi untuk

pengujian linearitas. ... 100 Gambar 4.15. Kurva kalibrasi baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam

plasma manusia pada berbagai konsentrasi untuk

pengujian linearitas. ... 101 Gambar 4.16. Kurva kalibrasi baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam

plasma manusia pada berbagai konsentrasi untuk

pengujian linearitas. ... 102 Gambar 4.17. Kurva kalibrasi baku pirazinamid (P.T. Indofarma)

dalam plasma manusia pada berbagai konsentrasi untuk

pengujian linearitas. ... 103 Gambar 4.18. Kromatogram hasil pendeteksian campuran baku

rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 108 Gambar 4.19. Kurva kalibrasi baku rifampisin (P.T. Indofarma) dalam

campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai

konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 109 Gambar 4.20. Kurva kalibrasi baku isoniazid (P.T. Indofarma) dalam

campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai

konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 110 Gambar 4.21. Kurva kalibrasi baku pirazinamid (P.T. Indofarma)

dalam campuran air dan metanol (50%:50%) pada berbagai konsentrasi untuk pengujian linearitas. ... 111

(24)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Gambar seperangkat alat kromatografi cair kinerja

tinggi spektrometri massa (KCKTSM). ... 119 Lampiran 2. Gambar seperangkat alat spektrofotometer infra merah

(Shimadzu). ... 121 Lampiran 3. Gambar alat pendestilasi ganda air (Aquatron). ... 122 Lampiran 4. Gambar alat pemurni air (Elga). ... 123 Lampiran 5. Gambar alat neraca analitik (Boeco). ... 124 Lampiran 6. Gambar alat pompa vakum (Boeco) dan penyangga

membran penyaring (Whatman). ... 125 Lampiran 7. Gambar alat pompa vakum (Gast) dan penyangga

membran penyaring (Whatman). ... 126 Lampiran 8. Gambar alat membran penyaring nitrat selulosa 0,2 µm

(ukuran pori) 47 mm (diameter) (Whatman); membran penyaring politetrafluoroetilen 0,5 µm (ukuran pori) 47 mm (diameter) (Whatman); membran penyaring

politetrafluoroetilen 0,2 µm (ukuran pori) 25 mm

(diameter) (Whatman) serta syringe 5 mL (Terumo). ... 127 Lampiran 9. Gambar alat pembersih ultrasonik (Branson) dan alat

pembersih ultrasonik (Kudos). ... 130 Lampiran 10 Gambar dan spesifikasi tablet Rimcure 3 FDC®

Lampiran 11. Kromatogram rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dengan menggunakan kombinasi fase gerak yang terdiri dari air destilasi ganda dan metanol dengan

perbandingan fase gerak 10%:90%; 30%:70%;

50%:50%; 70%:30%; 90%:10%. ... 132 (P.T. Sandoz). ... 131

Lampiran 12. Kromatogram rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dengan menggunakan kombinasi fase gerak yang terdiri dari larutan asam format 0,1% dalam air destilasi ganda yang telah dimurnikan dan larutan asam format 0,1% dalam metanol dengan perbandingan fase gerak

(25)

Lampiran 13. Kromatogram rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dengan menggunakan kombinasi fase gerak yang terdiri dari larutan asam asetat 1% dalam air destilasi ganda yang telah dimurnikan dan larutanasam asetat 1% dalam metanol dengan perbandingan fase gerak 10%:90%;

30%:70%; 50%:50%; 70%:30%; 90%:10%. ... 144 Lampiran 14. Kromatogram optimasi laju alir fase gerak. ... 150 Lampiran 15. Kromatogram optimasi suhu oven kolom. ... 152 Lampiran 16. Perhitungan koefisien korelasi dan persamaan regresi

untuk baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan bakupirazinamid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%) untuk pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku

pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 154 Lampiran 17. Perhitungan koefisien korelasi dan persamaan regresi

untuk baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia untuk pengujian

linearitas. ... 159 Lampiran 18. Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi untuk

baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 163 Lampiran 19. Perhitungan koefisien korelasi dan persamaan regresi

untuk baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol

(50%:50%). ... 166 Lampiran 20. Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi untuk

baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam campuran air dan metanol (50%:50%). ... 170 Lampiran 21. Perhitungan penimbangan tablet Rimcure 3 FDC® (P.T.

Sandoz) pada penentuan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang sebenarnya dalam tablet Rimcure 3 FDC®

Lampiran 22. Contoh perhitungan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada penentuan kadar

(26)

campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang sebenarnya dalam tablet Rimcure 3 FDC®

Lampiran 23. Contoh Perhitungan penentuan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz). ... 175

Lampiran 24. Data hasil rekapitulasi dari kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang sebenarnya dalam tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz). ... 177

Lampiran 25. Analisis data secara statistik untuk mencari kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang sebenarnya dalam tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz). ... 179

Lampiran 26. Perhitungan kadar campuran baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) yang sebenarnya dalam plasma manusia pada penentuan perolehan kembali. .... 184

(P.T. Sandoz). ... 180

Lampiran 27. Contoh perhitungan pengujian persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia pada rentang spesifik 100%. ... 188 Lampiran 28. Data hasil perhitungan pengujian persentase perolehan

kembali (recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma manusia. ... 190 Lampiran 29. Analisis data statistik persentase perolehan kembali

(recovery percentage (% recovery)) baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) dalam plasma

manusia. ... 192 Lampiran 30. Perhitungan penimbangan pada penentuan persentase

perolehan kembali campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada berbagai rentang spesifik dari tablet Rimcure 3 FDC®

Lampiran 31. Perhitungan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang sebenarnya pada penentuan persentase perolehan kembali campuran rifampisin,

(P.T. Sandoz) dengan metode

(27)

isoniazid dan pirazinamid pada berbagai rentang spesifik dari tablet Rimcure 3 FDC®

Lampiran 32. Perhitungan kadar campuran baku rifampisin (P.T. Indofarma), baku isoniazid (P.T. Indofarma) dan baku pirazinamid (P.T. Indofarma) yang sebenarnya pada penentuan persentase perolehan kembali campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada berbagai rentang spesifik dari tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz) dengan metode penambahan baku sebelum penambahan baku. ... 199

Lampiran 33. Contoh perhitungan persentase perolehan kembali campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada rentang spesifik 100% dari tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz) dengan metode penambahan baku. ... 203

Lampiran 34. Data hasil perhitungan persentase perolehan kembali campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada berbagai rentang spesifik dari tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz) dengan metode penambahan baku. ... 207

Lampiran 35. Analisis data statistik persentase perolehan kembali campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid pada berbagai rentang spesifik persentase perolehan kembali dari tablet Rimcure 3 FDC

(P.T. Sandoz) dengan metode penambahan baku. ... 210

Lampiran 36. Sertifikat analisis baku rifampisin (P.T. Indofarma). ... 215 (P.T. Sandoz) dengan metode penambahan baku. ... 212

Lampiran 37. Sertifikat analisis baku isoniazid (P.T. Indofarma). ... 216 Lampiran 38. Sertifikat analisis baku pirazinamid (P.T. Indofarma). ... 217 Lampiran 39. Daftar nilai distribusi t ... 218

(28)

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN PIRAZINAMID DARI PLASMA

MANUSIA DAN SEDIAAN TABLET ABSTRAK

(29)

Kata kunci : Rifampisin, Isoniazid, Pirazinamid, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa, Pengembangan Metode, Optimasi, Validasi

(30)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY METHOD DEVELOPMENT FOR DETERMINATION

OF RIFAMPICIN, ISONIAZID AND PYRAZINAMIDE FROM HUMAN PLASMA AND TABLET PREPARATION

ABSTRACT

filter 0.2 μm and sonicated for 30 minutes) and 0.1% formic acid solution in

methanol (after being mixed and then filtered through a polytetraflouroethylene

(PTFE) membrane filter 0.5 μm and sonicated for 30 minutes) with a flow rate 0.5

(31)

Key words : Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide, High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Method Development, Optimization, Validation

(32)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tuberkulosis hingga kini masih jadi masalah kesehatan utama di dunia. Berbagai pihak mencoba bekerja bersama untuk memeranginya. Bahkan penyakit ini akhirnya “mampu” menggalang dana dari beberapa tokoh dunia seperti Bill Gates dan George Soros, sehingga terbentuk GF ATM (global fund against human immuno deficiency virus

acquired immuno deficiency syndrome, tuberculosis, and malaria) yang juga diterima oleh program penanggulangan tuberkulosis di negara Indonesia (Aditama, 2006).

Obat anti tuberkulosis sekunder adalah asam para amino salisilat, etionamid, tioacetazon, fluorokuinolon, aminoglikosida, kapreomisin, sikloserin, penghambat beta laktam, klaritromisin, rifabutin, linezolid, amikasin dan lain-lain. Pengobatan dengan obat anti tuberkulosis sekunder memerlukan waktu yang lebih lama, mengandung risiko efek samping yang lebih berat, sehingga ancaman ketidakpatuhan mengikuti pengobatan adalah tinggi. Obat anti tuberkulosis sekunder belum dapat menandingi keampuhan pasangan obat anti tuberkulosis primer, seperti: rifampisin dan isoniazid. Obat rifampisin bersifat bakterisid

(33)

terhadap kuman yang dorman, sedangkan isoniazid bersifat bakterisid terhadap kuman pada fase pembelahan. Pengobatan dengan obat anti tuberkulosis sekunder menghasilkan konversi sputum setelah 4-7 bulan, dilanjutkan selama minimal 18 bulan dan jauh lebih lama dari pengobatan dengan menggunakan isoniazid dan rifampisin (Muchtar, 2006).

Obat dalam bentuk kombinasi sering digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk diantaranya penyakit infeksi. Rifampisin, isoniazid dan pirazinamid merupakan kombinasi obat anti tuberkulosis. Pengobatan tuberkulosis sering dikombinasi dengan baik sebagai formulasi kombinasi dosis tetap (fixed dose combination (FDC)) maupun diberikan dalam bentuk sediaan yang terpisah secara bersamaan atau sekaligus (Pramudianto dan Evaria, 2010).

Sediaan tablet dalam kombinasi rifampisin, isoniazid dan pirazinamid terdapat di pasaran, selain itu juga terdapat dalam bentuk sediaan tunggal (Pramudianto dan Evaria, 2010). Menurut Undang-Undang Republik Indonesia nomor 36 tahun 2009 tentang kesehatan pasal 105 ayat 1 bahwa sediaan farmasi yang berupa obat dan bahan baku obat harus memenuhi syarat Farmakope Indonesia atau buku standar lainnya. Persyaratan kadar untuk sediaan tablet yang mengandung kombinasi rifampisin, isoniazid dan pirazinamid tidak tertera pada Farmakope Indonesia. Akan tetapi dalam Farmakope Amerika Serikat edisi ke-30 (United States Pharmacopoeia) tahun 2007 tertera bahwa sediaan tablet rifampisin, isoniazid dan pirazinamid mengandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% jumlah rifampisin (C43H58N4O12), isoniazid (C6H7N3O) dan pirazinamid (C5H5N3O) yang tertera pada etiket.

(34)

Pemantauan terapi obat (therapeutics drug monitoring (TDM)) perlu dilakukan untuk mengetahui bahwa kadar obat dalam tubuh berada pada rentang terapi. Adanya kemungkinan terjadinya interaksi obat anti tuberkulosis dengan obat lain pada pasien pengguna obat anti tuberkulosis dan penggunaan obat anti tuberkulosis pada pasien yang memiliki respon yang lambat terhadap obat anti tuberkulosis akan dapat menurunkan efektivitas terapi dari obat anti tuberkulosis. Sehingga dari hal-hal diatas maka perlu dilakukan pemantauan terapi obat (therapeutics drug monitoring (TDM)) pada pengobatan tuberkulosis (Peloquin, 2002).

Penetapan kadar rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet dapat dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi. Metode kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai beberapa keuntungan dibanding metode analisis lain, diantaranya: kolom dapat digunakan kembali, memiliki berbagai jenis detektor, waktu analisis umumnya relatif singkat, ketepatan yang relatif tinggi, ketelitian yang relatif tinggi dan dapat digunakan untuk menganalisis kebanyakan sebagian besar senyawa kimia (Meyer, 2004).

Upaya untuk mendapatkan hasil analisis kromatografi cair kinerja tinggi yang baik memerlukan optimasi. Tujuan optimasi metode kromatografi cair kinerja tinggi adalah untuk memperoleh pemisahan yang lebih baik, analisis yang lebih cepat, meningkatkan sensitifitas dan menghemat biaya. Optimasi dilakukan terhadap beberapa variabel, diantaranya: fase gerak (mobile phase), yakni: perbandingan fase gerak, kecepatan alir fase gerak maupun optimasi terhadap fase diam (stationary phase) atau kolom. Adapun optimasi yang paling sederhana dan sering dilakukan, yaitu: terhadap perbandingan fase gerak dan laju alir fase gerak

(35)

(Kromidas, 2006). Perubahan perbandingan fase gerak dan laju alir (flow rate) dapat mempengaruhi waktu analisis, tekanan dan efisiensi kolom (Meyer, 2004; Ahuja dan Dong, 2005; Snyder, 1979).

Berdasarkan hal tersebut diatas, penulis tertarik untuk melakukan pengembangan terhadap metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang akan digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet. Penelitian yang akan dilaksanakan ini akan meliputi optimasi terhadap beberapa parameter dari metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang diharapkan kondisi optimum yang diperoleh akan dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet. Optimasi dilakukan terhadap jenis campuran fase gerak, perbandingan fase gerak, laju alir fase gerak dan suhu oven kolom.

Upaya untuk menguji validitas dari metode ini dilakukan pengujian validasi yang dilaksanakan dengan beberapa pengujian seperti: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)), uji spesifitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi dan uji linearitas (Rohman, 2009).

1.2 Kerangka Pemikiran Penelitian

Pada penelitian yang akan dilaksanakan ini terdapat dua Variabel (dapat dilihat pada Gambar 1.1), yaitu:

(36)

• Jenis campuran fase gerak.

Optimasi pada berbagai jenis campuran fase gerak, yakni:

o Air destilasi ganda (yang telah dimurnikan, disaring melalui membran penyaring nitrat selulosa 0,2 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit) dan metanol (yang disaring melalui membran penyaring politetraflouroetilen

o Larutan asam format 0,1% dalam air destilasi ganda yang telah dimurnikan (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring

(PTFE) 0,5 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit).

nitrat selulosa 0,2 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit) dan larutan asam format 0,1% dalam metanol (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring politetraflouroetilen

o Larutan asam asetat 1% dalam air destilasi ganda yang telah dimurnikan (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring

(PTFE) 0,5 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit).

nitrat selulosa 0,2 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit) dan larutan asam asetat 1% dalam metanol (setelah dicampur kemudian disaring melalui membran penyaring politetraflouroetilen

• Perbandingan fase gerak.

(PTFE) 0,5 µm dan diawaudarakan/disonikasi selama 30 menit).

Optimasi pada berbagai perbandingan fase gerak, yakni: 10%:90%, 30%:70%, 50%:50%, 70%:30% dan 90%:10%.

(37)

• Laju alir fase gerak.

Optimasi pada laju alir fase gerak, yakni: 0,3 mL/menit, 0,5 mL/menit dan 0,7 mL/menit.

• Suhu oven kolom.

Optimasi pada suhu oven kolom, yakni: 30oC, 35oC dan 40o 2. Variabel terikat.

Kromatogram (resolusi, lempeng teoritikal, tinggi setara dengan lempeng teoritikal, faktor ikutan, faktor asimetri dan waktu tambat).

Gambar 1.1. Skema hubungan antara variabel bebas dan variabel terikat pada sistem kromatografi cair kinerja tinggi.

(38)

1.3 Perumusan Masalah

1. Apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet?

2. Apakah kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet memenuhi persyaratan uji validasi metode?

3. Apakah kadar sediaan tablet yang mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang ditetapkan dengan kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa memenuhi persyaratan Farmakope Amerika Serikat edisi ke-30 (United States Pharmacopoeia) tahun 2007?

1.4 Hipotesis

1. Metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet.

2. Kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet memenuhi persyaratan uji validasi metode.

3. Kadar sediaan tablet yang beredar di pasaran yang mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid yang ditetapkan dengan kondisi

(39)

optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa memenuhi persyaratan Farmakope Amerika Serikat edisi ke-30 (United States Pharmacopoeia) tahun 2007.

1.5 Tujuan Penelitian

1. Melakukan pengembangan metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa, sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet.

2. Melakukan optimasi fase gerak (jenis campuran fase gerak, perbandingan fase gerak, laju alir fase gerak) sehingga diperoleh kondisi yang optimum dari metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet.

3. Menentukan validitas kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa yang digunakan untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia dan sediaan tablet.

4. Mengetahui kesesuaian kadar sediaan tablet yang beredar di pasaran yang mengandung campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dengan persyaratan Farmakope Amerika Serikat edisi ke-30 (United States Pharmacopoeia) tahun 2007.

(40)

1.6 Manfaat Penelitian

Diharapkan metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa dapat digunakan sebagai metode alternatif pada rumah sakit untuk penetapan kadar campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dari plasma manusia secara simultan. Disamping itu diharapkan metode kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa juga dapat digunakan sebagai metode alternatif bagi Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) serta industri obat untuk penetapan kadar sediaan yang mengandung campuran rifampisin dan/atau isoniazid dan/atau pirazinamid secara simultan.

(41)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1Tuberkulosis

Tuberkulosis merupakan suatu penyakit yang terutama disebabkan oleh infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis, tetapi juga disebabkan oleh karena infeksi Mycobacterium bovis atau Mycobacterium africanum. Infeksi awal biasanya tanpa gejala (asymptomatic) dan lebih dari 95% tubuh manusia memiliki imunitas. Akan tetapi imunitas tidak cukup kuat untuk melakukan eradikasi terdahap basil tuberkulosis dan basil ini dapat memberikan peningkatan terhadap infeksi secara progresif (cepat). Jika infeksi terjadi selama 2 tahun (dihitung terhadap infeksi awal) maka penyakit tuberkulosis akan muncul. Anak-anak dan pasien yang memiliki sistem kekebalan yang lemah akan semakin memudahkan meningkatnya resiko perkembangan basil tuberkulosis. Manifestasi yang sering dijumpai dari tuberkulosis adalah penyakit paru-paru. Pasien biasanya menunjukkan gejala batuk, demam, berkeringat dimalam hari dan penurunan berat badan (Sweetman, 1999).

2.2 Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

Tuberkulosis memerlukan pengobatan dengan tiga sampai lima jenis obat yang berbeda yang diberikan secara bersama-sama (sekaligus), tergantung kepada kategori pasiennya. Sediaan obat anti tuberkulosis ini dapat diberikan dalam formulasi obat tunggal (dalam sediaan yang berbeda-beda) atau diberikan dalam formulasi kombinasi dosis tetap (fixed dose combination (FDC)) yang mana dua

(42)

atau lebih obat anti tuberkulosis berada dalam perbandingan tetap (perbandingan tertentu) dalam formulasi yang sama. Pihak organisasi kesehatan dunia (world health organization (WHO)) dan perkumpulan internasional yang melawan penyakit tuberkulosis dan paru-paru (international union against tuberculosis and lung disease (IUATLD)) menyarankan agar menghindari penggunaan sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi obat tunggal (dalam sediaan yang berbeda-beda) dan menyarankan penggunaan sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi kombinasi dosis tetap (fixed dose combination (FDC)) sebagai pengobatan utama untuk tuberkulosis (WHO, 1999).

Merujuk kepada ketentuan organisasi kesehatan dunia (world health organization (WHO)), 1999, beberapa latar belakang atau alasan dari penggunaan sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi kombinasi dosis tetap (fixed dose combination (FDC)) adalah:

• Penggunaan obat monoterapi dalam pengobatan tuberkulosis dihindari, karena beresiko untuk terjadinya resistensi mikobakterium. Dengan penggunaan sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi kombinasi dosis tetap maka resistensi mikobakterium akan dihindari.

• Peresepan dan pemberian obat yang lebih mudah, kepatuhan pasien lebih meningkat (karena obat berada dalam satu sediaan).

• Distribusi dan manajemen stok obat yang lebih mudah.

• Biaya sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi kombinasi dosis tetap adalah sama dan bahkan lebih rendah dari jumlah biaya penggunaan sediaan obat anti tuberkulosis dalam formulasi obat tunggal (dalam sediaan yang berbeda-beda).

(43)

• Biaya registrasi dan pajak pada beberapa negara cukup tinggi. Sehingga bila obat anti tuberkulosis berada dalam formulasi kombinasi dosis tetap (dalam satu sediaan) akan menurunkan biaya.

2.2.1 Rifampisin Rumus struktur :

NH OH

N N

N O

Η ΗΟ

OH O

Gambar 2.1. Rumus struktur rifampisin.

Nama Kimia : 5, 6, 9, 17, 19, 21-Heksahidroksi-23-metoksi-2, 4, 12, 16, 18, 20, 22-heptametil-8 [N-(4-metil-1-piperazinil) formimidoil]-2, 7-(epoksipentadeka [1, 11, 13] trienimino) nafto [2, 1-b] furan- 1, 11-(2H)-dion-21-asetat.

Sinonim : Rifampicinum, Rifampin, Rivalzadin, 3-[{(4-Metil-1-piperazinil) imino} metil] rifamisin.

Rumus Molekul : C43H58N4O Berat Molekul : 822,95.

(44)

Pemerian : Serbuk hablur, coklat merah.

Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air, sukar larut dalam etanol, eter dan aseton, mudah larut dalam kloroform, larut dalam etil asetat dan dalam metanol (Depkes RI, 1995; Sweetman, 1999).

2.2.1.1 Penggunaan dan Cara Pemberian

Rifampisin adalah kelompok antimikobakterial dan digunakan untuk pengobatan berbagai jenis infeksi. Sering digunakan dalam bentuk kombinasi dengan antibakterial lainnya untuk menghindari resistensi dan untuk pengobatan tuberkulosis. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 600 mg per hari melalui mulut pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak diberikan dosis 10 mg/kg hingga 20 mg/kg per hari dengan batas maksimum 600 mg per hari (Sweetman, 1999).

2.2.1.2 Farmakokinetika

Rifampisin segera diabsorbsi dari saluran pencernaan. Konsentrasi maksimum obat dalam plasma adalah 7 µg/mL sampai 24 µg/mL setelah 2 jam sampai 4 jam pemberian dosis 600 mg. Hal ini dapat berbeda antara individu yang satu dengan individu yang lainnya. Rifampisin berada 80% dalam protein plasma. Waktu paruh rifampisin berkisar antara 2 jam sampai 5 jam, dengan waktu paruh yang lebih pendek (1 jam sampai 3 jam) pada penggunaan 2 minggu pertama karena rifampisin menginduksi metabolisme terhadap rifampisin itu sendiri. Rifampisin secara cepat dimetabolisme di hati menjadi 25-O-deasetilrifampisin. Deasetilrifampisin diserap kembali ke saluran cerna dan meningkatkan ekskresi

(45)

melalui feses, tetapi siklus enterohepatik tetap berjalan. Sekitar 60% obat diekskresikan melalui feses sedangkan 30% obat diekskresikan melalui urin, setengah bagian tersebut diekskresikan dalam waktu 24 jam. Metabolit formilrifampisin juga diekskresikan melalui urin. Pada pasien gangguan ginjal waktu paruh rifampisin menjadi lebih panjang dari normalnya (Sweetman, 1999; Peloquin, 2002).

2.2.1.3 Efek Samping

Efek samping dari penggunaan rifampisin adalah gangguan saluran cerna (anoreksia, diare, mual dan muntah), gangguan darah (trombositopenia, eosinofilia, leukopenia dan anemia), gangguan saraf (sakit kepala), udema dan perubahan warna pada urin, feses, keringat, air liur, dahak, air mata dan cairan tubuh lainnya menjadi jingga hingga merah (Sweetman, 1999).

2.2.2 Isoniazid Rumus struktur :

N H

NH₂ O

Gambar 2.2. Rumus struktur isoniazid. Nama Kimia : Asam isonikotinat hidrazida.

Sinonim : Isoniazidum, INH, INAH, Isonikotinoilhidrazin, Isonikotinilhidrazida, Isonikotinilhidrazin, Tubazid.

(46)

Rumus Molekul : C6H7N3O Berat Molekul : 137,14.

Pemerian : Hablur putih atau tidak berwarna atau serbuk hablur putih, tidak berbau, perlahan-lahan dipengaruhi oleh udara dan cahaya. Kelarutan : Mudah larut dalam air, agak sukar larut dalam etanol, sukar larut

dalam kloroform dan dalam eter, praktis tidak larut dalam benzena (Depkes RI, 1995; Sweetman, 1999).

2.2.2.1 Penggunaan dan Cara Pemberian

Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis. Sering digunakan dalam bentuk kombinasi. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 300 mg per hari melalui mulut pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi, yakni: 5 mg/kg per hari (menurut Organisasi Kesehatan Dunia (World Health Organization/WHO)), 10 mg/kg per hari (di Inggris (United Kingdom/UK)) dan 10 mg/kg hingga 15 mg/kg per hari (di Amerika Serikat (United States of America/USA)) dengan semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari (Sweetman, 1999).

2.2.2.2 Farmakokinetika

Isoniazid segera diabsorbsi dari saluran pencernaan. Konsentrasi maksimum obat dalam plasma adalah 3 µg/mL sampai 7 µg/mL setelah 1 jam sampai 2 jam pemberian dosis 300 mg. Waktu paruh isoniazid berkisar antara 1 jam sampai 6 jam, dengan waktu paruh yang lebih pendek pada individu yang memiliki

(47)

asetilator yang cepat. Rute metabolik primer adalah asetilasi dari isoniazid menghasilkan asetilisoniazid oleh N-asetiltransferase yang ditemukan dalam hati dan usus halus. Asetilisoniazid kemudian dihidrolisis menjadi asam isonikotinat dan monoasetilhidrazin. Asam isonikotinat berkonjugasi dengan glisin menghasilkan asam isonikotiurat (isonikotinil glisin), sedangkan monoasetilhidrazin yang kemudian mengalami asetilasi menjadi diasetilhidrazin. Beberapa bagian yang tidak dimetabolisme akan mengalami konjugasi membentuk hidrazon. Metabolit Isoniazid tidak memiliki aktivitas tuberkulostatik. Pada pasien dengan fungsi ginjal yang normal, lebih dari 75% dari obat diekskresikan melalui urine selama 24 jam yang terutama sebagai metabolit. Sejumlah kecil obat yang diekskresikan melalui feses. Isoniazid juga akan dikeluarkan dari tubuh bila pasien menjalani dialisis (Sweetman, 1999).

2.2.2.3 Efek Samping

Efek samping dari penggunaan isoniazid adalah gangguan hati (mual, muntah dan lelah), gangguan darah (anemia, agranulositosis, trombositopenia dan eosinofilia), hipersensesitivitas (eritema) dan efek samping lainnya (konstipasi dan retensi urin) (Sweetman, 1999).

(48)

2.2.3 Pirazinamid Rumus struktur :

N N

NH₂

Gambar 2.3. Rumus struktur pirazinamid. Nama Kimia : Pirazinkarboksamida.

Sinonim : Pirazinamidum, Asam pirazinoat amida. Rumus Molekul : C5H5N3O

Berat Molekul : 123,11. .

Pemerian : Serbuk hablur, putih hingga praktis putih, tidak berbau atau praktis tidak berbau.

Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, sukar larut dalam etanol, dalam eter dan dalam kloroform (Depkes RI, 1995; Sweetman, 1999).

2.2.3.1 Penggunaan dan Cara Pemberian

Pirazinamid adalah salah satu jenis obat dari terapi tuberkulosis, awal terapi adalah selama 8 minggu. Pirazinamid biasanya diberikan per hari atau 2 kali sampai 3 kali seminggu. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah maksimum 3 g per hari melalui mulut. Sedangkan pada pasien anak-anak dosis yang diberikan 35 mg/kg per hari di Amerika Serikat (United States of America (USA)) dengan batas maksimum 1,5 g per hari (Sweetman, 1999).

(49)

2.2.3.2 Farmakokinetika

Pirazinamid segera diabsorbsi dari saluran pencernaan. Konsentrasi maksimum obat dalam plasma adalah 33 µg/mL setelah 2 jam pemberian dosis 1,5 g dan 59 µg/mL setelah 2 jam pemberian dosis 3 g. Pirazinamid secara luas didistribusikan ke cairan tubuh. Waktu paruh pirazinamid berkisar antara 9 jam sampai 10 jam. Produk metabolisme yang terutama di hati adalah asam pirazinoat, selanjutnya mengalami hidroksilasi menjadi produk ekskresi asam 5-hidroksipirazinoat. Produk ekskresi ini segera diekskresikan melalui ginjal terutama oleh filtrasi glomerulus. Sekitar 70% dari obat diekskresikan melalui urine selama 24 jam dan 4% dalam bentuk tidak berubah yang terutama sebagai metabolit. Pirazinamid juga akan dikeluarkan dari tubuh bila pasien menjalani dialisis. Jalur metabolisme yang utama adalah pirazinamid mengalami deaminasi menjadi asam pirazinoat yang kemudian mengalami hidroksilasi menjadi asam hidroksipirazinoa, sedangkan jalur metabolisme yang lainnya adalah pirazinamid mengalami hidroksilasi menjadi hidroksipirazinamid yang kemudian mengalami deaminasi menjadi asam hidroksipirazinoat (Sweetman, 1999).

2.2.3.3 Efek Samping

Efek samping dari penggunaan pirazinamid adalah gangguan hati (hepatomegali), gangguan darah (anemia) dan efek samping lainnya (mual, muntah, demam, hiperurisemia/asam urat dan disuria) (Sweetman, 1999).

(50)

2.3 Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid

Menurut organisasi kesehatan dunia (world health organization (WHO)) tahun 2006, tablet campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi. Untuk isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 15 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan campuran fase gerak, yakni: 50 g amonium asetat dalam 1000 mL air yang kemudian ditambahkan asam asetat glasial sampai pH 5 (fase gerak A) dan metanol (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran 94:6 yang laju alir (flow rate) 2 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 240 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan air. Untuk rifampisin ditentukan kadarnya secara terpisah secara kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 25 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan campuran fase gerak, yakni: dapar fosfat pH 7 (kalium dihidrogen fosfat (0,1 mol/L) yang disesuaikan pH dengan natrium hidroksida (0,01 mol/L)) (fase gerak A) dan metanol (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran 4:6 yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 254 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan metanol.

Menurut Farmakope Amerika Serikat edisi ketiga puluh (United States Pharmacopoeia 30th Edition (USP XXX)) tahun 2007, tablet campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara

(51)

kromatografi cair kinerja tinggi. Untuk Rifampisin, Isoniazid, Pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 25 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan fase gerak campuran larutan dapar fosfat pH 6,8 dan asetonitril (96:4) (fase gerak A) dan campuran larutan dapar fosfat pH 6,8 dan asetonitril (55:45) (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.1) yang laju alir (flow rate) 1,5 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 238 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan dapar fosfat pH 6,8.

Tabel 2.1. Perubahan perbandingan fase gerak (USP XXX, 2007). Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi

0 100 0 setimbang

0-5 100 0 isokratik

5-6 100→0 0→100 gradien linear

6-15 0 100 isokratik

Menurut Dorneanu tahun 2010, campuran rifampisin, isoniazid dan etambutol dapat ditentukan dengan dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi fase balik dengan menggunakan kolom Phenomenex Luna 100-5 C18, diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 2100-5 cm, diameter ukuran partikel 100-5 µm dengan fase gerak campuran larutan dapar asetat pH 5 dan metanol (80:20) (fase gerak A) dan campuran larutan asam oksalat 0,01 M dan asetonitril (30:70) (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.2) yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 270 nm (untuk isoniazid dan etambutol) selama 9 menit dan diubah menjadi 320 nm (untuk

(52)

rifampisin) hingga selesai analisis. Perubahan panjang gelombang dilakukan pada waktu 9 menit hingga 9,1 menit. Analisis untuk setiap sampel memerlukan waktu 30 menit dan untuk menyetimbangkan sistem diperlukan waktu 8 menit. Sampel diektraksi, dengan cara: sediaan dilarutkan dengan 10 mL metanol dalam labu tentukur 50 mL, disonikasi selama 10 menit, didinginkan, ditambahkan dengan air hingga garis tanda dan dikocok. Campuran disaring, dipipet filtrat 5 mL, dimasukkan kedalam labu tentukur 25 mL, diencerkan dengan air hingga garis tanda, dikocok dan kemudian sampel dapat dianalisis. Metode divalidasi dengan beberapa pengujian, antara lain: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)), linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, rentang, selektivitas dan kekuatan.

Tabel 2.2. Perubahan perbandingan fase gerak (Dorneanu, 2010). Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi

0 100 0 setimbang

0-6,5 100 0 isokratik

6,5-15 100→50 0→50 gradien linear

15-22 50→0 50→100 gradien linear

Menurut Dionex tahun 2010, untuk penetapan kadar rifampisin, isoniazid, pirazinamid dan etambutol secara kromatografi cair kinerja tinggi fase normal dengan menggunakan kolom Acclaim Polar Advantage II diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 15 cm, temperatur kolom 35oC, diameter ukuran partikel 3 µm dengan fase gerak campuran 8% asetonitril dalam larutan NaH2PO4 20 mM (1,5 mL trietilamin per liter) pH 6,8 (fase gerak A) dan 50% asetonitril dalam larutan NaH2PO4 20 mM (1,5 mL trietilamin per liter) pH 6,8 (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut yang berubah-ubah

(53)

(sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.3) yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 200 nm dan 238 nm. Sampel diektraksi, dengan cara: satu tablet dimasukkan dalam gelas beker 50 mL, ditambahkan 5 mL asetonitil dan 20 mL fase gerak A, diaduk, disonikasi hingga larut, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan dengan fase gerak A hingga garis tanda dan dikocok. Campuran disaring, dipipet filtrat 0,75 mL, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan fase gerak A hingga garis tanda, dikocok dan kemudian sampel dapat dianalisis. Analisis untuk setiap sampel memerlukan waktu 10,5 menit. Metode divalidasi dengan beberapa pengujian, antara lain: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter (simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)) dan linearitas.

Tabel 2.3. Perubahan perbandingan fase gerak (Dionex, 2010).

Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi

0 100 0 setimbang

3 100 0 isokratik

3-3,5 100→0 0→100 gradien linear

3,5-10,5 0 100 isokratik

Menurut Song dan kawan-kawan tahun 2007, rifampisin, isoniazid, pirazinamid, etambutol dan dua metabolit utamanya (yakni: asetilisoniazid dan 25-desasetilrifampisin) dapat ditentukan kadarnya dari dalam darah untuk monitoring terapi obat secara kromatografi cair kinerja tinggi tandem spektrometri massa (KCKT/SM/SM) menggunakan kolom Hydrosphere C18, diameter kolom 3 mm, panjang kolom 5 cm, diameter ukuran partikel 3 µm dengan fase gerak campuran asam format 0,3% dalam metanol (fase gerak A) dan asam format 0,3% dalam air (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut

(54)

yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.4). Laju alir (flow rate) juga berubah-ubah selama analisis (sistem gradien), yakni: 0,15 mL/menit selama 1,8 menit kemudian berubah menjadi 0,4 mL/menit dalam waktu 0,2 menit (hingga 2 menit) selanjutnya dipertahankan selama 2 menit (hingga 4 menit). Deteksi dilakukan pada mode ion positif dan hanya memerlukan waktu 4 menit untuk analisis setiap sampelnya. Pada penelitian ini digunakan baku dalam (internal standard), yakni: rifabutin dan asam 6-aminonikotinat. Serta dilakukan uji validasi terhadap metode ini, yang mencakup: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)), batas deteksi, batas kuantitasi dan linearitas. Sampel dipersiapkan dengan dua tahap pengendapan protein, yakni: metanol 50% selama 20 menit dan metanol 100% selama 20 menit selanjutnya dilakukan penyaringan kemudian filtrat yang diperoleh dapat digunakan dianalisis. Pada penelitian ini didapatkan bahwa puncak isoniazid, pirazinamid, etambutol, asetilisoniazid dan 6-aminonikotinat masih tumpang tindih. Begitu pula dengan puncak rifampisin dan 25-desasetilrifampisin juga masih tumpang tindih. Hanya puncak rifabutin yang terpisah dengan baik dengan puncak yang lainnya. Akan tetapi, dengan kromatografi cair kinerja tinggi tandem spektrometri massa (KCKT/SM/SM) dilakukan pendeteksian dengan mode pemantauan reaksi berganda (multiple reaction monitoring (MRM)), maka setiap senyawa akan dideteksi sebagai kromatogram yang terpisah (masing-masing).

(55)

Tabel 2.4. Perubahan perbandingan fase gerak (Song, 2007).

Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi

0 60 40 setimbang

1,8 60 40 isokratik

1,8-2 60→80 40→20 gradien linear

2-3 80→60 20→40 gradien linear

3-4 60 40 isokratik

2.4 Spektrofotometri Infra Merah

Senyawa kimia yang ikatan kovalen antara dua atomnya memiliki perbedaan elektronegativitas (keelektronegatifan/momen dipol) akan menyerap radiasi elektromagnetik pada frekuensi tertentu pada daerah infra merah. Terjadinya absorbsi karena molekul tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi ketika mengabsorbsi radiasi infra merah. Karena setiap ikatan yang berbeda memiliki frekuensi getaran yang berbeda dan ikatan yang sama dari dua senyawa yang berbeda berada dalam lingkungan yang berbeda, maka tidak ada dua molekul yang berbeda struktur memiliki spektrum infra merah yang sama, kecuali senyawa isomer optis aktif (Pavia, et al., 2009).

Radiasi elektromagnetik infra merah bila dilewatkan pada suatu sampel maka akan diserap oleh ikatan-ikatan molekul didalam sampel sehingga molekul tersebut akan mengalami gerakan vibrasi regangan dan vibrasi bengkokan. Namun bentuk vibrasi regangan ini dapat dibagi lagi atas dua, yakni: regangan asimetrik dan regangan simetrik. Bentuk vibrasi bengkokan juga dapat dibagi atas: guntingan, pelintiran, kibasan dan goyangan. Vibrasi regangan terjadi pada bilangan gelombang yang lebih besar (panjang gelombang yang lebih kecil) sedangkan vibrasi bengkokan terjadi pada bilangan gelombang yang lebih kecil (panjang gelombang yang lebih besar) (Pavia, et al., 2009; Watson, 2009).

(56)

Radiasi elektromagnetik yang diserap merupakan ciri khas dari setiap ikatan. Spektrum infra merah dapat digunakan untuk memeriksa identitas bahan baku obat yang digunakan dan dapat mengidentidikasi bahan kimia sintetik sebagai pemeriksaan pendahuluan (Watson, 2009).

2.5 Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, analisis kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, industri dan lain sebagainya (Rohman dan Gandjar, 2007).

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang digunakan untuk memisahkan beberapa komponen yang terdapat dalam sampel dengan didasarkan pada afinitas relatif masing-masing komponen diantara fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Sadek, 2004). Jenis kromatografi pada umunya diberi nama berdasarkan jenis fase gerak yang digunakan. Pada kromatografi cair menggunakan fase gerak berupa zat cair dan kromatografi gas menggunakan fase gerak berupa zat gas (Hamilton dan Sewell, 1977).

Menurut Rohman dan Gandjar tahun 2007 serta Meyer tahun 2004, kromatografi dapat dibedakan menjadi berbagai macam tergantung pada

(57)

pengelompokkannya. Berdasarkan mekanisme pemisahan, kromatografi dapat dibedakan menjadi beberapa metode, yakni:

(a) kromatografi adsorbsi (adsorption chromatography) (b) kromatografi fase normal (normal phase chromatography) (c) kromatografi fase balik (reversed phase chromatography) (d) kromatografi partisi (partition chromatography)

(e) kromatografi ion (ion chromatography)

(f) kromatografi pasangan ion (ion pair chromatography) (g) kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography) (h) kromatografi eksklusi ukuran (size exclusion chromatography) (i) kromatografi fase terikat (chemically bonded phase chromatography) (j) kromatografi afinitas (affinity chromatography).

Kromatografi fase balik merupakan contoh khusus dari kromatografi fase terikat. Kromatografi ini menggunakan fase diam dari silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18

Menurut Rohman dan Gandjar tahun 2007, berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas:

) yang relatif non polar sedangkan fase geraknya relatif lebih polar daripada fase diam. Kondisi kepolaran kedua fase ini merupakan kebalikan dari kromatografi fase normal sehingga disebut kromatografi fase balik. Kromatografi fase balik merupakan kromatografi yang paling modern dalam kromatografi cair kinerja tinggi (Meyer, 2004; Rohman dan Gandjar, 2007).

(a) kromatografi kertas (KK) (b) kromatografi lapis tipis (KLT)

(1)

- Analisis data statistik persentase perolehan kembali isoniazid pada berbagai rentang spesifik persentase perolehan kembali dari tablet Rimcure 3 FDC® (P.T. Sandoz)

Rentang

dengan metode penambahan baku. Spesifik

Persentase

Perolehan (X) (� − ��) (� − ��)� 80%

100,3355% 0,0019 0,0000

98,4022% -0,0174 0,0003

101,2322% 0,0109 0,0001

100%

101,1290% 0,0098 0,0001

100,9642% 0,0082 0,0001

101,5525% 0,0141 0,0002

120%

98,8928% -0,0125 0,0002

99,8259% -0,0032 0,0000

98,9686% -0,0118 0,0001

� 901,3030% 0,0000 0,0011

Rataan 100,1448% 0,0000 0,0001

Standar Deviasi (SD).

SD = �∑(X−X� )2

(N−1) = �

0,0001

9−1 = 0,0117

Relatif Standar Deviasi (RSD).

RSD = SD_X� × 100% = ₁₀₀0,0117

,1448% × 100% = 1,1672%

(2)

- Data hasil perhitungan persentase perolehan kembali pirazinamid pada rentang spesifik 100% dari tablet Rimcure 3 FDC®_{(P.T. Sandoz)}

Rentang

dengan metode penambahan baku.

Spesifik

Persentase

Perolehan (X) (� − ��) (� − ��)� 80%

98,9266% -0,0043 0,0000

100,7453% 0,0139 0,0002

98,6695% -0,0069 0,0000

100%

100,8103% 0,0145 0,0002

100,8941% 0,0154 0,0002

98,4286% -0,0093 0,0001

120%

98,5536% -0,0080 0,0001

98,0986% -0,0126 0,0002

99,0995% -0,0026 0,0000

� 894,2262% 0,0000 0,0010

Rataan 99,3585% 0,0000 0,0001

Standar Deviasi (SD).

SD = �∑(X−X� )2

(N−1) = �

0,0001

9−1 = 0,0113

Relatif Standar Deviasi (RSD).

RSD = SD_X� × 100% = ₉₉0,0113

,3585% × 100% = 1,1374%

(3)

Lampiran 36. Sertifikat analisis baku rifampisin (P.T. Indofarma).

(4)

Lampiran 37. Sertifikat analisis baku isoniazid (P.T. Indofarma).

(5)

Lampiran 38. Sertifikat analisis baku pirazinamid (P.T. Indofarma).

(6)

Lampiran 39. Daftar nilai distribusi t

Pengembangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Spektrometri Massa untuk Penetapan Kadar Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid dari Plasma Manusia dan Sediaan Tablet

TESIS

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK

PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN

PIRAZINAMID DARI PLASMA MANUSIA DAN SEDIAAN

TABLET

OLEH:

NERDY

NIM 107014007

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

PENGEMBANGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI SPEKTROMETRI MASSA UNTUK

PENETAPAN KADAR RIFAMPISIN, ISONIAZID DAN

PIRAZINAMID DARI PLASMA MANUSIA DAN SEDIAAN

TABLET

TESIS

OLEH:

NERDY

NIM 107014007

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

PERSETUJUAN TESIS

PENGESAHAN TESIS

Parts

Dokumen yang terkait

Penetapan Kadar Simvastatin Dalam Sediaan Tablet Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dengan Fase Gerak Metanol–Air

Penetapan Kadar Rifampisin dan Isoniazid dalam Sediaan Tablet Secara Multikomponen dengan Metode Spektrofotometri Ultraviolet

Penetapan Kadar Amoxicilin Dalam Tablet Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Penetapan Kadar Sulfadoksin Dan Pirimetamin Dalam Sediaan Tablet Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Penetapan Kadar Tablet Pirazinamid Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Penetapan Kadar Tablet Pirazinamid Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Penetapan Kadar Tablet Pirazinamid Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Penetapan Kadar Tablet Pirazinamid Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Penetapan Kadar Acyclovir (Acycloguanosine) dalam Sediaan Tablet dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Penetapan Kadar Acyclovir (Acycloguanosine) dalam Sediaan Tablet dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Dokumen yang Anda mencari sudah siap untuk unduhkan