Konstruksi Marka Gen Plantaricin F Lactobacillus plantarum
2
ABSTRAK
DWI FEBRIYANA. Konstruksi Marka Gen Plantaricin F Lactobacillus
plantarum. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMI SENO dan NOVIK
NURHIDAYAT.
Lactobacillus plantarum merupakan bakteri yang dapat berperan sebagai
probiotik. Bakteri ini memiliki plantaricin F yang berguna menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif dan negatif. Penelitian ini menggunakan
sepuluh isolat L. plantarum (Mar A5, Bst 1, Mar C7, TB(N), Mg Tm 1, Mg PSM
B3, TB(S), MKw 9, Bst 5, Mar B4) yang berasal dari buah-buahan tropis (mangga
kweni, manggis, markisa, dan terong belanda). Penelitian ini dilakukan untuk
konstruksi marka gen pln F dan menganalisis ekspresi relatif gen pln F serta uji
aktivitas antibakteri. Pengujian gen pln F menggunakan RT-PCR menghasilkan
pita DNA berukuran 70 pb. Hasil pengujian ini selanjutnya dipakai untuk
menentukan nilai ekspresi relatif gen pln F menggunakan software CS Analyzer.
Nilai ekspresi relatif gen tertinggi didapat dari isolat TB (S) dengan nilai 28.13
Au. Uji aktivitas antibakteri dilakukan untuk melihat hubungan antara gen pln F
dengan aktivitas penghambatan isolat terhadap bakteri uji. Uji aktivitas antibakteri
dilakukan terhadap lima bakteri antara lain Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan Pseudomonas
flouresense. Penghambatan tertinggi terhadap S. aureus terdapat pada isolat Mg
PSM B3 dengan diameter penghambatan 2.50 cm. Isolat Mar A5 memiliki
penghambatan tertinggi terhadap bakteri S. typhimurium, E. coli, dan P.
flouresense dengan diameter penghambatan masing-masing 1.33 cm, 1.83 cm, dan
1.16 cm. Isolat Mar B4 dan Bst 5 memiliki penghambatan tertinggi terhadap
bakteri B. cureus dengan diameter sekitar 0.50 cm.
3
ABSTRACT
DWI FEBRIYANA. Gene Marker Construction of Plantaricin F Lactobacillus
plantarum. Under the supervision of DJAROT SASONGKO HAMI SENO and
NOVIK NURHIDAYAT
Lactobacillus plantarum is a bacteria that can act as a probiotics. This
bacteria has a useful plantaricin F that can inhibit the growth of gram positive and
gram negative bacteria. This research used ten isolates L. plantarum (Mar A5, Bst
1, Mar C7, TB (N), Tm Mg 1, Mg PSM B3, TB (S), MKW 9, Bst 5, Mar B4)
derived from the tropical fruits (mango kweni, mangosteen, passion fruit, and
eggplant netherlands). This research was conducted for gene marker construction
of plantaricin F and relative gene expression of plantaricin F analysis using and
the antibacterial activity test. Pln F gene were tested using RT-PCR and produced
DNA band size 70 bp. Test results were then used to determine relative gene
expression values of pln F using CS Analyzer software. The highest relative gene
expression values obtained from isolates TB (S) with a value of 28.13 Au.
Antibacterial activity test carried out to see the relationship between gene pln F
with inhibitory activity against bacterial isolates tested. Antibacterial activity test
carried out on five bacteria such as Salmonella typimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, and Pseudomonas flouresense. The
highest inhibition against S.aureus isolates found in Mg PSM B3 with a diameter
of 2.50 cm of inhibition. Mar A5 isolates had the highest inhibition against S
.typhimurium bacteria, E. coli, and P. flouresense with a diameter of inhibition of
each of 1.33 cm, 1.83 cm, and 1.16 cm. The Mar B4 and Bst 5 isolates had the
highest inhibition against bacteria B.cureus with a diameter of about 0.50 cm. The
results showed that there was no correlation between relative gene expression to
the inhibition of test bacteria from L. plantarum.
PENDAHULUAN
Istilah probiotik telah umum dikenal
masyarakat. Menurut Ogueke et al. (2010),
probiotik merupakan mikroorganisme hidup
yang dapat meningkatkan kesehatan inangnya.
Mikroorganisme tersebut berguna bagi saluran
pencernaan karena memiliki kemampuan
dalam memperbaiki mikroflora di dalam usus.
Mikroorganisme yang bermanfaat sebagai
probiotik salah satunya berasal dari golongan
bakteri asam laktat (Endaryanto & Harsono
2005). Sifat penting bakteri asam laktat yang
berguna sebagai probiotik adalah aktivitasnya
dalam menghasilkan beberapa metabolit
antimikroba seperti asam organik (asam
laktat, asam asetat, dan asam propionat),
hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, dan
diasetil (Suskovic et al. 2001). Sifat ini dapat
dimanfaatkan dalam menghambat bakteri
patogen yang dapat menurunkan kesehatan
inangnya (Rohmawati 2010).
Kebanyakan bakteri asam laktat yang
digunakan sebagai probiotik berasal dari
genus Lactobacillus sp. dengan spesies L.
plantarum, L. casei, L. acidophilus, dan L.
johnsonii (Ogueke et al. 2010). L. plantarum
merupakan salah satu bakteri yang sering
digunakan sebagai probiotik. Beberapa
penelitian membuktikan bahwa L. plantarum
dapat dijumpai pada buah-buahan dan sayursayuran. L. plantarum bisa terdapat pada
buah-buahan tropis, seperti mangga, markisa,
manggis (Widyastuti et al. 1998), dan
belimbing (Lu et al. 2003).
Bakteri L. plantarum merupakan salah
satu bakteri yang penting dalam bidang
industri khususnya fermentasi (Moghadam et
al. 2010), pengawetan makanan, dan
keamanan pangan (Holo et al. 2001).
Beberapa sifat yang menguntungkan dari L.
plantarum antara lain kemampuannya yang
dapat bertahan pada asam yang tinggi, dan
mengeluarkan senyawa antimikroba misalnya
bakteriosin (Moghadam et al. 2010).
Bakteriosin merupakan protein yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba (Prabowo
2010).
Bakteriosin yang terdapat pada L.
plantarum dinamakan plantaricin. Beberapa
karakteristik yang dimiliki plantaricin yaitu
umumnya stabil pada suhu tinggi, kationik,
hidrofobik, tahan pada asam yang tinggi (Holo
et al. 2001), dan memiliki aktivitas
antimikroba (Anderssen et al. 1998). Aktivitas
antimikroba yang dihasilkan oleh plantaricin
berbeda-beda, misalnya pada plantaricin W
dan C dapat menghambat bakteri Gram positif
(Holo et al. 2010; Barcena et al. 1998). Salah
satu plantaricin yang memiliki kemampuan
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Gram positif dan negatif adalah plantaricin F
(Paynter et al. 1997).
Karakteristik
yang
dimiliki
oleh
plantaricin F yaitu memiliki 34 residu asam
amino, berat 3545 Da, dan titik isoelektrik
sebesar 10.7. Plantaricin ini dikode oleh gen
pln F. Gen ini berada dalam satu operon
dengan pln E dan pln I (Jorgenrud 2009).
Bakteriosin ini dapat menghambat beberapa
bakteri yang penting penyebab food borne
disease, antara lain Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus, dan
Pseudomonas aeruginosa (Paynter et al.
1997). Kemampuan penghambatan plantaricin
ini memiliki spektrum penghambatan bakteri
yang luas sehingga dapat menjadi probiotik
yang baik.
Penelitian ini bertujuan konstruksi marka
gen plantaricin F dengan melakukan
perancangan primer untuk gen pln F dan
menganalisis ekspresi relatif gen pln F pada
isolat L. plantarum yang berasal dari buahbuahan tropis (mangga kweni, manggis,
markisa, dan terong belanda). Selain itu,
penelitian juga dilakukan untuk menguji
aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji antara
lain Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan
Pseudomonas
flouresense.
Hipotesis
penelitian ini adalah tiap-tiap isolat yang
membawa gen pln F memiliki aktivitas
penghambatan terhadap bakteri Gram positif
dan negatif. Hasil yang diharapkan dapat
teridentifikasi adanya gen pln F pada seluruh
isolat yang digunakan dan didukung dengan
uji antibakteri L. plantarum sehingga dapat
memberikan gambaran untuk dapat dijadikan
probiotik yang baik.
TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
L. plantarum termasuk dalam kingdom
Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo
Lactobacillales, famili Lactobacillaceae, dan
genus Lactobacillus. Bakteri ini mempunyai
bentuk batang dan umumnya dalam rantairantai pendek. L. plantarum merupakan
bakteri Gram positif dan salah satu anggota
bakteri asam laktat yang biasanya digunakan
dalam fermentasi makanan (IGEM 2009).
Bakteri ini mempunyai suhu yang optimal
lebih rendah atau sama dengan 370C dan
PENDAHULUAN
Istilah probiotik telah umum dikenal
masyarakat. Menurut Ogueke et al. (2010),
probiotik merupakan mikroorganisme hidup
yang dapat meningkatkan kesehatan inangnya.
Mikroorganisme tersebut berguna bagi saluran
pencernaan karena memiliki kemampuan
dalam memperbaiki mikroflora di dalam usus.
Mikroorganisme yang bermanfaat sebagai
probiotik salah satunya berasal dari golongan
bakteri asam laktat (Endaryanto & Harsono
2005). Sifat penting bakteri asam laktat yang
berguna sebagai probiotik adalah aktivitasnya
dalam menghasilkan beberapa metabolit
antimikroba seperti asam organik (asam
laktat, asam asetat, dan asam propionat),
hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, dan
diasetil (Suskovic et al. 2001). Sifat ini dapat
dimanfaatkan dalam menghambat bakteri
patogen yang dapat menurunkan kesehatan
inangnya (Rohmawati 2010).
Kebanyakan bakteri asam laktat yang
digunakan sebagai probiotik berasal dari
genus Lactobacillus sp. dengan spesies L.
plantarum, L. casei, L. acidophilus, dan L.
johnsonii (Ogueke et al. 2010). L. plantarum
merupakan salah satu bakteri yang sering
digunakan sebagai probiotik. Beberapa
penelitian membuktikan bahwa L. plantarum
dapat dijumpai pada buah-buahan dan sayursayuran. L. plantarum bisa terdapat pada
buah-buahan tropis, seperti mangga, markisa,
manggis (Widyastuti et al. 1998), dan
belimbing (Lu et al. 2003).
Bakteri L. plantarum merupakan salah
satu bakteri yang penting dalam bidang
industri khususnya fermentasi (Moghadam et
al. 2010), pengawetan makanan, dan
keamanan pangan (Holo et al. 2001).
Beberapa sifat yang menguntungkan dari L.
plantarum antara lain kemampuannya yang
dapat bertahan pada asam yang tinggi, dan
mengeluarkan senyawa antimikroba misalnya
bakteriosin (Moghadam et al. 2010).
Bakteriosin merupakan protein yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba (Prabowo
2010).
Bakteriosin yang terdapat pada L.
plantarum dinamakan plantaricin. Beberapa
karakteristik yang dimiliki plantaricin yaitu
umumnya stabil pada suhu tinggi, kationik,
hidrofobik, tahan pada asam yang tinggi (Holo
et al. 2001), dan memiliki aktivitas
antimikroba (Anderssen et al. 1998). Aktivitas
antimikroba yang dihasilkan oleh plantaricin
berbeda-beda, misalnya pada plantaricin W
dan C dapat menghambat bakteri Gram positif
(Holo et al. 2010; Barcena et al. 1998). Salah
satu plantaricin yang memiliki kemampuan
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Gram positif dan negatif adalah plantaricin F
(Paynter et al. 1997).
Karakteristik
yang
dimiliki
oleh
plantaricin F yaitu memiliki 34 residu asam
amino, berat 3545 Da, dan titik isoelektrik
sebesar 10.7. Plantaricin ini dikode oleh gen
pln F. Gen ini berada dalam satu operon
dengan pln E dan pln I (Jorgenrud 2009).
Bakteriosin ini dapat menghambat beberapa
bakteri yang penting penyebab food borne
disease, antara lain Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus, dan
Pseudomonas aeruginosa (Paynter et al.
1997). Kemampuan penghambatan plantaricin
ini memiliki spektrum penghambatan bakteri
yang luas sehingga dapat menjadi probiotik
yang baik.
Penelitian ini bertujuan konstruksi marka
gen plantaricin F dengan melakukan
perancangan primer untuk gen pln F dan
menganalisis ekspresi relatif gen pln F pada
isolat L. plantarum yang berasal dari buahbuahan tropis (mangga kweni, manggis,
markisa, dan terong belanda). Selain itu,
penelitian juga dilakukan untuk menguji
aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji antara
lain Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan
Pseudomonas
flouresense.
Hipotesis
penelitian ini adalah tiap-tiap isolat yang
membawa gen pln F memiliki aktivitas
penghambatan terhadap bakteri Gram positif
dan negatif. Hasil yang diharapkan dapat
teridentifikasi adanya gen pln F pada seluruh
isolat yang digunakan dan didukung dengan
uji antibakteri L. plantarum sehingga dapat
memberikan gambaran untuk dapat dijadikan
probiotik yang baik.
TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
L. plantarum termasuk dalam kingdom
Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo
Lactobacillales, famili Lactobacillaceae, dan
genus Lactobacillus. Bakteri ini mempunyai
bentuk batang dan umumnya dalam rantairantai pendek. L. plantarum merupakan
bakteri Gram positif dan salah satu anggota
bakteri asam laktat yang biasanya digunakan
dalam fermentasi makanan (IGEM 2009).
Bakteri ini mempunyai suhu yang optimal
lebih rendah atau sama dengan 370C dan
2
mempunyai
ukuran sekitar 0.5-10 µm
(Suparman 2010).
Peranan
L.
plantarum
sebagai
antimikrobial dapat dimanfaatkan dalam
fermentasi makanan karena L. plantarum
toleran terhadap pH rendah dibandingkan
dengan bakteri asam laktat lainnya (Lu et al.
2003). L. plantarum juga dapat memproduksi
bakteriosin yang dapat berguna sebagai
antimikrobial. Bakteriosin yang dihasilkan
oleh Lactobacillus plantarum memiliki
banyak jenis, misalnya plantaricin A,
plantaricin F, plantaricin W, dan plantaricin
NC8 (Cho et al. 2010).
Gambar 1
Lactobacillus plantarum (IGEM
2009).
Probiotik
Probiotik merupakan mikroorganisme
bukan patogen yang jika digunakan akan
memberikan pengaruh positif terhadap
fisiologi dan kesehatan inangnya (Triana et al.
2006).
Mikroorganisme
ini
dapat
memperbaiki keseimbangan mikroflora usus.
Keseimbangan yang baik dalam ekosistem
mikrobiota usus dapat menguntungkan
kesehatan. Beberapa karakteristik probiotik
yang dapat digunakan antara lain, mempunyai
kapasitas untuk bertahan hidup dan
melakukan
kolonisasi,
mampu
mempertahankan keseimbangan mikroflora
usus yang sehat melalui kompetisi dan inhibisi
mikroba patogen, menstimulasi sistem
pertahanan tubuh, tidak bersifat toksik dan
patogen, mempunyai karakteristik teknologi
yang baik yaitu mampu bertahan selama
penyimpanan dan penggunaan dalam bentuk
preparat makanan yang didinginkan dan
dikeringkan, agar dapat disediakan secara
masal dalam industri (Aulia 2010).
Probiotik telah digunakan berabad-abad
sebagai komponen bahan tambahan makanan.
Terdapat tiga mekanisme kerja probiotik,
yaitu menekan pertumbuhan mikroorganisme
patogen pada saluran pencernaan melalui
produksi substansi mikrob (asam laktat, asam
asetat, asetaldehida, hidrogen peroksida, dan
bakteriosin),
persaingan
mendapatkan
makanan, persaingan reseptor pada dinding
usus; merubah metabolisme mikrobial dengan
meningkatkan
aktivitas
enzim
yang
bermanfaat atau menekan aktivitas enzim
yang tidak bermanfaat; dan merangsang
pembentukkan kekebalan tubuh (Suskovic et
al. 2001). Bakteri yang paling banyak
digunakan sebagai probiotik berasal dari
golongan bakteri asam laktat. Bakteri ini
penting dalam pengawetan bahan makanan
dan melawan bakteri patogen melalui
pembentukan senyawa peptida antimikroba
(Suparjo 2008).
Plantaricin F
Plantaricin merupakan bakteriosin yang
dikeluarkan oleh L. plantarum (Cho et al.
2010). Plantaricin memilki banyak jenis, yaitu
plantaricin A, plantaricin B, plantaricin C,
plantaricin C19, plantaricin F, plantaricin EF,
plantaricin T, plantaricin S, plantaricin 154,
plantaricin SA 6, plantaricin KW30,
plantaricin UGI, plantaricin 406. Masingmasing
plantaricin
memiliki
aktivitas
antimikroba yang berbeda-beda, misalnya
pada plantaricin W dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif (Holo et al.
2001). Salah satu plantaricin yang memiliki
aktivitas antimikroba pada bakteri Gram
negatif dan bakteri gram positif adalah
plantaricin F. Plantaricin ini memiliki
kemampuan stabil pada suhu tinggi dan pH
yang rendah sehingga dapat dimanfaatkan
untuk keperluan fermentasi. Selain itu,
mempunyai aktivitas dalam menghambat
bakteri yang menyebabkan food borne
disease, antara lain L. monocytogenes,
Salmonella sp., P. aeroginosa, dan S. aureus
(Paynter et al. 1997).
Mekanisme
plantaricin
F
dalam
menyerang inangnya adalah dengan cara
membuat pori pada membran. Terdapat dua
mekanisme utama, yairtu model barrel stave
dan model carpet. Model barrel stave
memiliki mekanisme yaitu peptida dari
bakteriosin berasosiasi dengan membran
target dan membentuk pori pada bagian
lapisan lipid, sedangkan model carpet
memiliki mekanisme dengan peptida dari
bakteriosin tidak menembus bagian lipid
bilayer tetapi membungkus membran target
(Jorgenrud 2009).
Isolasi RNA
Isolasi RNA
merupakan tahap yang
memiliki resiko terhadap degradasi dan
kontaminasi yang tinggi. Molekul RNA
3
memiliki waktu paruh yang pendek, mudah
rusak, dan mudah didegradasi oleh RNase
(Wilson & Walker 2000). Secara umum
terdapat tiga tahapan yaitu pemecahan sel dan
solubilitas membran, isolasi dan pemurnian
RNA, dan pemekatan RNA. Pemecahan sel
dan solubilitas membran harus dilakukan
secara cepat dan tuntas agar menginaktifkan
kerja ribonuklease. Pemecahan sel dilakukan
dengan menggunakan larutan sodium dedosil
sulfat (SDS) 10% dan lisozim 5 mg/mL. SDS
10% merupakan deterjen anionik yang dapat
digunakan untuk menghancurkan membran
sel dari bakteri (Berg et al. 2005), sedangkan
lisozim
5
mg/mL
berfungsi
untuk
mendegradasi ikatan antara asam Nasetilmuramat dan N-asetil-D-glukosamin
yang terdapat pada dinding sel bakteri
(Murray et al. 2009). Pemurnian dilakukan
dengan penambahan fenol dan kloroform
yang bertujuan untuk penghilangan protein.
Fenol merupakan senyawa yang dapat
mendenaturasi protein (Pelczar & Chan 2005),
sedangkan tahapan pemekatan dengan
isopropanol dan etanol 70%.
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah
suatu metode in vitro untuk amplifikasi
sejumlah fragmen DNA spesifik dengan
panjang dan sekuen yang telah ditentukan dari
sejumlah kecil cetakan (Wirawan 2004).
Metode ini memungkinkan
amplifikasi
fragmen DNA yang diinginkan dengan
sensitivitas dan selektivitas yang tinggi serta
berlangsung dalam waktu yang cepat
(McPherson & Moller 2006).
Proses PCR berlangsung dalam beberapa
tahap, antara lain tahap denaturasi,
penempelan primer, dan sintesis DNA. Tahap
denaturasi dimulai DNA utas ganda diurai
menjadi DNA utas tunggal dengan tahap
proses pemanasan, biasanya suhu yang
digunakan 94 OC. Suhu pada denaturasi dijaga
pada waktu tertentu sampai DNA menjadi
utas tunggal. Waktu tahap denaturasi berkisar
2-5 menit (McPherson & Moller 2006).
Tahap penempelan primer merupakan
tahapan kedua dari proses PCR. Temperatur
pada tahap ini diturunkan, hal ini dilakukan
agar primer dapat menempel secara
komplementer dengan templat atau cetakan.
Tahapan ketiga dari proses PCR adalah tahap
sintesis DNA. Tahapan ini biasanya
memerlukan suhu sekitar 72 OC. Suhu ini
merupakan suhu yang optimum bagi DNA
polymerase dalam melakukan sintesis (Mc
Pherson & Moller 2006). Penggunaan DNA
polymerase pada PCR menggunakan Taq
polymerase termostabil yang diisolasi dari
bakteri thermofilik Thermus aquaticus
(Wirawan 2004). Seluruh proses ini dapat
dilihat pada Gambar 2 dan 3 yang
menjelaskan semua tahap mengenai proses
PCR.
Komponen-komponen yang berperan
dalam PCR antara lain primer, cetakan atau
templat, bufer, dNTPs, dan Thermal Stable
Polymerase. Primer dalam PCR terdiri atas
sepasang primer dari oligonukleotida sintetik
memulai sintesis DNA (Potter et al. 2007).
Gambar 2 Reaksi denaturasi dan penempelan
primer pada proses PCR (Potter et
al. 2007).
Gambar 3 Reaksi sintesis DNA oleh Taq
polimerase (Potter et al. 2007).
4
Reverse Transkriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) merupakan metode yang
digunakan untuk memperbanyak cDNA dari
RNA yang digunakan sebagai cetakan.
Metode ini memiliki keunggulan berupa
sensitif, cepat, dan fleksibel terhadap gen
target dan memberikan informasi mengenai
gen target. Reaksi pada RT-PCR didasarkan
atas kemampuan enzim reverse transcriptase
dalam menghasilkan untai komplementer
sehingga
terbentuk
cDNA
dengan
menggunakan m-RNA sebagai cetakan atau
templat (McPherson & Moller 2006).
Tahapan pada RT-PCR awalnya, primer
oligo-dT akan menempel pada bagian poli-A
mRNA di ujung 5’. Tahapan berikutnya,
terjadi pembentukan utas pertama dan
dilakukan penambahan RNase H untuk
menyingkirkan RNA serta enzim reverse
transcriptase sehingga hasil yang diperoleh
adalah cDNA. Molekul cDNA tersebut akan
digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR
selanjutnya. Metode ini biasanya digunakan
untuk menentukan ekspresi gen, atau
identifikasi sekuen suatu transkripsi RNA,
termasuk permulaan transkripsi dan daerah
terminasi (Wilson 2000). Proses RT-PCR
dijelaskan pada Gambar 4.
suatu molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, misalnya
gel agarosa, lalu dialirkan arus listrik dari satu
kutub ke kutub yang berlawanan muatan maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif (Yuwono 2005).
Elektroforesis berlangsung dalam gel
agarosa sebagai medium pemisahan molekul.
Molekul DNA atau RNA bermigasi
berdasarkan ukuran dan bentuk. Molekul kecil
akan berpindah lebih cepat dibandingkan
dengan molekul yang lebih besar. Ukuran
DNA yang tidak diketahui saat migrasi bisa
dibandingkan dengan penanda (Potter et al.
2007).
Elektroforesis dapat digunakan untuk
analisis DNA menggunakan gel agarosa. Gel
agarosa merupakan suatu bahan semi padat
berupa polisakarida yang diekstraksi dari
rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan
melarutkannya pada bufer dan dibantu dengan
proses pemanasan. Larutan bufer yang
digunakan biasanya menggunakan tris asetatEDTA (TAE) atau tris borat EDTA (TBE).
Larutan elektroforesis yang telah dicampurkan
dengan bufer dan melalui proses pemanasan
dituang dalam lempeng dan ditancapkan sisir
agar terbentuk lubang-lubang kecil untuk
tempat memasukkan sampel. Gel agarosa
yang telah terbentuk direndam dalam tangki
bersama bufer yang digunakan untuk
membuat gel (Yuwono 2005).
Hasil elektroforesis dapat dilihat secara
visual dengan menggunakan EtBr (ethidium
bromida) dan sinar ultra violet (UV).
Ethidium
bromida
merupakan
suatu
intercalating agent yang biasanya digunakan
dalam mewarnai asam nukleat. Biasanya hasil
elektroforesis bila diwarnai dalam EtBr akan
berwarna merah keunguan. Senyawa ini
mempunyai rumus kimia C21H20BrN3 yang
bersifat
mutagen
sehingga
dapat
menyebabkan iritasi. Selain itu, senyawa ini
bersifat karsinogenik (Lun & Sansone 1987).
Gambar 4 Reaksi RT-PCR (Mc Pherson &
Moller 2006).
Perancangan Primer
Primer merupakan DNA rantai pendek
yang terdiri atas beberapa nukleotida. Primer
ini berfungsi sebagai awalan proses sintesis
yang berlangsung dalam PCR. Awalnya
primer akan menempel pada target dan
membentuk rangkaian komplementer pada
untai DNA yang berlawanan serta mengapit
rangkaian sasaran (Potter et al. 2007). Proses
perancangan primer sangat penting, proses ini
dapat menggunakan beberapa program, misal
Primer3
(http:frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3) dan Oligo perfect Designer
Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu teknik
pemisahan molekul seluler berdasarkan
ukuran dengan menggunakan medan listrik
yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik
ini dapat digunakan dengan memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul.
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk
analisis DNA, RNA, maupun protein. Jika
5
(http://www.invitrogen.com/ ) (McPherson &
Moller 2006).
Situs lain dalam perancangan primer
adalah www.ncbi.nlm.nih.gov, dalam situs ini
terdapat BLAST. BLAST merupakan program
pencarian kesamaan yang didesain untuk
mengeksplorasi semua database sekuen yang
diminta, baik itu berupa DNA atau protein.
Program BLAST juga dapat digunakan untuk
mendeteksi hubungan diantara sekuen pada
daerah tertentu yang memiliki kesamaan atau
homologi (Aprijani & Efaizi 2004). Peranan
BLAST dalam desain primer salah satunya
untuk pencarian basis data berdasarkan pada
hasil pensejajaran sekuen yang berasal DNA
maupun protein. Selain itu, dapat digunakan
untuk mengidentifikasi homolog dari molekul
baru. Beberapa kriteria dari primer, antara lain
% G dan C lebih dari 50%, tidak memiliki
kemungkinan saling komplemen antara basa
dalam satu rantai primer atau primer lainnya,
memiliki 18-25 pasang basa, tidak
membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian
ini adalah autoklaf, laminar air flow, pipet
mikro, cawan Petri, tabung reaksi, inkubator,
oven, labu Erlenmeyer, dan spektrofotometer.
Alat-alat lain yang digunakan adalah tabung
Eppendorf, waterbath, sentrifus 5415 R,
termometer, gelas piala, Takara PCR Thermal
cycler, elektroforesis ATTO, printgraph
ATTO, kertas uji, pinset, densitometer dengan
program CS Analyzer, dan gunting.
Tabel 1 Isolat L. plantarum yang digunakan
Kode isolat
Asal isolate
Mar A5
Markisa
Bst 1
Manggis
MarC7
Markisa
TB (N)
Terong Belanda
Mg Tm 1
Manggis
Mg PSM B3
Manggis
TB(S)
Terong Belanda
Mkw 9
Mangga kweni
Bst 5
Manggis
Mar B4
Markisa
Bahan yang digunakan antara lain
media glucose yeast extract (GYP), 10 Isolat
Lactobacillus plantarum yang berasal dari
berbagai macam buah (Tabel 1), 5 isolat
bakteri
uji
(Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Bacillus
cureus,
dan
Pseudomonas
flouresense), potassium asetat, kloramfenikol
30 µg, fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut), kloroform, isopropanol,
lisozim 5 mg/mL, SDS 10%, bufer TE pH 8,
aqua bidestilata steril, etanol 70%, etanol
absolut. Bahan lain yang digunakan adalah
Agarosa, bufer Tris Acid EDTA (TAE) 1X,
SuperScript III One-Step RT-PCR with
Platinum
Taq
Invitrogen
dan,
Diethylpyrocarbonat (DEPC).
Metode
Perancangan Primer
Perancangan primer dilakukan dengan
mencari
sekuen
dari
plantaricin
F
menggunakan
http:www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Sekuen yang diambil adalah sekuen yang
menyandikan gen tersebut. Kehomologian
sekuen dicari dengan program BLAST untuk
menentukan daerah yang terkonservasi.
Daerah yang terkonservasi adalah daerah yang
memiliki homologi yang signifikan dengan
gen yang berfungsi sama pada spesies lain.
Daerah terkonservasi didapatkan setelah
melakukan pensejajaran atau multiple
aligment dengan Crustal W2 yang dapat
digunakan pada situs http:www.ebi.ac.uk.
Primer yang dibuat harus memiliki syarat
umum yaitu % G dan C lebih dari 50%, tidak
memiliki kemungkinan saling komplemen
antara basa dalam satu rantai primer atau
primer lainnya, memiliki 18-25 pasang basa,
tidak membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001). Hasil rancangan
diuji
menggunakan
bantuan
program
komputer yaitu gene runner.
Pembuatan Media Glucose Yeast ExtractPeptone (GYP) (Triana et al. 2006)
Media ini dibuat dalam 200 mL dengan
komposisi yaitu 4 gram agar, 2 gram glukosa,
2 gram yeast extract, 0.4 gram beef extract, 1
gram pepton, Na-Asetat.3H2O 0.28 gram, 1
mL salt solution (0.1 gram MgSO4.7H2O, 0.1
gram MSO4.4H2O, 0.1 gram FeSO4.7H2O, 0.1
gram NaCl dilarutkan di dalam akuades
sebanyak 50 mL), 2 mL Tween 80, CaCO3
0.0375 gram/mL, dH2O sampai dengan 200
mL.
5
(http://www.invitrogen.com/ ) (McPherson &
Moller 2006).
Situs lain dalam perancangan primer
adalah www.ncbi.nlm.nih.gov, dalam situs ini
terdapat BLAST. BLAST merupakan program
pencarian kesamaan yang didesain untuk
mengeksplorasi semua database sekuen yang
diminta, baik itu berupa DNA atau protein.
Program BLAST juga dapat digunakan untuk
mendeteksi hubungan diantara sekuen pada
daerah tertentu yang memiliki kesamaan atau
homologi (Aprijani & Efaizi 2004). Peranan
BLAST dalam desain primer salah satunya
untuk pencarian basis data berdasarkan pada
hasil pensejajaran sekuen yang berasal DNA
maupun protein. Selain itu, dapat digunakan
untuk mengidentifikasi homolog dari molekul
baru. Beberapa kriteria dari primer, antara lain
% G dan C lebih dari 50%, tidak memiliki
kemungkinan saling komplemen antara basa
dalam satu rantai primer atau primer lainnya,
memiliki 18-25 pasang basa, tidak
membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian
ini adalah autoklaf, laminar air flow, pipet
mikro, cawan Petri, tabung reaksi, inkubator,
oven, labu Erlenmeyer, dan spektrofotometer.
Alat-alat lain yang digunakan adalah tabung
Eppendorf, waterbath, sentrifus 5415 R,
termometer, gelas piala, Takara PCR Thermal
cycler, elektroforesis ATTO, printgraph
ATTO, kertas uji, pinset, densitometer dengan
program CS Analyzer, dan gunting.
Tabel 1 Isolat L. plantarum yang digunakan
Kode isolat
Asal isolate
Mar A5
Markisa
Bst 1
Manggis
MarC7
Markisa
TB (N)
Terong Belanda
Mg Tm 1
Manggis
Mg PSM B3
Manggis
TB(S)
Terong Belanda
Mkw 9
Mangga kweni
Bst 5
Manggis
Mar B4
Markisa
Bahan yang digunakan antara lain
media glucose yeast extract (GYP), 10 Isolat
Lactobacillus plantarum yang berasal dari
berbagai macam buah (Tabel 1), 5 isolat
bakteri
uji
(Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Bacillus
cureus,
dan
Pseudomonas
flouresense), potassium asetat, kloramfenikol
30 µg, fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut), kloroform, isopropanol,
lisozim 5 mg/mL, SDS 10%, bufer TE pH 8,
aqua bidestilata steril, etanol 70%, etanol
absolut. Bahan lain yang digunakan adalah
Agarosa, bufer Tris Acid EDTA (TAE) 1X,
SuperScript III One-Step RT-PCR with
Platinum
Taq
Invitrogen
dan,
Diethylpyrocarbonat (DEPC).
Metode
Perancangan Primer
Perancangan primer dilakukan dengan
mencari
sekuen
dari
plantaricin
F
menggunakan
http:www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Sekuen yang diambil adalah sekuen yang
menyandikan gen tersebut. Kehomologian
sekuen dicari dengan program BLAST untuk
menentukan daerah yang terkonservasi.
Daerah yang terkonservasi adalah daerah yang
memiliki homologi yang signifikan dengan
gen yang berfungsi sama pada spesies lain.
Daerah terkonservasi didapatkan setelah
melakukan pensejajaran atau multiple
aligment dengan Crustal W2 yang dapat
digunakan pada situs http:www.ebi.ac.uk.
Primer yang dibuat harus memiliki syarat
umum yaitu % G dan C lebih dari 50%, tidak
memiliki kemungkinan saling komplemen
antara basa dalam satu rantai primer atau
primer lainnya, memiliki 18-25 pasang basa,
tidak membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001). Hasil rancangan
diuji
menggunakan
bantuan
program
komputer yaitu gene runner.
Pembuatan Media Glucose Yeast ExtractPeptone (GYP) (Triana et al. 2006)
Media ini dibuat dalam 200 mL dengan
komposisi yaitu 4 gram agar, 2 gram glukosa,
2 gram yeast extract, 0.4 gram beef extract, 1
gram pepton, Na-Asetat.3H2O 0.28 gram, 1
mL salt solution (0.1 gram MgSO4.7H2O, 0.1
gram MSO4.4H2O, 0.1 gram FeSO4.7H2O, 0.1
gram NaCl dilarutkan di dalam akuades
sebanyak 50 mL), 2 mL Tween 80, CaCO3
0.0375 gram/mL, dH2O sampai dengan 200
mL.
6
Bahan-bahan ditimbang dan dimasukkan
ke dalam gelas piala 1 L. Ditambahkan dH2O
sampai dengan 200 mL lalu diaduk sampai
homogen. Campuran dipanaskan dan diaduk
dengan pengaduk stirer. Sebelum dipindahkan
ke dalam cawan Petri terlebih dahulu
campuran disterilisasi dengan autoklaf pada
suhu 121 0 C selama 15 menit. Media yang
telah mengalami proses sterilisasi dipindahkan
ke dalam cawan Petri yang telah disterilkan
dan dibiarkan hingga membeku. Media GYP
yang telah membeku siap digunakan untuk
menumbuhkan bakteri.
Pembuatan media GYP cair dilakukan
dengan mencampurkan semua bahan kecuali
agar dan CaCO3 ke dalam labu Erlenmeyer
dan dikocok dengan pengaduk magnetik
hingga homogen. Setelah itu dibagi rata ke
dalam beberapa tabung reaksi sebanyak 5 mL
dan ditutup dengan sumbat kapas. Media cair
GYP ini kemudian disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 1210C selama 15 menit dan
digunakan untuk kultivasi bakteri.
Kultivasi Bakteri
Isolat bakteri L. plantarum yang
digunakan untuk isolasi RNA terdapat pada
Tabel 1. Biakan bakteri yang telah disiapkan
digores sebanyak satu ose dalam media GYP
padat. Pekerjaan ini dilakukan dalam laminar
air flow secara aseptik. Media GYP padat
kemudian diinkubasi dalam inkubator selama
24-48 jam pada suhu 370C. Hasil yang
terbentuk berupa koloni tunggal yang
menunjukkan bahwa koloni tersebut murni.
Biakan murni yang tumbuh pada media padat
dipindahkan dalam media cair. Pekerjaan ini
juga dilakukan dalam Laminar air flow. Media
kemudian diinkubasi selama 12-18 jam pada
suhu 370C. Hasilnya dapat dilakukan
pemanenan sel yang dapat digunakan untuk
proses isolasi RNA.
Isolasi Total RNA (Sambrook et al. 1989)
Prosedur
isolasi total RNA dimulai
dengan pemanenan L. plantarum. Kultur
bakteri yang telah tumbuh dalam media cair
dipindahkan dalam tabung Eppendorf 2 mL
dan disentrifus 7000 rpm selama 5 menit.
Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan 1
mL fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut) dan dicampurkan hingga
homogen. Campuran tersebut disentrifus 8000
rpm selama 5 menit.
Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan
800 µL lisozim 5 mg/mL lalu dihomogenkan
dengan cara dibolak-balik dan di-vortex.
Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama
15 menit dan ditambahkan 300 µL SDS 10%
lalu dihomogenkan kembali. Campuran
tersebut diinkubasi kembali pada suhu 650C
selama 3 menit dan ditambahkan 200 µL
potassium
asetat.
Campuran
tersebut
kemudian dipanaskan pada suhu 800C-900C
selama 5 menit dan disimpan dalam ice box
selama 3 menit. kemudian sebanyak 80 µL
hot phenol ditambahkan dalam campuran
tersebut.
Campuran dipanaskan pada suhu 800C0
90 C selama 5 menit dan disentrifus selama 5
menit pada 8000 rpm. Supernatan diambil
dan
ditambahkan
kloroform
dengan
perbandingan
1:1
dan
dibolak-balik.
Campuran disentrifus 8000 rpm selama 5
menit
sehingga terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas diambil dan ditambahkan 500 µL
isopropanol lalu dibolak-balik.
Hasilnya
disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Pelet
yang terbentuk ditambahkan sebanyak 500
µL etanol 70% dan disentrifus 8000 rpm
selama 5 menit. Tahapan penambahan etanol
70% dilakukan sebanyak dua kali. Pelet yang
terbentuk dikeringkan sampai tidak terdapat
etanol. Bila sudah kering ditambahkan 50 µL
DEPC 0.1%. Hasil isolasi dicek menggunakan
agarosa 1.5%.
Pengukuran Kualitas RNA (Microarrays
2000)
Kualitas RNA dapat diukur menggunakan
alat spektrofotometer
pada panjang
gelombang 260 nm/280 nm. Sampel RNA
sebanyak 10 µL diambil dan ditambahkan 990
µL air yang telah mendapat perlakuan
Diethylpyrocarbonat (DEPC). Kuvet yang
digunakan dalam keadaan bersih dari
kontaminasi RNase. Baca absorban pada 260
nm/280 nm.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) (Invitrogen 2007)
Bahan-bahan berasal SuperScript III OneStep RT-PCR with Platinum Taq Invitrogen.
Campuran reaksi disiapkan yang terdiri atas
12.5 µL 2X reaction mix, 1 µL primer
reverse, 1 µL primer forward, 1 µL taq mix,
9.5 µL aqua bidestilata steril, dan 1 µL
sampel total
RNA. Campuran tersebut
disentrifugasi singkat selama 1 menit agar
homogen. Campuran dimasukkan kedalam
mesin PCR. Reaksi dimulai dengan program 1
siklus 550C selama 30 menit, 1 siklus 940C
selama 4 menit, 40 siklus yang terdiri atas
940C selama 30 detik, 550C selama 30 detik,
720C selama 1 menit, 1 siklus 720C selama 7
7
menit, dan 1 siklus 40C. Hasil disimpan pada
suhu -200C.
Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis hasil PCR dimulai dengan
menyiapkan agarosa 2%. Sebanyak 2.6 gram
agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 130
mL TAE 1X. Campuran kemudian dipanaskan
dalam microwave. Campuran ditempatkan
pada bak elektroforesis yang telah disusun.
Agarosa yang dapat digunakan bila sudah
keras. Elektroforesis sampel selama 60 menit
pada 100 volt. Hasil dapat dilihat di alat
Printgraph ATTO .
Pengukuran
Ekspresi
gen
pln
F
(Nurhidayat 2010)
Pengukuran ekspresi gen pln F
menggunakan software CS Analyzer. Cara
kerja CS Analyser adalah setelah dilakukan
analisis elektroforesis gel agarosa, data hasil
elektroforesis berupa gambar di scanner dan
diubah menjadi data digital untuk mencari
data yang diperlukan. Proses perhitungan
dimulai dengan mengitung 1 µL RNA dari
RNA total dan RNA produk yang
dielektroforesis dari hasil CS Analyzer. Hasil
yang didapatkan akan menghasilkan ekspresi
gen dari plantaricin F dan 16s RNA.
Ekspresi gen
Hasil perhitungan dari ekspresi gen pln F
dan 16s RNA dapat menjelaskan ekspresi
relatif gen pln F yang terdapat pada masingmasing isolat.
Uji Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010)
Kultur cair dari sepuluh isolat L.
plantarum disiapkan dalam tabung Eppendorf
ukuran 2 mL dan disentrifus 12000 rpm
selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakan pada uji aktivitas. Lalu disiapkan
media padat GYP dan dibuat tanda pada
cawan Petri untuk kontrol positif, kontrol
negatif, dan sampel. Tahapan selanjutnya,
bakteri patogen yang telah ditumbuhkan
dalam media cair disebar dalam media GYP
padat sebanyak 100 µL. Bakteri patogen yang
digunakan ialah Escherichia coli, Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas flouresense, dan Bacillus
cureus. Kertas uji yang telah direndam di
dalam isolat
Lactobacillus
plantarum
ditempatkan pada cawan Petri yang telah
diberi tanda. Kontrol positif yang digunakan
pada percobaan ini adalah kloramfenikol dan
kontrol negatif ialah akuades steril. Lalu
inkubasi dalam inkubator selama 1 hari pada
suhu 370C.
Pengukuran Aktivitas Antibakteri (Gong et
al. 2010)
Hasil dari uji aktivitas yang telah
diinkubasi selama satu malam dilihat aktivitas
penghambatannya. Aktivitasnya dapat dilihat
apabila dari masing-masing sampel yang diuji
dapat menghasilkan zona bening. Zona bening
yang dihasilkan diukur diameternya dengan
menggunakan penggaris. Semakin besar
diameter zona bening maka akan semakin
tinggi aktivitas penghambatan dari bakteri
tersebut. Hasilnya dikoreksi dengan kontrol,
yaitu ukuran kertas uji sebesar 0.6 cm.
Diameter Penghambatan
HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA Total Lactobacillus plantarum
Isolasi
RNA
total
menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil
menunjukkan RNA total dari sepuluh isolat
L. plantarum
yang digunakan dalam
percobaan telah berhasil diisolasi. Kualitas
RNA
yang
telah
diisolasi
diukur
menggunakan
metode
spektrofotometri.
Pengukuran kualitas RNA ini sangat
diperlukan karena kualitas RNA yang baik
akan mempengaruhi keberhasilan sintesis
cDNA (Invitrogen 2007).
Tabel 2 Kuantifikasi RNA dari sepuluh isolat
L. plantarum
Isolat
Mar A5
Bst 1
MarC7
TB (N)
Mg Tm 1
Mg PSM
B3
TB(S)
Mkw 9
Bst 5
Mar B4
A260
2,96
2,737
2,552
2,872
0,945
A280
2,613
2,709
2,27
2,914
0,83
A260/280
1,1328
1,0103
1,1242
0,9856
1,1386
1,892
0,877
2,466
2,737
1,199
1,665
0,788
2,28
2,914
1,051
1,1363
1,1129
1,0816
0,9393
1,1408
Hasil pengukuran kualitas RNA diperoleh
dengan perbandingan absorban pada panjang
gelombang 260 nm dengan 280 nm.
Pengukuran pada panjang gelombang 260 nm
untuk mengukur asam nukleat, sedangkan
absorban dengan panjang gelombang 280 nm
digunakan untuk mengukur protein (Clark &
Cristopher 2001). Rasio pengukuran absorban
tersebut digunakan untuk menunjukkan
7
menit, dan 1 siklus 40C. Hasil disimpan pada
suhu -200C.
Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis hasil PCR dimulai dengan
menyiapkan agarosa 2%. Sebanyak 2.6 gram
agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 130
mL TAE 1X. Campuran kemudian dipanaskan
dalam microwave. Campuran ditempatkan
pada bak elektroforesis yang telah disusun.
Agarosa yang dapat digunakan bila sudah
keras. Elektroforesis sampel selama 60 menit
pada 100 volt. Hasil dapat dilihat di alat
Printgraph ATTO .
Pengukuran
Ekspresi
gen
pln
F
(Nurhidayat 2010)
Pengukuran ekspresi gen pln F
menggunakan software CS Analyzer. Cara
kerja CS Analyser adalah setelah dilakukan
analisis elektroforesis gel agarosa, data hasil
elektroforesis berupa gambar di scanner dan
diubah menjadi data digital untuk mencari
data yang diperlukan. Proses perhitungan
dimulai dengan mengitung 1 µL RNA dari
RNA total dan RNA produk yang
dielektroforesis dari hasil CS Analyzer. Hasil
yang didapatkan akan menghasilkan ekspresi
gen dari plantaricin F dan 16s RNA.
Ekspresi gen
Hasil perhitungan dari ekspresi gen pln F
dan 16s RNA dapat menjelaskan ekspresi
relatif gen pln F yang terdapat pada masingmasing isolat.
Uji Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010)
Kultur cair dari sepuluh isolat L.
plantarum disiapkan dalam tabung Eppendorf
ukuran 2 mL dan disentrifus 12000 rpm
selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakan pada uji aktivitas. Lalu disiapkan
media padat GYP dan dibuat tanda pada
cawan Petri untuk kontrol positif, kontrol
negatif, dan sampel. Tahapan selanjutnya,
bakteri patogen yang telah ditumbuhkan
dalam media cair disebar dalam media GYP
padat sebanyak 100 µL. Bakteri patogen yang
digunakan ialah Escherichia coli, Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas flouresense, dan Bacillus
cureus. Kertas uji yang telah direndam di
dalam isolat
Lactobacillus
plantarum
ditempatkan pada cawan Petri yang telah
diberi tanda. Kontrol positif yang digunakan
pada percobaan ini adalah kloramfenikol dan
kontrol negatif ialah akuades steril. Lalu
inkubasi dalam inkubator selama 1 hari pada
suhu 370C.
Pengukuran Aktivitas Antibakteri (Gong et
al. 2010)
Hasil dari uji aktivitas yang telah
diinkubasi selama satu malam dilihat aktivitas
penghambatannya. Aktivitasnya dapat dilihat
apabila dari masing-masing sampel yang diuji
dapat menghasilkan zona bening. Zona bening
yang dihasilkan diukur diameternya dengan
menggunakan penggaris. Semakin besar
diameter zona bening maka akan semakin
tinggi aktivitas penghambatan dari bakteri
tersebut. Hasilnya dikoreksi dengan kontrol,
yaitu ukuran kertas uji sebesar 0.6 cm.
Diameter Penghambatan
HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA Total Lactobacillus plantarum
Isolasi
RNA
total
menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil
menunjukkan RNA total dari sepuluh isolat
L. plantarum
yang digunakan dalam
percobaan telah berhasil diisolasi. Kualitas
RNA
yang
telah
diisolasi
diukur
menggunakan
metode
spektrofotometri.
Pengukuran kualitas RNA ini sangat
diperlukan karena kualitas RNA yang baik
akan mempengaruhi keberhasilan sintesis
cDNA (Invitrogen 2007).
Tabel 2 Kuantifikasi RNA dari sepuluh isolat
L. plantarum
Isolat
Mar A5
Bst 1
MarC7
TB (N)
Mg Tm 1
Mg PSM
B3
TB(S)
Mkw 9
Bst 5
Mar B4
A260
2,96
2,737
2,552
2,872
0,945
A280
2,613
2,709
2,27
2,914
0,83
A260/280
1,1328
1,0103
1,1242
0,9856
1,1386
1,892
0,877
2,466
2,737
1,199
1,665
0,788
2,28
2,914
1,051
1,1363
1,1129
1,0816
0,9393
1,1408
Hasil pengukuran kualitas RNA diperoleh
dengan perbandingan absorban pada panjang
gelombang 260 nm dengan 280 nm.
Pengukuran pada panjang gelombang 260 nm
untuk mengukur asam nukleat, sedangkan
absorban dengan panjang gelombang 280 nm
digunakan untuk mengukur protein (Clark &
Cristopher 2001). Rasio pengukuran absorban
tersebut digunakan untuk menunjukkan
8
kemurnian RNA terhadap kontaminasi
protein. Nilai yang diharapkan dari
pengukuran ini berkisar 1.8-2.1. (Sambrook
& Russel 2001). Hasil pengukuran dapat
dilihat pada Tabel 2. Hasil pengukuran
kuantitas RNA menunjukkan bahwa sampel
yang diisolasi tidak memiliki kemurnian yang
tinggi terhadap kontaminasi dari protein atau
pengotor lain. Kontaminasi protein atau
pengotor lain dapat terjadi pada saat ekstraksi
dengan kloroform tidak efisien dalam
menghilangkan protein ataupun pengotor lain
(Song et al. 2011).
Terdapat beberapa tahapan dalam isolasi
RNA total, antara lain pemecahan membran
dan solubilisasi membran, isolasi dan
pemurnian RNA, dan pemekatan RNA.
Seluruh tahapan ini memerlukan alat-alat
seperti Eppendorf, tip, dan seluruh alat-alat
gelas yang telah mendapatkan perlakuan
DEPC. DEPC berfungsi untuk menginaktifkan
RNase yang dapat mendegradasi RNA yang
akan diisolasi pada percobaan.
RNA
Total
1
2
3
4
Ket: 1= Mar A5
2= Bst 1
3= Mar C7
4= TB (N)
5= Mg Tm 1
Gambar 5
5
6
7
8 9
10
6 = Mg PSM B3
7 = TB (S)
8 = Mkw 9
9 = Bst 5
10 = Mar B4
Elektroforegram Total RNA
L.plantarum.
Hasil Perancangan Primer
Konstruksi marka gen plantaricin F
dilakukan dengan perancangan primer.
Sepasang primer yang spesifik digunakan
untuk amplifikasi gen pln F dengan RT-PCR.
Sekuen primer yang digunakan dapat
mempengaruhi spesifitas dan sensitivitas
reaksi dalam RT-PCR. Primer yang digunakan
dirancang menggunakan situs NCBI dari
daerah yang terkonservasi untuk gen pln F
dan 16s RNA. Hasil dari perancangan primer
dapat dilihat pada Tabel 3.
Primer forward dan reverse dirancang
berdasarkan kriteria primer yang dapat
digunakan untuk amplifikasi, antara lain
memiliki panjang primer berkisar 18-25
pasang basa, memiliki Tm tidak melebihi suhu
700C, % GC sekitar 40-60%, dan antara
primer forward dan reverse tidak saling
komplemen (Sambrook & Russel 2001).
Sekuen yang dirancang terdapat pada Tabel 3.
Hasil perancangan primer ini bila dianalisis
dengan program Gene Runner akan
didapatkan data, yaitu pada primer forward
pln F terdapat kemungkinan dimer sekitar 6
pb dan tidak terdapat kemungkinan untuk
internal loops dan hairpin loops. Pada primer
reverse terdapat 3 hairpin loop, dimer sekitar
4 pb, dan internal loop sekitar 8 pb.
Hasil dari perancangan primer gen pln F
ini diharapkan akan dapat menghasilkan
produk sekitar 70 pb. Hal ini berdasarkan
sekuen
yang dapat diapit oleh primer.
Perancangan primer ini menggunakan sekuen
dengan panjang 156 pb. Pada primer forward
sekuen dirancang dari urutan 58 sampai
dengan urutan 79, sedangkan primer reverse
dirancang dari urutan 127 sampai 107. Hal
lain yang harus diperhatikan adalah primer
yang dihasilkan. Primer ini menentukan suhu
dalam penempelan primer pada proses PCR.
Suhu penempelan primer terletak 2-10
dibawah nilai melting tempetrature (Tm) dari
primer (Sambrook & Russel 2001). Primer
16s RNA merupakan primer universal. Primer
ini digunakan sebagai kontrol positif dalam
percobaan ini.
Amplikon dan Ekspresi Gen Pln F dengan
RT-PCR
Amplifikasi gen pln F menggunakan
sepuluh isolat L. plantarum dengan metode
RT-PCR. Primer yang digunakan adalah
primer gen pln F dan 16s RNA. Primer 16s
RNA berfungsi sebagai kontrol positif dalam
reaksi ini. 16s RNA merupakan salah satu
ribosomal RNA dan hanya terdapat pada
prokariot. 70s RNA yang terdapat dalam
prokariot terdiri atas dua subunit, yaitu 30s
dan 50s. Komponen dari 30s RNA terdiri atas
16s RNA dan 21 protein (Garrett & Grisham
2007)
Tahap awal dari proses RT-PCR adalah
sintesis cDNA yang berasal dari sampel RNA
dengan menggunakan m-RNA sebagai
cetakan (Hogg 2005). Program yang
digunakan dalam reaksi RT-PCR, antara lain
9
Tabel 3 Primer gen pln F dan 16S RNA
Ukuran
Konsentrasi
(pb)
(nmol)
Sekuen
Tm
% GC
pln F F:5’-TTCCATGCCTATAGCGCGCGTG-3’
22
50
66.4
59.1
pln F R: 5’-TGATCCAATCGGCAGGCCCAA-3’.
21
50
57.1
57.1
16S RNA
F:
5’-CAAGCCACCATTCAAGGTT-3'
20
50
44.6
45
F:5’
3’
16S
RNA
R:
5’-CCCTACTGATCCCGCAATTA-3’
20
50
46.7
50
pln F R: 5’
3’.
1 siklus 550C selama 30 menit digunakan
16S RNA F: 5’
untuk sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi, 1
16S RNA0 R: 5’
3’
siklus 94 C selama 4 menit berfungsi dalam
tahapan denaturasi atau pemutusan ikatan
ganda dari RNA. Selanjutnya, amplifikasi
dari PCR dengan menggunakan program 40
siklus yang terdiri atas 940C selama 30 detik
untuk denaturasi, 550C selama 30 detik untuk
penempelan primer, 720C selama 1 menit
untuk sintesis DNA. Tahap akhir dari reaksi
adalah 1 siklus 720C selama 7 menit yang
digunakan untuk sintesis DNA tahap akhir,
Gambar 6 Elektroforegram hasil produk RTdan 1 siklus 40C untuk menjaga agar DNA
PCR
hasil PCR tidak rusak (Invitrogen 2007).
Hasil
amplifikasi
dilihat
dengan
melakukan elektroforesis gel agarosa 2%
untuk melihat apakah gen tersebut berhasil
diamplifikasi. Elektroforesis menggunakan
agarosa 2% menunjukkan pita DNA
berukuran 70 pb dengan marker berukuran
100 pb (Gambar 6,7, dan 8). Berdasarkan
ukuran pita yang dihasilkan dengan gen yang
dirancang, gen tersebut merupakan gen pln F
yang diinginkan.
Hasil amplifikasi dapat menentukan nilai
ekspresi gen yang ada pada tiap isolat
L.plantarum. Nilai ekspresi gen pln F dan 16s
Gambar 7 Elektroforegram hasil produk RTRNA dianalisis menggunakan program CS
PCR.
Analyzer. Ekspresi gen merupakan proses
yang membawa keterangan mengenai satu gen
atau lebih gen ke dalam data fenotip, dalam
proses ini melibatkan transkripsi dan translasi
(Smith et al. 2000).
Hasil ekspresi gen didapatkan dari
elektroforesis RNA total dengan produk hasil
RT-PCR. Penentuan masing-masing ekspresi
ini dapat menentukan nilai ekspresi relatif gen
pln F. Nilai ekspresi relatif gen pln F
merupakan nilai perbandingan antara nilai
ekspresi gen pln F dengan 16s RNA. Nilai
ekspresi gen pln F yang dihasilkan oleh
sepuluh isolat L. plantarum memiliki nilai
berbeda-beda. Nilai ekspresi relatif gen pln F
paling tinggi ditunjukkan oleh isolat TB (S)
dengan nilai 28.3 Au, sedangkan isolat Bst 5
tidak memiliki nilai ekspresi relatif gen pln F
(Gambar 9). Perhitungan dari nilai ekspresi
Gambar 8 Elektroforegram hasil produk RTrelatif gen pln F terdapat pada Lampiran 6.
PCR.
10
Gambar 9 Tingkat ekspresi relatif gen pln F
dari masing-masing isolat L.
plantarum.
Aktivitas Antibakteri Isolat L. plantarum
Terhadap Bakteri Uji
Pengujian aktivitas sepuluh
isolat L.
plantarum dilakukan terhadap lima bakteri
yang mewakili hasil perwarnaan Gram yang
berbeda, yaitu bakteri Gram positif dan
negatif. Bakteri Gram positif yang diujikan
adalah Staphylococcus aureus dan Bacillus
cureus. Bakteri Gram negatif yang diujikan
antara lain Escherichia coli, Salmonella
typhimurium, Pseudomonas flourosense.
Gambar 10 Hasil uji daya hambat isolat L.
plantarum
terhadap
pertumbuhan
bakteri
P.
flouresense dan E. coli.
Pengujian didasarkan atas pembentukan
zona bening disekitar kertas uji yang memiliki
diameter sekitar 0.6 cm (Gambar 10).
Menurut Paynter et al. (2007) isolat yang
mengandung plantaricin F dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri
Gram
negatif.
Proses
penghambatan
plantaricin
F
dalam
menghambat
pertumbuhan bakteri dengan menggunakan
mekanisme barrel stave. Pada mekanisme ini
plantaricin akan berikatan dengan membran
target dan membentuk pori sehingga membran
target menjadi rusak (Jorgenrud 2009).
Sepuluh isolat pengujian aktivitas L.
plantarum (Mar A5, Bst 1, Mar C7, TB(N),
Mg Tm 1, Mg PSM B3, TB(S), MKw 9, Bst
5, Mar B4) yang digunakan menghasilkan
tingkat penghambatan yang berbeda-beda
(Gambar 11). Berdasarkan metode David
stout,
ABSTRAK
DWI FEBRIYANA. Konstruksi Marka Gen Plantaricin F Lactobacillus
plantarum. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMI SENO dan NOVIK
NURHIDAYAT.
Lactobacillus plantarum merupakan bakteri yang dapat berperan sebagai
probiotik. Bakteri ini memiliki plantaricin F yang berguna menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif dan negatif. Penelitian ini menggunakan
sepuluh isolat L. plantarum (Mar A5, Bst 1, Mar C7, TB(N), Mg Tm 1, Mg PSM
B3, TB(S), MKw 9, Bst 5, Mar B4) yang berasal dari buah-buahan tropis (mangga
kweni, manggis, markisa, dan terong belanda). Penelitian ini dilakukan untuk
konstruksi marka gen pln F dan menganalisis ekspresi relatif gen pln F serta uji
aktivitas antibakteri. Pengujian gen pln F menggunakan RT-PCR menghasilkan
pita DNA berukuran 70 pb. Hasil pengujian ini selanjutnya dipakai untuk
menentukan nilai ekspresi relatif gen pln F menggunakan software CS Analyzer.
Nilai ekspresi relatif gen tertinggi didapat dari isolat TB (S) dengan nilai 28.13
Au. Uji aktivitas antibakteri dilakukan untuk melihat hubungan antara gen pln F
dengan aktivitas penghambatan isolat terhadap bakteri uji. Uji aktivitas antibakteri
dilakukan terhadap lima bakteri antara lain Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan Pseudomonas
flouresense. Penghambatan tertinggi terhadap S. aureus terdapat pada isolat Mg
PSM B3 dengan diameter penghambatan 2.50 cm. Isolat Mar A5 memiliki
penghambatan tertinggi terhadap bakteri S. typhimurium, E. coli, dan P.
flouresense dengan diameter penghambatan masing-masing 1.33 cm, 1.83 cm, dan
1.16 cm. Isolat Mar B4 dan Bst 5 memiliki penghambatan tertinggi terhadap
bakteri B. cureus dengan diameter sekitar 0.50 cm.
3
ABSTRACT
DWI FEBRIYANA. Gene Marker Construction of Plantaricin F Lactobacillus
plantarum. Under the supervision of DJAROT SASONGKO HAMI SENO and
NOVIK NURHIDAYAT
Lactobacillus plantarum is a bacteria that can act as a probiotics. This
bacteria has a useful plantaricin F that can inhibit the growth of gram positive and
gram negative bacteria. This research used ten isolates L. plantarum (Mar A5, Bst
1, Mar C7, TB (N), Tm Mg 1, Mg PSM B3, TB (S), MKW 9, Bst 5, Mar B4)
derived from the tropical fruits (mango kweni, mangosteen, passion fruit, and
eggplant netherlands). This research was conducted for gene marker construction
of plantaricin F and relative gene expression of plantaricin F analysis using and
the antibacterial activity test. Pln F gene were tested using RT-PCR and produced
DNA band size 70 bp. Test results were then used to determine relative gene
expression values of pln F using CS Analyzer software. The highest relative gene
expression values obtained from isolates TB (S) with a value of 28.13 Au.
Antibacterial activity test carried out to see the relationship between gene pln F
with inhibitory activity against bacterial isolates tested. Antibacterial activity test
carried out on five bacteria such as Salmonella typimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, and Pseudomonas flouresense. The
highest inhibition against S.aureus isolates found in Mg PSM B3 with a diameter
of 2.50 cm of inhibition. Mar A5 isolates had the highest inhibition against S
.typhimurium bacteria, E. coli, and P. flouresense with a diameter of inhibition of
each of 1.33 cm, 1.83 cm, and 1.16 cm. The Mar B4 and Bst 5 isolates had the
highest inhibition against bacteria B.cureus with a diameter of about 0.50 cm. The
results showed that there was no correlation between relative gene expression to
the inhibition of test bacteria from L. plantarum.
PENDAHULUAN
Istilah probiotik telah umum dikenal
masyarakat. Menurut Ogueke et al. (2010),
probiotik merupakan mikroorganisme hidup
yang dapat meningkatkan kesehatan inangnya.
Mikroorganisme tersebut berguna bagi saluran
pencernaan karena memiliki kemampuan
dalam memperbaiki mikroflora di dalam usus.
Mikroorganisme yang bermanfaat sebagai
probiotik salah satunya berasal dari golongan
bakteri asam laktat (Endaryanto & Harsono
2005). Sifat penting bakteri asam laktat yang
berguna sebagai probiotik adalah aktivitasnya
dalam menghasilkan beberapa metabolit
antimikroba seperti asam organik (asam
laktat, asam asetat, dan asam propionat),
hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, dan
diasetil (Suskovic et al. 2001). Sifat ini dapat
dimanfaatkan dalam menghambat bakteri
patogen yang dapat menurunkan kesehatan
inangnya (Rohmawati 2010).
Kebanyakan bakteri asam laktat yang
digunakan sebagai probiotik berasal dari
genus Lactobacillus sp. dengan spesies L.
plantarum, L. casei, L. acidophilus, dan L.
johnsonii (Ogueke et al. 2010). L. plantarum
merupakan salah satu bakteri yang sering
digunakan sebagai probiotik. Beberapa
penelitian membuktikan bahwa L. plantarum
dapat dijumpai pada buah-buahan dan sayursayuran. L. plantarum bisa terdapat pada
buah-buahan tropis, seperti mangga, markisa,
manggis (Widyastuti et al. 1998), dan
belimbing (Lu et al. 2003).
Bakteri L. plantarum merupakan salah
satu bakteri yang penting dalam bidang
industri khususnya fermentasi (Moghadam et
al. 2010), pengawetan makanan, dan
keamanan pangan (Holo et al. 2001).
Beberapa sifat yang menguntungkan dari L.
plantarum antara lain kemampuannya yang
dapat bertahan pada asam yang tinggi, dan
mengeluarkan senyawa antimikroba misalnya
bakteriosin (Moghadam et al. 2010).
Bakteriosin merupakan protein yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba (Prabowo
2010).
Bakteriosin yang terdapat pada L.
plantarum dinamakan plantaricin. Beberapa
karakteristik yang dimiliki plantaricin yaitu
umumnya stabil pada suhu tinggi, kationik,
hidrofobik, tahan pada asam yang tinggi (Holo
et al. 2001), dan memiliki aktivitas
antimikroba (Anderssen et al. 1998). Aktivitas
antimikroba yang dihasilkan oleh plantaricin
berbeda-beda, misalnya pada plantaricin W
dan C dapat menghambat bakteri Gram positif
(Holo et al. 2010; Barcena et al. 1998). Salah
satu plantaricin yang memiliki kemampuan
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Gram positif dan negatif adalah plantaricin F
(Paynter et al. 1997).
Karakteristik
yang
dimiliki
oleh
plantaricin F yaitu memiliki 34 residu asam
amino, berat 3545 Da, dan titik isoelektrik
sebesar 10.7. Plantaricin ini dikode oleh gen
pln F. Gen ini berada dalam satu operon
dengan pln E dan pln I (Jorgenrud 2009).
Bakteriosin ini dapat menghambat beberapa
bakteri yang penting penyebab food borne
disease, antara lain Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus, dan
Pseudomonas aeruginosa (Paynter et al.
1997). Kemampuan penghambatan plantaricin
ini memiliki spektrum penghambatan bakteri
yang luas sehingga dapat menjadi probiotik
yang baik.
Penelitian ini bertujuan konstruksi marka
gen plantaricin F dengan melakukan
perancangan primer untuk gen pln F dan
menganalisis ekspresi relatif gen pln F pada
isolat L. plantarum yang berasal dari buahbuahan tropis (mangga kweni, manggis,
markisa, dan terong belanda). Selain itu,
penelitian juga dilakukan untuk menguji
aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji antara
lain Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan
Pseudomonas
flouresense.
Hipotesis
penelitian ini adalah tiap-tiap isolat yang
membawa gen pln F memiliki aktivitas
penghambatan terhadap bakteri Gram positif
dan negatif. Hasil yang diharapkan dapat
teridentifikasi adanya gen pln F pada seluruh
isolat yang digunakan dan didukung dengan
uji antibakteri L. plantarum sehingga dapat
memberikan gambaran untuk dapat dijadikan
probiotik yang baik.
TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
L. plantarum termasuk dalam kingdom
Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo
Lactobacillales, famili Lactobacillaceae, dan
genus Lactobacillus. Bakteri ini mempunyai
bentuk batang dan umumnya dalam rantairantai pendek. L. plantarum merupakan
bakteri Gram positif dan salah satu anggota
bakteri asam laktat yang biasanya digunakan
dalam fermentasi makanan (IGEM 2009).
Bakteri ini mempunyai suhu yang optimal
lebih rendah atau sama dengan 370C dan
PENDAHULUAN
Istilah probiotik telah umum dikenal
masyarakat. Menurut Ogueke et al. (2010),
probiotik merupakan mikroorganisme hidup
yang dapat meningkatkan kesehatan inangnya.
Mikroorganisme tersebut berguna bagi saluran
pencernaan karena memiliki kemampuan
dalam memperbaiki mikroflora di dalam usus.
Mikroorganisme yang bermanfaat sebagai
probiotik salah satunya berasal dari golongan
bakteri asam laktat (Endaryanto & Harsono
2005). Sifat penting bakteri asam laktat yang
berguna sebagai probiotik adalah aktivitasnya
dalam menghasilkan beberapa metabolit
antimikroba seperti asam organik (asam
laktat, asam asetat, dan asam propionat),
hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, dan
diasetil (Suskovic et al. 2001). Sifat ini dapat
dimanfaatkan dalam menghambat bakteri
patogen yang dapat menurunkan kesehatan
inangnya (Rohmawati 2010).
Kebanyakan bakteri asam laktat yang
digunakan sebagai probiotik berasal dari
genus Lactobacillus sp. dengan spesies L.
plantarum, L. casei, L. acidophilus, dan L.
johnsonii (Ogueke et al. 2010). L. plantarum
merupakan salah satu bakteri yang sering
digunakan sebagai probiotik. Beberapa
penelitian membuktikan bahwa L. plantarum
dapat dijumpai pada buah-buahan dan sayursayuran. L. plantarum bisa terdapat pada
buah-buahan tropis, seperti mangga, markisa,
manggis (Widyastuti et al. 1998), dan
belimbing (Lu et al. 2003).
Bakteri L. plantarum merupakan salah
satu bakteri yang penting dalam bidang
industri khususnya fermentasi (Moghadam et
al. 2010), pengawetan makanan, dan
keamanan pangan (Holo et al. 2001).
Beberapa sifat yang menguntungkan dari L.
plantarum antara lain kemampuannya yang
dapat bertahan pada asam yang tinggi, dan
mengeluarkan senyawa antimikroba misalnya
bakteriosin (Moghadam et al. 2010).
Bakteriosin merupakan protein yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba (Prabowo
2010).
Bakteriosin yang terdapat pada L.
plantarum dinamakan plantaricin. Beberapa
karakteristik yang dimiliki plantaricin yaitu
umumnya stabil pada suhu tinggi, kationik,
hidrofobik, tahan pada asam yang tinggi (Holo
et al. 2001), dan memiliki aktivitas
antimikroba (Anderssen et al. 1998). Aktivitas
antimikroba yang dihasilkan oleh plantaricin
berbeda-beda, misalnya pada plantaricin W
dan C dapat menghambat bakteri Gram positif
(Holo et al. 2010; Barcena et al. 1998). Salah
satu plantaricin yang memiliki kemampuan
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Gram positif dan negatif adalah plantaricin F
(Paynter et al. 1997).
Karakteristik
yang
dimiliki
oleh
plantaricin F yaitu memiliki 34 residu asam
amino, berat 3545 Da, dan titik isoelektrik
sebesar 10.7. Plantaricin ini dikode oleh gen
pln F. Gen ini berada dalam satu operon
dengan pln E dan pln I (Jorgenrud 2009).
Bakteriosin ini dapat menghambat beberapa
bakteri yang penting penyebab food borne
disease, antara lain Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus, dan
Pseudomonas aeruginosa (Paynter et al.
1997). Kemampuan penghambatan plantaricin
ini memiliki spektrum penghambatan bakteri
yang luas sehingga dapat menjadi probiotik
yang baik.
Penelitian ini bertujuan konstruksi marka
gen plantaricin F dengan melakukan
perancangan primer untuk gen pln F dan
menganalisis ekspresi relatif gen pln F pada
isolat L. plantarum yang berasal dari buahbuahan tropis (mangga kweni, manggis,
markisa, dan terong belanda). Selain itu,
penelitian juga dilakukan untuk menguji
aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji antara
lain Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan
Pseudomonas
flouresense.
Hipotesis
penelitian ini adalah tiap-tiap isolat yang
membawa gen pln F memiliki aktivitas
penghambatan terhadap bakteri Gram positif
dan negatif. Hasil yang diharapkan dapat
teridentifikasi adanya gen pln F pada seluruh
isolat yang digunakan dan didukung dengan
uji antibakteri L. plantarum sehingga dapat
memberikan gambaran untuk dapat dijadikan
probiotik yang baik.
TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
L. plantarum termasuk dalam kingdom
Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo
Lactobacillales, famili Lactobacillaceae, dan
genus Lactobacillus. Bakteri ini mempunyai
bentuk batang dan umumnya dalam rantairantai pendek. L. plantarum merupakan
bakteri Gram positif dan salah satu anggota
bakteri asam laktat yang biasanya digunakan
dalam fermentasi makanan (IGEM 2009).
Bakteri ini mempunyai suhu yang optimal
lebih rendah atau sama dengan 370C dan
2
mempunyai
ukuran sekitar 0.5-10 µm
(Suparman 2010).
Peranan
L.
plantarum
sebagai
antimikrobial dapat dimanfaatkan dalam
fermentasi makanan karena L. plantarum
toleran terhadap pH rendah dibandingkan
dengan bakteri asam laktat lainnya (Lu et al.
2003). L. plantarum juga dapat memproduksi
bakteriosin yang dapat berguna sebagai
antimikrobial. Bakteriosin yang dihasilkan
oleh Lactobacillus plantarum memiliki
banyak jenis, misalnya plantaricin A,
plantaricin F, plantaricin W, dan plantaricin
NC8 (Cho et al. 2010).
Gambar 1
Lactobacillus plantarum (IGEM
2009).
Probiotik
Probiotik merupakan mikroorganisme
bukan patogen yang jika digunakan akan
memberikan pengaruh positif terhadap
fisiologi dan kesehatan inangnya (Triana et al.
2006).
Mikroorganisme
ini
dapat
memperbaiki keseimbangan mikroflora usus.
Keseimbangan yang baik dalam ekosistem
mikrobiota usus dapat menguntungkan
kesehatan. Beberapa karakteristik probiotik
yang dapat digunakan antara lain, mempunyai
kapasitas untuk bertahan hidup dan
melakukan
kolonisasi,
mampu
mempertahankan keseimbangan mikroflora
usus yang sehat melalui kompetisi dan inhibisi
mikroba patogen, menstimulasi sistem
pertahanan tubuh, tidak bersifat toksik dan
patogen, mempunyai karakteristik teknologi
yang baik yaitu mampu bertahan selama
penyimpanan dan penggunaan dalam bentuk
preparat makanan yang didinginkan dan
dikeringkan, agar dapat disediakan secara
masal dalam industri (Aulia 2010).
Probiotik telah digunakan berabad-abad
sebagai komponen bahan tambahan makanan.
Terdapat tiga mekanisme kerja probiotik,
yaitu menekan pertumbuhan mikroorganisme
patogen pada saluran pencernaan melalui
produksi substansi mikrob (asam laktat, asam
asetat, asetaldehida, hidrogen peroksida, dan
bakteriosin),
persaingan
mendapatkan
makanan, persaingan reseptor pada dinding
usus; merubah metabolisme mikrobial dengan
meningkatkan
aktivitas
enzim
yang
bermanfaat atau menekan aktivitas enzim
yang tidak bermanfaat; dan merangsang
pembentukkan kekebalan tubuh (Suskovic et
al. 2001). Bakteri yang paling banyak
digunakan sebagai probiotik berasal dari
golongan bakteri asam laktat. Bakteri ini
penting dalam pengawetan bahan makanan
dan melawan bakteri patogen melalui
pembentukan senyawa peptida antimikroba
(Suparjo 2008).
Plantaricin F
Plantaricin merupakan bakteriosin yang
dikeluarkan oleh L. plantarum (Cho et al.
2010). Plantaricin memilki banyak jenis, yaitu
plantaricin A, plantaricin B, plantaricin C,
plantaricin C19, plantaricin F, plantaricin EF,
plantaricin T, plantaricin S, plantaricin 154,
plantaricin SA 6, plantaricin KW30,
plantaricin UGI, plantaricin 406. Masingmasing
plantaricin
memiliki
aktivitas
antimikroba yang berbeda-beda, misalnya
pada plantaricin W dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif (Holo et al.
2001). Salah satu plantaricin yang memiliki
aktivitas antimikroba pada bakteri Gram
negatif dan bakteri gram positif adalah
plantaricin F. Plantaricin ini memiliki
kemampuan stabil pada suhu tinggi dan pH
yang rendah sehingga dapat dimanfaatkan
untuk keperluan fermentasi. Selain itu,
mempunyai aktivitas dalam menghambat
bakteri yang menyebabkan food borne
disease, antara lain L. monocytogenes,
Salmonella sp., P. aeroginosa, dan S. aureus
(Paynter et al. 1997).
Mekanisme
plantaricin
F
dalam
menyerang inangnya adalah dengan cara
membuat pori pada membran. Terdapat dua
mekanisme utama, yairtu model barrel stave
dan model carpet. Model barrel stave
memiliki mekanisme yaitu peptida dari
bakteriosin berasosiasi dengan membran
target dan membentuk pori pada bagian
lapisan lipid, sedangkan model carpet
memiliki mekanisme dengan peptida dari
bakteriosin tidak menembus bagian lipid
bilayer tetapi membungkus membran target
(Jorgenrud 2009).
Isolasi RNA
Isolasi RNA
merupakan tahap yang
memiliki resiko terhadap degradasi dan
kontaminasi yang tinggi. Molekul RNA
3
memiliki waktu paruh yang pendek, mudah
rusak, dan mudah didegradasi oleh RNase
(Wilson & Walker 2000). Secara umum
terdapat tiga tahapan yaitu pemecahan sel dan
solubilitas membran, isolasi dan pemurnian
RNA, dan pemekatan RNA. Pemecahan sel
dan solubilitas membran harus dilakukan
secara cepat dan tuntas agar menginaktifkan
kerja ribonuklease. Pemecahan sel dilakukan
dengan menggunakan larutan sodium dedosil
sulfat (SDS) 10% dan lisozim 5 mg/mL. SDS
10% merupakan deterjen anionik yang dapat
digunakan untuk menghancurkan membran
sel dari bakteri (Berg et al. 2005), sedangkan
lisozim
5
mg/mL
berfungsi
untuk
mendegradasi ikatan antara asam Nasetilmuramat dan N-asetil-D-glukosamin
yang terdapat pada dinding sel bakteri
(Murray et al. 2009). Pemurnian dilakukan
dengan penambahan fenol dan kloroform
yang bertujuan untuk penghilangan protein.
Fenol merupakan senyawa yang dapat
mendenaturasi protein (Pelczar & Chan 2005),
sedangkan tahapan pemekatan dengan
isopropanol dan etanol 70%.
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah
suatu metode in vitro untuk amplifikasi
sejumlah fragmen DNA spesifik dengan
panjang dan sekuen yang telah ditentukan dari
sejumlah kecil cetakan (Wirawan 2004).
Metode ini memungkinkan
amplifikasi
fragmen DNA yang diinginkan dengan
sensitivitas dan selektivitas yang tinggi serta
berlangsung dalam waktu yang cepat
(McPherson & Moller 2006).
Proses PCR berlangsung dalam beberapa
tahap, antara lain tahap denaturasi,
penempelan primer, dan sintesis DNA. Tahap
denaturasi dimulai DNA utas ganda diurai
menjadi DNA utas tunggal dengan tahap
proses pemanasan, biasanya suhu yang
digunakan 94 OC. Suhu pada denaturasi dijaga
pada waktu tertentu sampai DNA menjadi
utas tunggal. Waktu tahap denaturasi berkisar
2-5 menit (McPherson & Moller 2006).
Tahap penempelan primer merupakan
tahapan kedua dari proses PCR. Temperatur
pada tahap ini diturunkan, hal ini dilakukan
agar primer dapat menempel secara
komplementer dengan templat atau cetakan.
Tahapan ketiga dari proses PCR adalah tahap
sintesis DNA. Tahapan ini biasanya
memerlukan suhu sekitar 72 OC. Suhu ini
merupakan suhu yang optimum bagi DNA
polymerase dalam melakukan sintesis (Mc
Pherson & Moller 2006). Penggunaan DNA
polymerase pada PCR menggunakan Taq
polymerase termostabil yang diisolasi dari
bakteri thermofilik Thermus aquaticus
(Wirawan 2004). Seluruh proses ini dapat
dilihat pada Gambar 2 dan 3 yang
menjelaskan semua tahap mengenai proses
PCR.
Komponen-komponen yang berperan
dalam PCR antara lain primer, cetakan atau
templat, bufer, dNTPs, dan Thermal Stable
Polymerase. Primer dalam PCR terdiri atas
sepasang primer dari oligonukleotida sintetik
memulai sintesis DNA (Potter et al. 2007).
Gambar 2 Reaksi denaturasi dan penempelan
primer pada proses PCR (Potter et
al. 2007).
Gambar 3 Reaksi sintesis DNA oleh Taq
polimerase (Potter et al. 2007).
4
Reverse Transkriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) merupakan metode yang
digunakan untuk memperbanyak cDNA dari
RNA yang digunakan sebagai cetakan.
Metode ini memiliki keunggulan berupa
sensitif, cepat, dan fleksibel terhadap gen
target dan memberikan informasi mengenai
gen target. Reaksi pada RT-PCR didasarkan
atas kemampuan enzim reverse transcriptase
dalam menghasilkan untai komplementer
sehingga
terbentuk
cDNA
dengan
menggunakan m-RNA sebagai cetakan atau
templat (McPherson & Moller 2006).
Tahapan pada RT-PCR awalnya, primer
oligo-dT akan menempel pada bagian poli-A
mRNA di ujung 5’. Tahapan berikutnya,
terjadi pembentukan utas pertama dan
dilakukan penambahan RNase H untuk
menyingkirkan RNA serta enzim reverse
transcriptase sehingga hasil yang diperoleh
adalah cDNA. Molekul cDNA tersebut akan
digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR
selanjutnya. Metode ini biasanya digunakan
untuk menentukan ekspresi gen, atau
identifikasi sekuen suatu transkripsi RNA,
termasuk permulaan transkripsi dan daerah
terminasi (Wilson 2000). Proses RT-PCR
dijelaskan pada Gambar 4.
suatu molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, misalnya
gel agarosa, lalu dialirkan arus listrik dari satu
kutub ke kutub yang berlawanan muatan maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif (Yuwono 2005).
Elektroforesis berlangsung dalam gel
agarosa sebagai medium pemisahan molekul.
Molekul DNA atau RNA bermigasi
berdasarkan ukuran dan bentuk. Molekul kecil
akan berpindah lebih cepat dibandingkan
dengan molekul yang lebih besar. Ukuran
DNA yang tidak diketahui saat migrasi bisa
dibandingkan dengan penanda (Potter et al.
2007).
Elektroforesis dapat digunakan untuk
analisis DNA menggunakan gel agarosa. Gel
agarosa merupakan suatu bahan semi padat
berupa polisakarida yang diekstraksi dari
rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan
melarutkannya pada bufer dan dibantu dengan
proses pemanasan. Larutan bufer yang
digunakan biasanya menggunakan tris asetatEDTA (TAE) atau tris borat EDTA (TBE).
Larutan elektroforesis yang telah dicampurkan
dengan bufer dan melalui proses pemanasan
dituang dalam lempeng dan ditancapkan sisir
agar terbentuk lubang-lubang kecil untuk
tempat memasukkan sampel. Gel agarosa
yang telah terbentuk direndam dalam tangki
bersama bufer yang digunakan untuk
membuat gel (Yuwono 2005).
Hasil elektroforesis dapat dilihat secara
visual dengan menggunakan EtBr (ethidium
bromida) dan sinar ultra violet (UV).
Ethidium
bromida
merupakan
suatu
intercalating agent yang biasanya digunakan
dalam mewarnai asam nukleat. Biasanya hasil
elektroforesis bila diwarnai dalam EtBr akan
berwarna merah keunguan. Senyawa ini
mempunyai rumus kimia C21H20BrN3 yang
bersifat
mutagen
sehingga
dapat
menyebabkan iritasi. Selain itu, senyawa ini
bersifat karsinogenik (Lun & Sansone 1987).
Gambar 4 Reaksi RT-PCR (Mc Pherson &
Moller 2006).
Perancangan Primer
Primer merupakan DNA rantai pendek
yang terdiri atas beberapa nukleotida. Primer
ini berfungsi sebagai awalan proses sintesis
yang berlangsung dalam PCR. Awalnya
primer akan menempel pada target dan
membentuk rangkaian komplementer pada
untai DNA yang berlawanan serta mengapit
rangkaian sasaran (Potter et al. 2007). Proses
perancangan primer sangat penting, proses ini
dapat menggunakan beberapa program, misal
Primer3
(http:frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3) dan Oligo perfect Designer
Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu teknik
pemisahan molekul seluler berdasarkan
ukuran dengan menggunakan medan listrik
yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik
ini dapat digunakan dengan memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul.
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk
analisis DNA, RNA, maupun protein. Jika
5
(http://www.invitrogen.com/ ) (McPherson &
Moller 2006).
Situs lain dalam perancangan primer
adalah www.ncbi.nlm.nih.gov, dalam situs ini
terdapat BLAST. BLAST merupakan program
pencarian kesamaan yang didesain untuk
mengeksplorasi semua database sekuen yang
diminta, baik itu berupa DNA atau protein.
Program BLAST juga dapat digunakan untuk
mendeteksi hubungan diantara sekuen pada
daerah tertentu yang memiliki kesamaan atau
homologi (Aprijani & Efaizi 2004). Peranan
BLAST dalam desain primer salah satunya
untuk pencarian basis data berdasarkan pada
hasil pensejajaran sekuen yang berasal DNA
maupun protein. Selain itu, dapat digunakan
untuk mengidentifikasi homolog dari molekul
baru. Beberapa kriteria dari primer, antara lain
% G dan C lebih dari 50%, tidak memiliki
kemungkinan saling komplemen antara basa
dalam satu rantai primer atau primer lainnya,
memiliki 18-25 pasang basa, tidak
membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian
ini adalah autoklaf, laminar air flow, pipet
mikro, cawan Petri, tabung reaksi, inkubator,
oven, labu Erlenmeyer, dan spektrofotometer.
Alat-alat lain yang digunakan adalah tabung
Eppendorf, waterbath, sentrifus 5415 R,
termometer, gelas piala, Takara PCR Thermal
cycler, elektroforesis ATTO, printgraph
ATTO, kertas uji, pinset, densitometer dengan
program CS Analyzer, dan gunting.
Tabel 1 Isolat L. plantarum yang digunakan
Kode isolat
Asal isolate
Mar A5
Markisa
Bst 1
Manggis
MarC7
Markisa
TB (N)
Terong Belanda
Mg Tm 1
Manggis
Mg PSM B3
Manggis
TB(S)
Terong Belanda
Mkw 9
Mangga kweni
Bst 5
Manggis
Mar B4
Markisa
Bahan yang digunakan antara lain
media glucose yeast extract (GYP), 10 Isolat
Lactobacillus plantarum yang berasal dari
berbagai macam buah (Tabel 1), 5 isolat
bakteri
uji
(Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Bacillus
cureus,
dan
Pseudomonas
flouresense), potassium asetat, kloramfenikol
30 µg, fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut), kloroform, isopropanol,
lisozim 5 mg/mL, SDS 10%, bufer TE pH 8,
aqua bidestilata steril, etanol 70%, etanol
absolut. Bahan lain yang digunakan adalah
Agarosa, bufer Tris Acid EDTA (TAE) 1X,
SuperScript III One-Step RT-PCR with
Platinum
Taq
Invitrogen
dan,
Diethylpyrocarbonat (DEPC).
Metode
Perancangan Primer
Perancangan primer dilakukan dengan
mencari
sekuen
dari
plantaricin
F
menggunakan
http:www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Sekuen yang diambil adalah sekuen yang
menyandikan gen tersebut. Kehomologian
sekuen dicari dengan program BLAST untuk
menentukan daerah yang terkonservasi.
Daerah yang terkonservasi adalah daerah yang
memiliki homologi yang signifikan dengan
gen yang berfungsi sama pada spesies lain.
Daerah terkonservasi didapatkan setelah
melakukan pensejajaran atau multiple
aligment dengan Crustal W2 yang dapat
digunakan pada situs http:www.ebi.ac.uk.
Primer yang dibuat harus memiliki syarat
umum yaitu % G dan C lebih dari 50%, tidak
memiliki kemungkinan saling komplemen
antara basa dalam satu rantai primer atau
primer lainnya, memiliki 18-25 pasang basa,
tidak membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001). Hasil rancangan
diuji
menggunakan
bantuan
program
komputer yaitu gene runner.
Pembuatan Media Glucose Yeast ExtractPeptone (GYP) (Triana et al. 2006)
Media ini dibuat dalam 200 mL dengan
komposisi yaitu 4 gram agar, 2 gram glukosa,
2 gram yeast extract, 0.4 gram beef extract, 1
gram pepton, Na-Asetat.3H2O 0.28 gram, 1
mL salt solution (0.1 gram MgSO4.7H2O, 0.1
gram MSO4.4H2O, 0.1 gram FeSO4.7H2O, 0.1
gram NaCl dilarutkan di dalam akuades
sebanyak 50 mL), 2 mL Tween 80, CaCO3
0.0375 gram/mL, dH2O sampai dengan 200
mL.
5
(http://www.invitrogen.com/ ) (McPherson &
Moller 2006).
Situs lain dalam perancangan primer
adalah www.ncbi.nlm.nih.gov, dalam situs ini
terdapat BLAST. BLAST merupakan program
pencarian kesamaan yang didesain untuk
mengeksplorasi semua database sekuen yang
diminta, baik itu berupa DNA atau protein.
Program BLAST juga dapat digunakan untuk
mendeteksi hubungan diantara sekuen pada
daerah tertentu yang memiliki kesamaan atau
homologi (Aprijani & Efaizi 2004). Peranan
BLAST dalam desain primer salah satunya
untuk pencarian basis data berdasarkan pada
hasil pensejajaran sekuen yang berasal DNA
maupun protein. Selain itu, dapat digunakan
untuk mengidentifikasi homolog dari molekul
baru. Beberapa kriteria dari primer, antara lain
% G dan C lebih dari 50%, tidak memiliki
kemungkinan saling komplemen antara basa
dalam satu rantai primer atau primer lainnya,
memiliki 18-25 pasang basa, tidak
membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian
ini adalah autoklaf, laminar air flow, pipet
mikro, cawan Petri, tabung reaksi, inkubator,
oven, labu Erlenmeyer, dan spektrofotometer.
Alat-alat lain yang digunakan adalah tabung
Eppendorf, waterbath, sentrifus 5415 R,
termometer, gelas piala, Takara PCR Thermal
cycler, elektroforesis ATTO, printgraph
ATTO, kertas uji, pinset, densitometer dengan
program CS Analyzer, dan gunting.
Tabel 1 Isolat L. plantarum yang digunakan
Kode isolat
Asal isolate
Mar A5
Markisa
Bst 1
Manggis
MarC7
Markisa
TB (N)
Terong Belanda
Mg Tm 1
Manggis
Mg PSM B3
Manggis
TB(S)
Terong Belanda
Mkw 9
Mangga kweni
Bst 5
Manggis
Mar B4
Markisa
Bahan yang digunakan antara lain
media glucose yeast extract (GYP), 10 Isolat
Lactobacillus plantarum yang berasal dari
berbagai macam buah (Tabel 1), 5 isolat
bakteri
uji
(Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Bacillus
cureus,
dan
Pseudomonas
flouresense), potassium asetat, kloramfenikol
30 µg, fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut), kloroform, isopropanol,
lisozim 5 mg/mL, SDS 10%, bufer TE pH 8,
aqua bidestilata steril, etanol 70%, etanol
absolut. Bahan lain yang digunakan adalah
Agarosa, bufer Tris Acid EDTA (TAE) 1X,
SuperScript III One-Step RT-PCR with
Platinum
Taq
Invitrogen
dan,
Diethylpyrocarbonat (DEPC).
Metode
Perancangan Primer
Perancangan primer dilakukan dengan
mencari
sekuen
dari
plantaricin
F
menggunakan
http:www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Sekuen yang diambil adalah sekuen yang
menyandikan gen tersebut. Kehomologian
sekuen dicari dengan program BLAST untuk
menentukan daerah yang terkonservasi.
Daerah yang terkonservasi adalah daerah yang
memiliki homologi yang signifikan dengan
gen yang berfungsi sama pada spesies lain.
Daerah terkonservasi didapatkan setelah
melakukan pensejajaran atau multiple
aligment dengan Crustal W2 yang dapat
digunakan pada situs http:www.ebi.ac.uk.
Primer yang dibuat harus memiliki syarat
umum yaitu % G dan C lebih dari 50%, tidak
memiliki kemungkinan saling komplemen
antara basa dalam satu rantai primer atau
primer lainnya, memiliki 18-25 pasang basa,
tidak membentuk primer dimer, waktu melting
temperature (Tm) tidak melebihi 700C
(Sambrook & Russel 2001). Hasil rancangan
diuji
menggunakan
bantuan
program
komputer yaitu gene runner.
Pembuatan Media Glucose Yeast ExtractPeptone (GYP) (Triana et al. 2006)
Media ini dibuat dalam 200 mL dengan
komposisi yaitu 4 gram agar, 2 gram glukosa,
2 gram yeast extract, 0.4 gram beef extract, 1
gram pepton, Na-Asetat.3H2O 0.28 gram, 1
mL salt solution (0.1 gram MgSO4.7H2O, 0.1
gram MSO4.4H2O, 0.1 gram FeSO4.7H2O, 0.1
gram NaCl dilarutkan di dalam akuades
sebanyak 50 mL), 2 mL Tween 80, CaCO3
0.0375 gram/mL, dH2O sampai dengan 200
mL.
6
Bahan-bahan ditimbang dan dimasukkan
ke dalam gelas piala 1 L. Ditambahkan dH2O
sampai dengan 200 mL lalu diaduk sampai
homogen. Campuran dipanaskan dan diaduk
dengan pengaduk stirer. Sebelum dipindahkan
ke dalam cawan Petri terlebih dahulu
campuran disterilisasi dengan autoklaf pada
suhu 121 0 C selama 15 menit. Media yang
telah mengalami proses sterilisasi dipindahkan
ke dalam cawan Petri yang telah disterilkan
dan dibiarkan hingga membeku. Media GYP
yang telah membeku siap digunakan untuk
menumbuhkan bakteri.
Pembuatan media GYP cair dilakukan
dengan mencampurkan semua bahan kecuali
agar dan CaCO3 ke dalam labu Erlenmeyer
dan dikocok dengan pengaduk magnetik
hingga homogen. Setelah itu dibagi rata ke
dalam beberapa tabung reaksi sebanyak 5 mL
dan ditutup dengan sumbat kapas. Media cair
GYP ini kemudian disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 1210C selama 15 menit dan
digunakan untuk kultivasi bakteri.
Kultivasi Bakteri
Isolat bakteri L. plantarum yang
digunakan untuk isolasi RNA terdapat pada
Tabel 1. Biakan bakteri yang telah disiapkan
digores sebanyak satu ose dalam media GYP
padat. Pekerjaan ini dilakukan dalam laminar
air flow secara aseptik. Media GYP padat
kemudian diinkubasi dalam inkubator selama
24-48 jam pada suhu 370C. Hasil yang
terbentuk berupa koloni tunggal yang
menunjukkan bahwa koloni tersebut murni.
Biakan murni yang tumbuh pada media padat
dipindahkan dalam media cair. Pekerjaan ini
juga dilakukan dalam Laminar air flow. Media
kemudian diinkubasi selama 12-18 jam pada
suhu 370C. Hasilnya dapat dilakukan
pemanenan sel yang dapat digunakan untuk
proses isolasi RNA.
Isolasi Total RNA (Sambrook et al. 1989)
Prosedur
isolasi total RNA dimulai
dengan pemanenan L. plantarum. Kultur
bakteri yang telah tumbuh dalam media cair
dipindahkan dalam tabung Eppendorf 2 mL
dan disentrifus 7000 rpm selama 5 menit.
Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan 1
mL fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95%
etanol absolut) dan dicampurkan hingga
homogen. Campuran tersebut disentrifus 8000
rpm selama 5 menit.
Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan
800 µL lisozim 5 mg/mL lalu dihomogenkan
dengan cara dibolak-balik dan di-vortex.
Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama
15 menit dan ditambahkan 300 µL SDS 10%
lalu dihomogenkan kembali. Campuran
tersebut diinkubasi kembali pada suhu 650C
selama 3 menit dan ditambahkan 200 µL
potassium
asetat.
Campuran
tersebut
kemudian dipanaskan pada suhu 800C-900C
selama 5 menit dan disimpan dalam ice box
selama 3 menit. kemudian sebanyak 80 µL
hot phenol ditambahkan dalam campuran
tersebut.
Campuran dipanaskan pada suhu 800C0
90 C selama 5 menit dan disentrifus selama 5
menit pada 8000 rpm. Supernatan diambil
dan
ditambahkan
kloroform
dengan
perbandingan
1:1
dan
dibolak-balik.
Campuran disentrifus 8000 rpm selama 5
menit
sehingga terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas diambil dan ditambahkan 500 µL
isopropanol lalu dibolak-balik.
Hasilnya
disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Pelet
yang terbentuk ditambahkan sebanyak 500
µL etanol 70% dan disentrifus 8000 rpm
selama 5 menit. Tahapan penambahan etanol
70% dilakukan sebanyak dua kali. Pelet yang
terbentuk dikeringkan sampai tidak terdapat
etanol. Bila sudah kering ditambahkan 50 µL
DEPC 0.1%. Hasil isolasi dicek menggunakan
agarosa 1.5%.
Pengukuran Kualitas RNA (Microarrays
2000)
Kualitas RNA dapat diukur menggunakan
alat spektrofotometer
pada panjang
gelombang 260 nm/280 nm. Sampel RNA
sebanyak 10 µL diambil dan ditambahkan 990
µL air yang telah mendapat perlakuan
Diethylpyrocarbonat (DEPC). Kuvet yang
digunakan dalam keadaan bersih dari
kontaminasi RNase. Baca absorban pada 260
nm/280 nm.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) (Invitrogen 2007)
Bahan-bahan berasal SuperScript III OneStep RT-PCR with Platinum Taq Invitrogen.
Campuran reaksi disiapkan yang terdiri atas
12.5 µL 2X reaction mix, 1 µL primer
reverse, 1 µL primer forward, 1 µL taq mix,
9.5 µL aqua bidestilata steril, dan 1 µL
sampel total
RNA. Campuran tersebut
disentrifugasi singkat selama 1 menit agar
homogen. Campuran dimasukkan kedalam
mesin PCR. Reaksi dimulai dengan program 1
siklus 550C selama 30 menit, 1 siklus 940C
selama 4 menit, 40 siklus yang terdiri atas
940C selama 30 detik, 550C selama 30 detik,
720C selama 1 menit, 1 siklus 720C selama 7
7
menit, dan 1 siklus 40C. Hasil disimpan pada
suhu -200C.
Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis hasil PCR dimulai dengan
menyiapkan agarosa 2%. Sebanyak 2.6 gram
agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 130
mL TAE 1X. Campuran kemudian dipanaskan
dalam microwave. Campuran ditempatkan
pada bak elektroforesis yang telah disusun.
Agarosa yang dapat digunakan bila sudah
keras. Elektroforesis sampel selama 60 menit
pada 100 volt. Hasil dapat dilihat di alat
Printgraph ATTO .
Pengukuran
Ekspresi
gen
pln
F
(Nurhidayat 2010)
Pengukuran ekspresi gen pln F
menggunakan software CS Analyzer. Cara
kerja CS Analyser adalah setelah dilakukan
analisis elektroforesis gel agarosa, data hasil
elektroforesis berupa gambar di scanner dan
diubah menjadi data digital untuk mencari
data yang diperlukan. Proses perhitungan
dimulai dengan mengitung 1 µL RNA dari
RNA total dan RNA produk yang
dielektroforesis dari hasil CS Analyzer. Hasil
yang didapatkan akan menghasilkan ekspresi
gen dari plantaricin F dan 16s RNA.
Ekspresi gen
Hasil perhitungan dari ekspresi gen pln F
dan 16s RNA dapat menjelaskan ekspresi
relatif gen pln F yang terdapat pada masingmasing isolat.
Uji Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010)
Kultur cair dari sepuluh isolat L.
plantarum disiapkan dalam tabung Eppendorf
ukuran 2 mL dan disentrifus 12000 rpm
selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakan pada uji aktivitas. Lalu disiapkan
media padat GYP dan dibuat tanda pada
cawan Petri untuk kontrol positif, kontrol
negatif, dan sampel. Tahapan selanjutnya,
bakteri patogen yang telah ditumbuhkan
dalam media cair disebar dalam media GYP
padat sebanyak 100 µL. Bakteri patogen yang
digunakan ialah Escherichia coli, Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas flouresense, dan Bacillus
cureus. Kertas uji yang telah direndam di
dalam isolat
Lactobacillus
plantarum
ditempatkan pada cawan Petri yang telah
diberi tanda. Kontrol positif yang digunakan
pada percobaan ini adalah kloramfenikol dan
kontrol negatif ialah akuades steril. Lalu
inkubasi dalam inkubator selama 1 hari pada
suhu 370C.
Pengukuran Aktivitas Antibakteri (Gong et
al. 2010)
Hasil dari uji aktivitas yang telah
diinkubasi selama satu malam dilihat aktivitas
penghambatannya. Aktivitasnya dapat dilihat
apabila dari masing-masing sampel yang diuji
dapat menghasilkan zona bening. Zona bening
yang dihasilkan diukur diameternya dengan
menggunakan penggaris. Semakin besar
diameter zona bening maka akan semakin
tinggi aktivitas penghambatan dari bakteri
tersebut. Hasilnya dikoreksi dengan kontrol,
yaitu ukuran kertas uji sebesar 0.6 cm.
Diameter Penghambatan
HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA Total Lactobacillus plantarum
Isolasi
RNA
total
menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil
menunjukkan RNA total dari sepuluh isolat
L. plantarum
yang digunakan dalam
percobaan telah berhasil diisolasi. Kualitas
RNA
yang
telah
diisolasi
diukur
menggunakan
metode
spektrofotometri.
Pengukuran kualitas RNA ini sangat
diperlukan karena kualitas RNA yang baik
akan mempengaruhi keberhasilan sintesis
cDNA (Invitrogen 2007).
Tabel 2 Kuantifikasi RNA dari sepuluh isolat
L. plantarum
Isolat
Mar A5
Bst 1
MarC7
TB (N)
Mg Tm 1
Mg PSM
B3
TB(S)
Mkw 9
Bst 5
Mar B4
A260
2,96
2,737
2,552
2,872
0,945
A280
2,613
2,709
2,27
2,914
0,83
A260/280
1,1328
1,0103
1,1242
0,9856
1,1386
1,892
0,877
2,466
2,737
1,199
1,665
0,788
2,28
2,914
1,051
1,1363
1,1129
1,0816
0,9393
1,1408
Hasil pengukuran kualitas RNA diperoleh
dengan perbandingan absorban pada panjang
gelombang 260 nm dengan 280 nm.
Pengukuran pada panjang gelombang 260 nm
untuk mengukur asam nukleat, sedangkan
absorban dengan panjang gelombang 280 nm
digunakan untuk mengukur protein (Clark &
Cristopher 2001). Rasio pengukuran absorban
tersebut digunakan untuk menunjukkan
7
menit, dan 1 siklus 40C. Hasil disimpan pada
suhu -200C.
Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis hasil PCR dimulai dengan
menyiapkan agarosa 2%. Sebanyak 2.6 gram
agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 130
mL TAE 1X. Campuran kemudian dipanaskan
dalam microwave. Campuran ditempatkan
pada bak elektroforesis yang telah disusun.
Agarosa yang dapat digunakan bila sudah
keras. Elektroforesis sampel selama 60 menit
pada 100 volt. Hasil dapat dilihat di alat
Printgraph ATTO .
Pengukuran
Ekspresi
gen
pln
F
(Nurhidayat 2010)
Pengukuran ekspresi gen pln F
menggunakan software CS Analyzer. Cara
kerja CS Analyser adalah setelah dilakukan
analisis elektroforesis gel agarosa, data hasil
elektroforesis berupa gambar di scanner dan
diubah menjadi data digital untuk mencari
data yang diperlukan. Proses perhitungan
dimulai dengan mengitung 1 µL RNA dari
RNA total dan RNA produk yang
dielektroforesis dari hasil CS Analyzer. Hasil
yang didapatkan akan menghasilkan ekspresi
gen dari plantaricin F dan 16s RNA.
Ekspresi gen
Hasil perhitungan dari ekspresi gen pln F
dan 16s RNA dapat menjelaskan ekspresi
relatif gen pln F yang terdapat pada masingmasing isolat.
Uji Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010)
Kultur cair dari sepuluh isolat L.
plantarum disiapkan dalam tabung Eppendorf
ukuran 2 mL dan disentrifus 12000 rpm
selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan
digunakan pada uji aktivitas. Lalu disiapkan
media padat GYP dan dibuat tanda pada
cawan Petri untuk kontrol positif, kontrol
negatif, dan sampel. Tahapan selanjutnya,
bakteri patogen yang telah ditumbuhkan
dalam media cair disebar dalam media GYP
padat sebanyak 100 µL. Bakteri patogen yang
digunakan ialah Escherichia coli, Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas flouresense, dan Bacillus
cureus. Kertas uji yang telah direndam di
dalam isolat
Lactobacillus
plantarum
ditempatkan pada cawan Petri yang telah
diberi tanda. Kontrol positif yang digunakan
pada percobaan ini adalah kloramfenikol dan
kontrol negatif ialah akuades steril. Lalu
inkubasi dalam inkubator selama 1 hari pada
suhu 370C.
Pengukuran Aktivitas Antibakteri (Gong et
al. 2010)
Hasil dari uji aktivitas yang telah
diinkubasi selama satu malam dilihat aktivitas
penghambatannya. Aktivitasnya dapat dilihat
apabila dari masing-masing sampel yang diuji
dapat menghasilkan zona bening. Zona bening
yang dihasilkan diukur diameternya dengan
menggunakan penggaris. Semakin besar
diameter zona bening maka akan semakin
tinggi aktivitas penghambatan dari bakteri
tersebut. Hasilnya dikoreksi dengan kontrol,
yaitu ukuran kertas uji sebesar 0.6 cm.
Diameter Penghambatan
HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA Total Lactobacillus plantarum
Isolasi
RNA
total
menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil
menunjukkan RNA total dari sepuluh isolat
L. plantarum
yang digunakan dalam
percobaan telah berhasil diisolasi. Kualitas
RNA
yang
telah
diisolasi
diukur
menggunakan
metode
spektrofotometri.
Pengukuran kualitas RNA ini sangat
diperlukan karena kualitas RNA yang baik
akan mempengaruhi keberhasilan sintesis
cDNA (Invitrogen 2007).
Tabel 2 Kuantifikasi RNA dari sepuluh isolat
L. plantarum
Isolat
Mar A5
Bst 1
MarC7
TB (N)
Mg Tm 1
Mg PSM
B3
TB(S)
Mkw 9
Bst 5
Mar B4
A260
2,96
2,737
2,552
2,872
0,945
A280
2,613
2,709
2,27
2,914
0,83
A260/280
1,1328
1,0103
1,1242
0,9856
1,1386
1,892
0,877
2,466
2,737
1,199
1,665
0,788
2,28
2,914
1,051
1,1363
1,1129
1,0816
0,9393
1,1408
Hasil pengukuran kualitas RNA diperoleh
dengan perbandingan absorban pada panjang
gelombang 260 nm dengan 280 nm.
Pengukuran pada panjang gelombang 260 nm
untuk mengukur asam nukleat, sedangkan
absorban dengan panjang gelombang 280 nm
digunakan untuk mengukur protein (Clark &
Cristopher 2001). Rasio pengukuran absorban
tersebut digunakan untuk menunjukkan
8
kemurnian RNA terhadap kontaminasi
protein. Nilai yang diharapkan dari
pengukuran ini berkisar 1.8-2.1. (Sambrook
& Russel 2001). Hasil pengukuran dapat
dilihat pada Tabel 2. Hasil pengukuran
kuantitas RNA menunjukkan bahwa sampel
yang diisolasi tidak memiliki kemurnian yang
tinggi terhadap kontaminasi dari protein atau
pengotor lain. Kontaminasi protein atau
pengotor lain dapat terjadi pada saat ekstraksi
dengan kloroform tidak efisien dalam
menghilangkan protein ataupun pengotor lain
(Song et al. 2011).
Terdapat beberapa tahapan dalam isolasi
RNA total, antara lain pemecahan membran
dan solubilisasi membran, isolasi dan
pemurnian RNA, dan pemekatan RNA.
Seluruh tahapan ini memerlukan alat-alat
seperti Eppendorf, tip, dan seluruh alat-alat
gelas yang telah mendapatkan perlakuan
DEPC. DEPC berfungsi untuk menginaktifkan
RNase yang dapat mendegradasi RNA yang
akan diisolasi pada percobaan.
RNA
Total
1
2
3
4
Ket: 1= Mar A5
2= Bst 1
3= Mar C7
4= TB (N)
5= Mg Tm 1
Gambar 5
5
6
7
8 9
10
6 = Mg PSM B3
7 = TB (S)
8 = Mkw 9
9 = Bst 5
10 = Mar B4
Elektroforegram Total RNA
L.plantarum.
Hasil Perancangan Primer
Konstruksi marka gen plantaricin F
dilakukan dengan perancangan primer.
Sepasang primer yang spesifik digunakan
untuk amplifikasi gen pln F dengan RT-PCR.
Sekuen primer yang digunakan dapat
mempengaruhi spesifitas dan sensitivitas
reaksi dalam RT-PCR. Primer yang digunakan
dirancang menggunakan situs NCBI dari
daerah yang terkonservasi untuk gen pln F
dan 16s RNA. Hasil dari perancangan primer
dapat dilihat pada Tabel 3.
Primer forward dan reverse dirancang
berdasarkan kriteria primer yang dapat
digunakan untuk amplifikasi, antara lain
memiliki panjang primer berkisar 18-25
pasang basa, memiliki Tm tidak melebihi suhu
700C, % GC sekitar 40-60%, dan antara
primer forward dan reverse tidak saling
komplemen (Sambrook & Russel 2001).
Sekuen yang dirancang terdapat pada Tabel 3.
Hasil perancangan primer ini bila dianalisis
dengan program Gene Runner akan
didapatkan data, yaitu pada primer forward
pln F terdapat kemungkinan dimer sekitar 6
pb dan tidak terdapat kemungkinan untuk
internal loops dan hairpin loops. Pada primer
reverse terdapat 3 hairpin loop, dimer sekitar
4 pb, dan internal loop sekitar 8 pb.
Hasil dari perancangan primer gen pln F
ini diharapkan akan dapat menghasilkan
produk sekitar 70 pb. Hal ini berdasarkan
sekuen
yang dapat diapit oleh primer.
Perancangan primer ini menggunakan sekuen
dengan panjang 156 pb. Pada primer forward
sekuen dirancang dari urutan 58 sampai
dengan urutan 79, sedangkan primer reverse
dirancang dari urutan 127 sampai 107. Hal
lain yang harus diperhatikan adalah primer
yang dihasilkan. Primer ini menentukan suhu
dalam penempelan primer pada proses PCR.
Suhu penempelan primer terletak 2-10
dibawah nilai melting tempetrature (Tm) dari
primer (Sambrook & Russel 2001). Primer
16s RNA merupakan primer universal. Primer
ini digunakan sebagai kontrol positif dalam
percobaan ini.
Amplikon dan Ekspresi Gen Pln F dengan
RT-PCR
Amplifikasi gen pln F menggunakan
sepuluh isolat L. plantarum dengan metode
RT-PCR. Primer yang digunakan adalah
primer gen pln F dan 16s RNA. Primer 16s
RNA berfungsi sebagai kontrol positif dalam
reaksi ini. 16s RNA merupakan salah satu
ribosomal RNA dan hanya terdapat pada
prokariot. 70s RNA yang terdapat dalam
prokariot terdiri atas dua subunit, yaitu 30s
dan 50s. Komponen dari 30s RNA terdiri atas
16s RNA dan 21 protein (Garrett & Grisham
2007)
Tahap awal dari proses RT-PCR adalah
sintesis cDNA yang berasal dari sampel RNA
dengan menggunakan m-RNA sebagai
cetakan (Hogg 2005). Program yang
digunakan dalam reaksi RT-PCR, antara lain
9
Tabel 3 Primer gen pln F dan 16S RNA
Ukuran
Konsentrasi
(pb)
(nmol)
Sekuen
Tm
% GC
pln F F:5’-TTCCATGCCTATAGCGCGCGTG-3’
22
50
66.4
59.1
pln F R: 5’-TGATCCAATCGGCAGGCCCAA-3’.
21
50
57.1
57.1
16S RNA
F:
5’-CAAGCCACCATTCAAGGTT-3'
20
50
44.6
45
F:5’
3’
16S
RNA
R:
5’-CCCTACTGATCCCGCAATTA-3’
20
50
46.7
50
pln F R: 5’
3’.
1 siklus 550C selama 30 menit digunakan
16S RNA F: 5’
untuk sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi, 1
16S RNA0 R: 5’
3’
siklus 94 C selama 4 menit berfungsi dalam
tahapan denaturasi atau pemutusan ikatan
ganda dari RNA. Selanjutnya, amplifikasi
dari PCR dengan menggunakan program 40
siklus yang terdiri atas 940C selama 30 detik
untuk denaturasi, 550C selama 30 detik untuk
penempelan primer, 720C selama 1 menit
untuk sintesis DNA. Tahap akhir dari reaksi
adalah 1 siklus 720C selama 7 menit yang
digunakan untuk sintesis DNA tahap akhir,
Gambar 6 Elektroforegram hasil produk RTdan 1 siklus 40C untuk menjaga agar DNA
PCR
hasil PCR tidak rusak (Invitrogen 2007).
Hasil
amplifikasi
dilihat
dengan
melakukan elektroforesis gel agarosa 2%
untuk melihat apakah gen tersebut berhasil
diamplifikasi. Elektroforesis menggunakan
agarosa 2% menunjukkan pita DNA
berukuran 70 pb dengan marker berukuran
100 pb (Gambar 6,7, dan 8). Berdasarkan
ukuran pita yang dihasilkan dengan gen yang
dirancang, gen tersebut merupakan gen pln F
yang diinginkan.
Hasil amplifikasi dapat menentukan nilai
ekspresi gen yang ada pada tiap isolat
L.plantarum. Nilai ekspresi gen pln F dan 16s
Gambar 7 Elektroforegram hasil produk RTRNA dianalisis menggunakan program CS
PCR.
Analyzer. Ekspresi gen merupakan proses
yang membawa keterangan mengenai satu gen
atau lebih gen ke dalam data fenotip, dalam
proses ini melibatkan transkripsi dan translasi
(Smith et al. 2000).
Hasil ekspresi gen didapatkan dari
elektroforesis RNA total dengan produk hasil
RT-PCR. Penentuan masing-masing ekspresi
ini dapat menentukan nilai ekspresi relatif gen
pln F. Nilai ekspresi relatif gen pln F
merupakan nilai perbandingan antara nilai
ekspresi gen pln F dengan 16s RNA. Nilai
ekspresi gen pln F yang dihasilkan oleh
sepuluh isolat L. plantarum memiliki nilai
berbeda-beda. Nilai ekspresi relatif gen pln F
paling tinggi ditunjukkan oleh isolat TB (S)
dengan nilai 28.3 Au, sedangkan isolat Bst 5
tidak memiliki nilai ekspresi relatif gen pln F
(Gambar 9). Perhitungan dari nilai ekspresi
Gambar 8 Elektroforegram hasil produk RTrelatif gen pln F terdapat pada Lampiran 6.
PCR.
10
Gambar 9 Tingkat ekspresi relatif gen pln F
dari masing-masing isolat L.
plantarum.
Aktivitas Antibakteri Isolat L. plantarum
Terhadap Bakteri Uji
Pengujian aktivitas sepuluh
isolat L.
plantarum dilakukan terhadap lima bakteri
yang mewakili hasil perwarnaan Gram yang
berbeda, yaitu bakteri Gram positif dan
negatif. Bakteri Gram positif yang diujikan
adalah Staphylococcus aureus dan Bacillus
cureus. Bakteri Gram negatif yang diujikan
antara lain Escherichia coli, Salmonella
typhimurium, Pseudomonas flourosense.
Gambar 10 Hasil uji daya hambat isolat L.
plantarum
terhadap
pertumbuhan
bakteri
P.
flouresense dan E. coli.
Pengujian didasarkan atas pembentukan
zona bening disekitar kertas uji yang memiliki
diameter sekitar 0.6 cm (Gambar 10).
Menurut Paynter et al. (2007) isolat yang
mengandung plantaricin F dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri
Gram
negatif.
Proses
penghambatan
plantaricin
F
dalam
menghambat
pertumbuhan bakteri dengan menggunakan
mekanisme barrel stave. Pada mekanisme ini
plantaricin akan berikatan dengan membran
target dan membentuk pori sehingga membran
target menjadi rusak (Jorgenrud 2009).
Sepuluh isolat pengujian aktivitas L.
plantarum (Mar A5, Bst 1, Mar C7, TB(N),
Mg Tm 1, Mg PSM B3, TB(S), MKw 9, Bst
5, Mar B4) yang digunakan menghasilkan
tingkat penghambatan yang berbeda-beda
(Gambar 11). Berdasarkan metode David
stout,