3.5 Definisi Operasional
No. Variabel
Definisi Operasional Cara Ukur
Skala Ukur Alat Ukur
1 Ekstrak kunyit
dengan konsentrasi
100 Ekstrak yang didapatkan dengan
melarutkan 1 gram ekstrak kunyit
Sesuai SOP dari Laboratorium
Biologi Oral UNAIR
Rasio Electronic Balance,
Gelas Ukur
2 Ekstrak
kunyit dengan konsentrasi
50 Ekstrak yang didapatkan dengan
melarutkan ½ dari ekstrak kunyit konsentrasi 100
Mikropipet 3
Ekstrak kunyit dengan
konsentrasi 25
Ekstrak yang didapatkan dengan melarutkan ½ dari ekstrak kunyit
konsentrasi 50
4 Ekstrak
Kunyit dengan
konsentrasi 12,5
Ekstrak yang didapatkan dengan melarutkan ½ dari ekstrak kunyit
konsentrasi 25
5 Ekstrak
Kunyit dengan
konsentrasi 6,25
Ekstrak yang didapatkan dengan melarutkan ½ dari ekstrak kunyit
konsentrasi 12,5
6 KHM Kadar
Hambat Minimal
Konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat
pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan tidak
tumbuh koloni bakteri pada media pembenihan dengan menggunakan
metode dilusi
Dalam satuan CFUml Colony
Forming UnitSuspensi
Rasio Spektrofotometer
7 KBM Kadar
Bunuh Minimal
Konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh bakteri setelah
dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah
koloni bakteri pada media padat dengan menggunakan metode Drop
Plate Mills Mesra Kaca Pembesar
3.6 Bahan dan Alat Penelitian
3.6.1 Bahan Penelitian
− Kunyit sebanyak 1500 gram
− Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter Kimia Farma, Indonesia
− Suspensi Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 UNAIR, Indonesia
− Media Nutrient Agar UNAIR
− NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia
− DMSO 100 ml
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Alat Penelitian
− Lemari pengering
− Kertas perkamen
− Aluminium foil 1 gulungan
− Blender Panasonic, Japan
− Perkolator
− Kapas Bio Panca, Indonesia
− Kertas saring Whatman no.42, England
− Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
− Erlenmeyer Pyrex, USA
− Destilator
− Lemari penyimpan petri
− Piring petri Pyrex, Japan
− Inkubator CO
2
Sanyo, Japan −
Autoklaf Tomy, Japan −
Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan −
Vortexwhirli mixer Iwaki model TM 100, Japan −
Pipet mikro dan tipsGilson, France −
Kaca Pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan −
Ose dan spi
3.7 Proses Pengambilan dan Pengolahan Data
3.7.1 Proses Pembuatan Ekstrak kunyit
1.
Kunyit diseleksi kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan
Gambar 3. Proses pencucian, pengeringan dan pengirisan kunyit.
Universitas Sumatera Utara
2. Kunyit yang telah dicuci ditimbang sebanyak 4 kg dengan alat penimbang dan
dicatat berat basahnya. 3.
Kunyit dikeringkan dengan menggunakan kertas alas perkamen di dalam lemari pengering dengan suhu 40 °C sampai kering.
Gambar 4. Pengering dengan suhu 40 ° sampai kering.
4. Kunyit yang sudah kering ditimbang kembali dan dihaluskan dengan blender
sampai menjadi serbuk, lalu diletakkan dalam wadah tertutup.
Gambar 5. Kunyit diblender sampai menjadi serbuk.
3.7.2 Pembuatan Ekstrak
1. Simplisia ditimbang sebanyak 350 gram lalu ditambahkan etanol 96
sebanyak 3 liter untuk perendaman. Kemudian simplisia disimpan dalam\ wadah tertutup dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 25 °C sambil sesekali diaduk dengan
menggunakan spatula.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 6. Penambahan etanol 96 dan didiamkan pada wadah yang tutup.
2. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan
hati-hati sambil sesekali ditekan, di bawah perkolator diletakkan kapas yang telah dibasahi etanol dan dilapisi kertas saring, kemudian dituangkan etanol 96 sampai
hampir penuh. 3.
Perkolator ditutup dengan aluminium foil serta dibiarkan selama 24 jam.
. Gambar 7. Proses perkolator.
4. Kran perkolator menetes dengan kecepatan 20 tetesmenit 1mlmenit,
perkolat ditampung dalam botol. 5.
Etanol 96 ditambahkan supaya kunyit tidak mengalami kekeringan.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 8. Kran perkolator menetes dengan kecepatan 20 tetesmenit.
6. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih.
Semua perkolat digabung dan disaring, 7.
Setelah itu sisa air diuapkan dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan termperatur
≤ 40˚C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kunyit
Gambar 9. Proses kental ekstrak kunyit.
3.7.2 Prosedur Pengenceran Bahan Coba Ekstrak Kunyit
Sebelum dilakukan pengenceran, tabung steril disediakan kemudian diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Dalam hal ini, setiap tabung diberi label 100, 50, 25,
12,5, 6,25. Setiap tabung diisi dengan media BHIB dengan volume 5 ml. Pada tabung 50, 25, 12,5, dan 6,25 diisi dengan media BHIB. Pada tabung berlabel 100 diisi
dengan 10 ml ekstrak kunyit, selanjutnya diambil 5 ml dari tabung tersebut dan dipindahkan ke tabung berlabel 50. Volume tabung yang berlabelkan 50 menjadi 10 ml dengan
Universitas Sumatera Utara
penipisannya adalah: 510 = ½ = 50. Setelah itu, diambil 5 ml dari tabung berlabel 50, kemudian dimasukkan ke tabung berlabel 25 sehingga penipisannya adalah ¼ = 25.
Setelah itu, diambil 5 ml dari tabung berlabel 25, kemudian dimasukkan ke tabung berlabel 12,5 sehingga penipisannya adalah 18 = 12,5. Setelah itu, diambil 5 ml dari tabung
berlabel 12,5, kemudian dimasukkan ke tabung berlabel 6,25 sehingga penipisannya adalah 116 = 6,25.
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media NA, sebanyak 12 gram bubuk yang dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu dipanaskan di atas
tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121°C. Setelah
disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan
dibiarkan hingga dingin.
Gambar 10. Nutrient Agar NA
3.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah specimen stem cell Porphyromonas
gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media NA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan
murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland
atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
Universitas Sumatera Utara
Kontrol 0,5 Mc Farland diperoleh dengan pencampuran 0,05 ml Barium Klorida Dihidrat BaCl
2
•2H
2
O 1,175 dengan 9,95 ml Asam Sulfat H
2
SO
4
1. Kontrol ini menghasilkan suspensi bakteri dengan jumlah sekitar 1x10
8
CFUml. Penggunaan kontrol 0,5 Mc Farland berdasarkan standar kekeruhan yang sesuai dalam penelitian bakteri.
34
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan
mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.6 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak kunyit yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya diambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan
mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24
jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan
coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu
menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
Gambar 11. Suspensi tabung reaksi dalam inkubator.
Universitas Sumatera Utara
3.7.7 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri,
yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25 dengan metode Spreading. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50
μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Nutrient Agar, direplikasi sebanyak 5 petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam
inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh menjadi 1
koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila
bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada
penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena
pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat seban yak 50 μl, maka hasil
perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Gambar 12. Penanaman bakteri dan ekstrak kunyit pada Nutrient Agar.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 13. Metode Spreading pada penanaman dan penghitungan jumlah koloni bakteri P.gingivalis.
Gambar 14. Suspensi bakteri media padat dalam inkubator
Universitas Sumatera Utara
3.8 Skema Alur Penelitian
Kategori