larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan
kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya.
Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat
melalui kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang
dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom
Zorbax carbohydrat Agilent yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat mono-, di-, polysakarida.
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
B. Komposisi Eluen
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase
balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
C. Volume Injeksi
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel
volume misalnya 20 – 500 μL. Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual menggunakan jarum suntik, step-flow injection, dan sampling value.
D. Detektor
Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai
banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
o
Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak bulk property detector.Detektor dapat dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah
detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap
sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas • Detektor tetapan dielektrika
o
Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel disebut solute property detector.Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1
Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak, • Detektor-detektor fotometer uv-vis dan inframerah
Pada detektor ultravioletvisibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet untuk detektor ultraviolet dan sinar tampak untuk detektor visibel. Detektor
ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama
digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan
dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena
kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga
gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui. • Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
E. Chart Speed
