Contoh kromatogram dengan banyak peak
Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat zat target analisa
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time RT. Peak yang mempunyai RT yang
sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawazat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan
standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zatsenyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai
spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :
A. Kolom
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm dan mungkin kurang dari nilai ini dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah
bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-
rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika fase diam dan molekul-molekul polar dalam
larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan
kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya.
Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat
melalui kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang
dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom
Zorbax carbohydrat Agilent yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat mono-, di-, polysakarida.
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
B. Komposisi Eluen
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase
balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
C. Volume Injeksi
