Konstruksi Gen Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus plantarum S34
KONSTRUKSI GEN PENYANDI PLANTARICIN S DARI
Lactobacillus plantarum S34
RABIATUL ADAWIYAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi Gen
Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus plantarum S34 adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Rabiatul Adawiyah
NIM G84080001
ABSTRAK
RABIATUL ADAWIYAH. Konstruksi Gen Penyandi Plantaricin S dari
Lactobacillus plantarum S34. Dibimbing oleh SURYANI dan APON ZAENAL
MUSTOPA.
Bakteriosin merupakan peptida antimikrobial yang umumnya digunakan
sebagai pengawet pangan alami. Bakteriosin dihasilkan baik oleh bakteri Gram
positif maupun Gram negatif, salah satunya adalah Lactobacillus plantarum S34
yang diisolasi dari bekasam daging sapi. Bakteriosin yang dihasilkan oleh L.
plantarum S34 disebut plantaricin. Gen plnS merupakan gen penyandi plantaricin
S. Penelitian bertujuan mengisolasi gen plnS dari L. plantarum S34. Gen plnS
diamplifikasi dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), kemudian
pengklonan menggunakan vektor pGEM-T Easy dan ditransformasi ke
Escherichia coli DH5. Transformasi gen menggunakan metode kejut panas.
Seleksi transforman menggunakan metode koloni biru putih. Amplifikasi gen
menghasilkan amplikon gen plnS berukuran sekitar ±500 pb. Ligasi gen plnS
dengan vektor pGEM-T Easy (3015 pb) menghasilkan plasmid rekombinan
berukuran sekitar ±3500 pb. Konfirmasi koloni putih dari seleksi biru-putih
dilakukan dengan PCR koloni menghasilkan amplikon berukuran sekitar ±500 pb.
Plasmid rekombinan pada koloni 2 dikonfirmasi dengan enzim restriksi SalI dan
NcoI. Hasil pemotongan menunjukkan ukuran gen yang disisipkan sesuai dengan
yang diharapkan, yaitu sekitar ±500 pb
Kata Kunci: Lactobacillus plantarum S34, bekasam daging sapi, bakteriosin,
plantaricin S
ABSTRACT
RABIATUL ADAWIYAH. Construction of Gene Encoding Plantaricin S
Lactobacillus plantarum S34. Under supervision of SURYANI and APON
ZAENAL MUSTOPA.
Bacteriocins are antibacterial peptides that commonly used as food
biopreservative. Bacteriocins were produced by both either Gram positive or
Gram negative bacteria, one of them is Lactobacillus plantarum S34 isolated from
beef bekasam. L. plantarum S34 produced bacteriocins called plantaricin. PlnS
gene is gene that encoding plantaricin. The study purposed is to isolate plnS gene
from L. plantarum S34. The plnS gene amplified by PCR (Polymerase Chain
Reaction) technique, and then cloned into cloning vector pGEM-T Easy and
transformed into E. coli DH5α. Transformation gene using heat shock method.
Selection of transformants using the blue and white colonies. Gene amplification
produces plnS gene amplicon size about ±500 bp. PlnS gene ligation with pGEMT Easy (3015 bp) vector generating plasmid size about ±3500 bp. The
confirmation of white colonies from blue-white screening was carried out with
PCR colony, generated amplicons size was about ±500 bp. Recombinant plasmid
in colony 2 was confirmed by restricition analysis using SalI and NcoI. The result
showed that the gene insert had expected size ±500 bp.
Keyword: Lactobacillus plantarum S34, beef bekasam, bacteriocins, plantaricin S
KONSTRUKSI GEN PENYANDI PLANTARICIN S DARI
Lactobacillus plantarum S34
RABIATUL ADAWIYAH
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Konstruksi Gen Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus
plantarum S34
Nama
: Rabiatul Adawiyah
NIM
: G84080001
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Ketua
A. Zaenal Mustopa, M.Si
Anggota
Diketahui oleh
Dr. I Made Artika M.App.Sc.
Ketua Depertemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT. yang telah melimpahkan
berkah, rahmat, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah ini sebagai tugas akhir pada program studi Biokimia, Departemen
Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor. Shalawat serta salam selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW,
keluarga, dan para sahabat. Penelitian yang dilakukan berjudul “Konstruksi Gen
Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus plantarum S34”. Penelitian ini
dilakukan dari bulan Maret hingga Desember 2012 di Laboratorium Bakteriologi
dan Virologi Molekular, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong. Penelitian
ini didanai dari Hibah Bersaing tahun 2012 dengan peneliti utama Dr. Suryani,
M.Sc.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan dukungan selama proses penulisan karya ilimiah ini. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Dr. Suryani, S.P, M.Sc selaku pembimbing
utama dan A. Zaenal Mustopa, M.Si selaku pembimbing kedua yang telah
memberikan saran, kritik, dan bimbingannya, Nenek Siti Sanariah tercinta,
Ayahanda Alimuddin Paada dan Ibunda Elfira Abubakar, serta Kakak Nona,
Kakak Ayu, dan Adik Adit atas segala doa yang telah diberikan kepada penulis.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Linda Sukmarini, M.Eng,
Rifqiyah Umami, M.S, M. Ridwan, S.Farm, Kak Meita, Neng Tanty, Krisna,
Harry, Aksar, Yuni, Putri, Mba Anggun, Mas Bobby, Mas Aris, Kang Ace atas
segala bantuannya selama di Lab, Dita, Anis, Isul, Aros, Yoan, Nur, Dhani.
Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi berbagai pihak dan ilmu
pengetahuan, khususnya ilmu Biokimia.
Bogor, Mei 2013
Rabiatul Adawiyah
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
2
HASIL
4
Genom L. plantarum S34
4
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
4
Plasmid Rekombinan PlnS
4
Transforman E. coli DH5 yang Membawa Gen PlnS
5
PCR Koloni dan Pemotongan Plasmid Rekombinan
6
PEMBAHASAN
7
Isolasi Genom L. plantarum S34
7
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
8
Plasmid Rekombinan PlnS
9
Transforman E. coli DH5α
9
E. coli DH5 yang Membawa Gen plnS
10
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Elektroforegram genom L. plantarum S34
5
Elektroforegram gen plnS dari L. plantarum S34
5
Elektroforegram plasmid rekombinan plnS
5
Hasil seleksi koloni biru-putih dari E. coli DH5α yang membawa plasmid
rekombinan plnS
6
Elektroforegram PCR koloni pada plasmid rekombinan plnS
6
Elektroforegram pemotongan plasmid rekombinan plnS
6
Peta vektor pGEM-T Easy
11
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
BLAST Primer Forward Gen PlnS
BLAST Primer Reverse Gen PlnS
14
14
PENDAHULUAN
Daging sapi, susu maupun produk olahan ternak lainnya, seperti bakso
daging, sosis, keju merupakan pangan yang mudah rusak. Kerusakan bahan
pangan dan produk olahannya dapat terjadi saat proses pengolahan, distribusi,
maupun penyimpanan. Penyimpanan dalam jangka waktu lama dapat
menyebabkan terjadinya pertumbuhan mikroba yang dapat merusak bahan pangan
sehingga diperlukan teknik pengawetan bahan pangan tersebut. Pengawetan
bertujuan mencegah pertumbuhan mikroba perusak pada bahan pangan maupun
produk olahannya, menghambat reaksi enzimatis, kimiawi, serta kerusakan fisik
sehingga dapat memperpanjang waktu penyimpanannya (Marselly 2012).
Pemanfaatan BAL (bakteri asam laktat) sebagai pengawet pangan alami
telah digunakan sejak Awal tahun 1900 karena mampu menghasilkan asam laktat.
Selain itu, BAL juga menghasilkan peptida yang memiliki kemampuan
antimikrobial yang disebut bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL
umumnya diisolasi dari bahan pangan, seperti produk susu dan daging, sehingga
bakteriosin aman untuk digunakan sebagai bahan pengawet alami (Udhayashree et
al. 2012; Kalmokoff et al. 1996).
Salah satu spesies BAL penghasil bakteriosin adalah Lactobacillus
plantarum. Bakteriosin yang dihasilkan oleh L. plantarum dikenal dengan nama
plantaricin. Salah satu plantaricin yang dihasilkan oleh L. plantarum adalah
plantaricin S. Plantaricin S termasuk dalam bakteriosin kelas IIb (kecil, tahan
panas, dua peptida). Plantaricin S memiliki motif GxxxG yang berperan dalam
mediasi interaksi heliks-heliks antara dua peptida sebelum memasuki membran
sel bakteri patogen. Motif ini menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada
plantaricin S. Plantaricin S juga aktif melawan Listeria monocytogenes,
Enterococcus faecalis, dan Staphylococcus aureus (Soliman et al. 2011).
Penapisan komponen bioaktif dari 34 isolat bakteri asam laktat yang
diisolasi dari bekasam daging sapi diuji aktivitas inhibisinya terhadap
pertumbuhan Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Listeria
monocytogenes, dan enzim RNA (ribonucleic acid) helikase virus hepatitis C.
Aktivitas komponen bioaktif BAL tertinggi terdapat pada isolat S34, namun jenis
BAL dan komponen bioaktifnya belum diketahui (Mustopa et al. 2010; Solehudin
2010). Putri (2011) melaporkan bahwa isolat S34 tersebut memiliki kesamaan
99% dengan sekuen DNA (deoxyrinonucleic acid) bakteri L. plantarum WCFS1
yang kemudian diberi nama L. plantarum S34. Bakteri L. plantarum S34 juga
dilaporkan menghasilkan bakteriosin kelas II. Bakteriosin kelas II meliputi
plantaricin EF, JK, dan S. Isolasi dan karakterisasi gen pln dari L. plantarum S34
yang telah dilakukan oleh Nurhaeni (2011), yaitu gen plnEF (penyandi
plantaricin EF) dan gen plnJK (plantaricin JK). Oleh karena itu, gen plnS perlu
diisolasi dari genom L. plantarum S34 agar gen tersebut dapat dianalisis sehingga
didapatkan informasi mengenai plnS.
Penelitian bertujuan mengisolasi gen plnS dari L. plantarum S34 dengan
teknik PCR menggunakan primer spesifik plnS. Hipotesis penelitian adalah gen
plnS dari L. plantarum S34 dapat diisolasi dengan menggunakan sepasang primer
spesifik melalui teknik PCR. Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi
tentang isolasi gen plnS L. plantarum S34 yang dapat dimanfaatkan untuk
menghasilkan plantaricin S.
2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Pembiakan L. plantarum adalah isolat L. plantarum S34, MRS (de Man,
Rogosa, Sharpe) broth (10 g pepton, 8 g ‘lab-lemco’ powder, 4 g ekstrak ragi, 20
g glukosa, 1 ml sorbitan mono-oleat, 2 g dikalium fosfat, 5 g natrium asetat, 2 g
triamonium sitrat, 0.2 g magnesium sulfat, dan 0.05 mangan sulfat per liter), dan
natrium azida 20%. Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi genom terdiri atas
biakan L. plantarum S34 (koleksi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi
Molekular,
LIPI),
bufer
Tris-EDTA
(Tris-HCl
10
mM
dan
etilenadiaminatetraasetat 1 mM) pH 8, lisozim 60 mg/mL, SDS (sodium dodesil
sulfat) 10%, NaCl (natrium klorida) 5 M, CTAB (cetyl Trimethylammonium
bromide) 10%, kloroform 10%, isopropanol, etanol 70%, ultrapure distilled
water, dan RNase 1 mg/mL. Elektroforesis menggunakan agarosa 1%, 1x TBE
(tris borat EDTA), DNA marker berukuran 100 pb dan 1000 pb, loading dye, dan
EtBr (etidium bromida). Bahan amplifikasi gen, yaitu kit PCR KAPA2G Robust,
ultrapure distilled water, primer forward gen plnS (5’ ACT AAA TAT CAC TGT
GGT AAA GTA AAG-3’), dan primer reverse gen plnS (5’ GAC CGA AAC
AAT CAT GGG AAG-3’). Pemurnian hasil PCR menggunakan kit komersial
QIAquick Gel Extraction, sedangkan ligasi gen plnS menggunakan kit pGEM-T
Easy vector system. Media selektif transforman, yaitu LB agar, ampisilin 100
mg/mL, X-gal, dan IPTG (isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosida). Isolasi plasmid
rekombinan menggunakan kit GeneJet plasmid miniprep. sedangkan bahan-bahan
yang diperlukan untuk restriksi plasmid adalah bufer 10x T, serta enzim restriksi
SalI dan NcoI.
Peralatan yang digunakan, yaitu tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas piala,
gelas ukur, pipet mikro, tip, laminar air flow ESCO, penangas bunsen, sudip,
timbangan, hot plate stirrer CIMAREC, inkubator n-biotek inc., sentrifuga high
speed Hermle Z 32K, mikrosentrifuga SCF1, autoklaf SA-300VL, tabung 1.5 mL,
cawan petri, parafilm, elektroforesis Mupid exu, kamera digital, perangkat PCR
2720 Thermal Cycler, minicolumn Promega, penangas air, oven, dan GeneJet spin
column.
Metode Penelitian
Isolasi genom L. plantarum S34 (Cho et al. 2010; Zheng et al. 1995 yang
dimodifikasi)
Kultur L. plantarum S34 dibiakkan pada media MRS, dan diinkubasi pada
suhu 37C selama 16-18 jam. Biakan L. plantarum S34 disentrifugasi dengan
kecepatan 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. Pelet L. plantarum S34
ditambahkan 500 µL bufer Tris-EDTA pH 8, kemudian ditambahkan 40 µL
lisozim 60 mg/mL, dihomogenasikan, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 60
menit. Larutan SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB 10% ditambahkan setelah inkubasi
secara berturut-turut sebanyak 200 µL, 100 µL, dan 80 µL, kemudian diinkubasi
lagi selama 30 menit pada suhu 68C. Kloroform (%v/v) ditambahkan pada
3
campuran yang telah diinkubasi, kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 13000 rpm. Lapisan atas ditambahkan isopropanol sebanyak 0.6 kali
volume supernatan tersebut, selanjutnya diinkubasi selama 2 jam pada suhu 20C. Sentrifugasi kembali dilakukan dengan kecepatan 13000 rpm selama 6
menit. Pelet ditambahkan etanol 70% sebanyak 1 mL, kemudian kembali
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 6 menit, dan pelet
dikeringkan. Tahap selanjutnya adalah penambahan RNase 0.1 mg/mL pada pelet
yang telah dikeringkan, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit.
Genom hasil isolasi disimpan pada suhu -20C. Uji kualitatif genom dilakukan
melalui elektroforesis gel agarosa 1% dan uji kuantitatif dilakukan pada A260 nm
dan A280 nm.
Amplifikasi Gen PlnS pada Genom L. plantarum S34 (Saenz et al. 2009 yang
dimodifikasi; QIAGEN 2008)
Amplifikasi gen plnS L. plantarum menggunakan PCR. Volume total
amplifikasi sebanyak 20 µL yang mengandung 11.2 µL ultrapure distilled water,
1x bufer A KAPA2G, MgCl2 1.25 mM, dNTP Mix 2.5 mM, 2.5 µM untuk
masing-masing primer forward dan reverse, 1.5 U DNA polimerase KAPA2G
Robust, dan 30.65 ng/µL DNA genom L. plantarum S34. Reaksi PCR diawali
pradenaturasi pada suhu 94C selama 3 menit, denaturasi selama 30 detik,
annealing pada suhu 56.5C selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72C selama
30 detik. Tahap denaturasi, annealing, dan ekstensi dilakukan sebanyak 32 siklus,
dan diikuti dengan tahap ekstensi akhir pada suhu 72C selama 6 menit. Produk
PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Pemurnian hasil PCR dari
gel agarosa dilakukan dengan metode ekstraksi gel menggunakan kit komersial
QIAGEN QIAquick Gel Extraction. Hasil pemurnian DNA dianalisis dengan
elektroforesis gel agarosa.
Ligasi Gen plnS pada vektor pGEM-T Easy (Promega 2010)
Gen plnS yang didapatkan dari hasil PCR diligasikan pada vektor pGEM-T.
Bufer 2X rapid ligation T4 DNA ligase sebanyak 4 µL ditambahkan ke dalam
tabung 1.5 mL, kemudian ditambahkan vektor pGEM-T Easy sebanyak 1 µL.
Produk PCR dan T4 DNA ligase ditambahkan secara berturut sebanyak 4 µL dan
1 µL. Campuran tersebut diinkubasi overnight pada suhu 4C untuk mendapatkan
jumlah transforman maksimal.
Transformasi Plasmid Rekombinan plnS ke Escherichia coli DH5
(Sambrook & Rusell 2001)
Hasil ligasi vektor pGEM-T Easy dan gen plnS sebanyak 5 µL dimasukkan
ke dalam tabung mikrosentrifugasi yang telah diisi dengan sel kompeten E. coli
DH5 sebanyak 100 µL, kemudian disimpan pada es selama 30 menit. Campuran
diinkubasi pada suhu 42C tepat 45 detik, kemudian segera diinkubasi pada kotak
es selama 2 menit. Medium LB sebanyak 400 µL ditambahkan pada campuran sel
kompeten dan plasmid rekombinan, diinkubasi pada suhu 37C selama 45 menit.
Kultur tersebut sebanyak 150 µL ditumbuhkan pada media seleksi LB agar yang
4
mengandung ampisilin, 50 µL IPTG 200 mM dan 20 µL X-gal 50 mg/mL dengan
menggunakan metode cawan sebar. Koloni tunggal berwarna putih diambil untuk
PCR koloni.
Isolasi Plasmid Rekombinan plnS dari E. coli DH5 Menggunakan
GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas 2011)
Proses isolasi plasmid dikerjakan pada suhu ruang. Kultur bakteri yang telah
ditumbuhkan selama 16 jam disentrifugasi selama 10 menit. Tahap isolasi plasmid
rekombinan dilakukan sesuai dengan protokol kit GeneJETTM plasmid miniprep.
Restriksi Plasmid Rekombinan plnS E. coli DH5 (Takara 2012)
Hasil isolasi plasmid dipotong dengan enzim restriksi SalI dan NcoI. Reaksi
dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: 13 µL ddH2O dimasukkan ke dalam
tabung. Bufer 10x T ditambahkan sebanyak 2 µL, kemudian dilanjutkan dengan
penambahan SalI dan Nco I masing-masing sebanyak 1 µL. Plasmid ditambahkan
sebanyak 3 µL. Tabung kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37C. Hasil
restriksi selanjutnya dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
HASIL
Genom L. plantarum S34
Genom L. plantarum S34 yang telah diisolasi diuji secara kuantitatif dan uji
kualitatif melalui pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280
nm. Konsentrasi genom yang diisolasi sebesar 306.5 ng/µL. Nilai rasio absorbansi
pada A260/A280 sebesar 1.019. Elektroforegram genom L. plantarum S34
menunjukkan ukuran genom lebih dari 10000 pb (Gambar 1).
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
Elektroforegram gen plnS ditunjukkan oleh Gambar 2(a). Gen plnS pada
lajur 1 berukuran sekitar ±500 pb. Elektroforegram gen plnS yang telah
dimurnikan ditunjukkan oleh Gambar 2(b) juga berukuran sekitar ±500 pb.
Konsentrasi gen plnS hasil pemurnian ini sebesar 67.2 ng/µL dan rasio A260/A280
sebesar 2.
Plasmid Rekombinan PlnS
Elektroforegram plasmid rekombinan plnS ditunjukkan pleh Gambar 3. Pita
plasmid rekombinan tersebut terdapat pada lajur 1 yang ukurannya di antara 30004000 pb, yaitu sekitar 3500 pb. Ukuran tersebut masih berada di antara ukuran
total vektor pGEM-T Easy dan gen plnS.
5
Gambar 1 Elektroforegram genom L. plantarum S34 (1) genom L. plantarum
S34; (2) marker DNA 1 kb
(a)
(b)
Gambar 2 Elektroforegram gen plnS dari L. plantarum S34; (1) gen plnS; (2)
marker DNA 100 pb; (3) gen plnS telah dimurnikan; (4) marker DNA
100 pb
Gambar 3 Elektroforegram plasmid rekombinan plnS (1) plasmid rekombinan
plnS; (2) marker DNA 1000 pb
Transforman E. coli DH5 yang Membawa Gen PlnS
Transforman E. coli DH5α yang tumbuh di media seleksi koloni biru putih
ditunjukkan oleh Gambar 4. Koloni yang mengandung gen plnS tumbuh menjadi
koloni putih. Koloni putih yang tumbuh sebanyak 69 koloni, sedangkan koloni
biru yang tumbuh sebanyak 61 koloni.
6
Koloni
putih
Koloni
biru
Gambar 4 Hasil seleksi koloni biru-putih dari E. coli DH5α yang membawa
plasmid rekombinan plnS
±500 pb
500 pb
400 pb
Gambar 5 Elektroforegram PCR koloni pada plasmid rekombinan plnS (1) koloni
1; (2) koloni 2; (3) koloni 3; (4) koloni 5; (6) koloni 6; (7) koloni 7; (8)
marker DNA 100 pb
Gambar 6 Elektroforegram pemotongan plasmid rekombinan plnS (1) plasmid E.
coli DH5 koloni 2 hasil restriksi; (2) marker DNA 100 pb
PCR Koloni dan Pemotongan Plasmid Rekombinan
Hasil PCR koloni ditunjukkan oleh Gambar 6. Koloni 1 sampai 7
menunjukkan koloni tersebut mengandung DNA dengan ukuran sekitar 500 pb.
Koloni 2 dipilih untuk diisolasi plasmidnya, kemudian plasmid tersebut
direstriksi. Plasmid tersebut kemudian dipotong dengan enzim restriksi untuk
7
memastikan terdapatnya gen plnS pada plasmid tersebut. Enzim restriksi yang
digunakan adalah NcoI dan SalI. Pemotongan dengan kedua enzim restriksi ini
menghasilkan dua pita dengan ukuran sekitar ±3000 pb dan ±500 pb (Gambar 6).
PEMBAHASAN
Genom L. plantarum S34
Kualitas DNA genom ditentukan melalui analisis elektroforesis gel agarosa
1%. Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita DNA yang cukup tebal,
integritas yang cukup baik, dan tidak terjadi degradasi pada pita DNA. Tebalnya
pita DNA tersebut menunjukkan konsentrasi DNA yang cukup tinggi. Ukuran
DNA ditentukan berdasarkan DNA marker yang digunakan.
Analisis
elektroforesis ini menggunakan DNA marker 1000 pb. Genom L. plantarum
WCSF1 yang homolog dengan L. Plantarum S34 berukuran sebesar 3,3 Mb
(Siezen & Vlieg 2011). Pita DNA genom L. plantarum S34 terdapat pada bagian
atas DNA marker yang digunakan, dan oleh karena itu, ukurannya belum dapat
ditentukan secara akurat karena DNA L. plantarum S34 melebihi ukuran DNA
marker yang digunakan. Namun, posisi pita yang berada di atas DNA marker
menunjukkan bahwa ukuran genom L. plantarum S34 cukup besar dan melebihi
ukuran 10000 pb.
Konsentrasi DNA ditentukan melalui pengukuran absorbansi sampel DNA
pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi DNA genom L. plantarum S34
hasil isolasi sebesar 306.5 ng/µL. Nurhaeni (2011) melakukan isolasi DNA
genom L. plantarum S34 dengan metode yang sama dan menghasilkan
konsentrasi DNA genom sebesar 76.4 ng/µL. Isolasi DNA genom juga dilakukan
oleh Sachinandan et al. (2010) terhadap Lactobacillus yang berasal dari susu
fermentasi dengan menggunakan kit komersial dan metode ampisilin-lisozim.
Isolasi DNA genom dengan menggunakan kit komersial menghasilkan rerata
konsentrasi DNA sebesar 760.5 ng/µL, sedangkan isolasi menggunakan metode
ampisilin-lisozim menghasilkan rerata konsentrasi DNA sebesar 2187.654 ng/µL.
Konsentrasi DNA genom yang didapatkan pada penelitian ini sudah cukup tinggi
jika dibandingkan dengan hasil isolasi yang dilakukan oleh Nurhaeni (2011),
tetapi masih relatif rendah jika dibandingkan dengan hasil isolasi DNA yang
dilakukan oleh Sachinandan et al. (2010). Namun, konsentrasi DNA genom hasil
isolasi sudah cukup baik untuk digunakan sebagai cetakan DNA pada tahap PCR
gen plnS.
Kualitas genom hasil isolasi juga dapat diketahui melalui rasio absorbansi
genom pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Rasio tersebut
menunjukkan kemurnian DNA terhadap protein. Panjang gelombang 260 nm
merupakan panjang gelombang optimum yang dapat diserap oleh asam nukleat,
sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang optimum
yang dapat diserap oleh protein. Nilai rasio 1.7-2.0 menunjukkan kemurnian DNA
yang baik, sedangkan jika nilainya
Lactobacillus plantarum S34
RABIATUL ADAWIYAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi Gen
Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus plantarum S34 adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Rabiatul Adawiyah
NIM G84080001
ABSTRAK
RABIATUL ADAWIYAH. Konstruksi Gen Penyandi Plantaricin S dari
Lactobacillus plantarum S34. Dibimbing oleh SURYANI dan APON ZAENAL
MUSTOPA.
Bakteriosin merupakan peptida antimikrobial yang umumnya digunakan
sebagai pengawet pangan alami. Bakteriosin dihasilkan baik oleh bakteri Gram
positif maupun Gram negatif, salah satunya adalah Lactobacillus plantarum S34
yang diisolasi dari bekasam daging sapi. Bakteriosin yang dihasilkan oleh L.
plantarum S34 disebut plantaricin. Gen plnS merupakan gen penyandi plantaricin
S. Penelitian bertujuan mengisolasi gen plnS dari L. plantarum S34. Gen plnS
diamplifikasi dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), kemudian
pengklonan menggunakan vektor pGEM-T Easy dan ditransformasi ke
Escherichia coli DH5. Transformasi gen menggunakan metode kejut panas.
Seleksi transforman menggunakan metode koloni biru putih. Amplifikasi gen
menghasilkan amplikon gen plnS berukuran sekitar ±500 pb. Ligasi gen plnS
dengan vektor pGEM-T Easy (3015 pb) menghasilkan plasmid rekombinan
berukuran sekitar ±3500 pb. Konfirmasi koloni putih dari seleksi biru-putih
dilakukan dengan PCR koloni menghasilkan amplikon berukuran sekitar ±500 pb.
Plasmid rekombinan pada koloni 2 dikonfirmasi dengan enzim restriksi SalI dan
NcoI. Hasil pemotongan menunjukkan ukuran gen yang disisipkan sesuai dengan
yang diharapkan, yaitu sekitar ±500 pb
Kata Kunci: Lactobacillus plantarum S34, bekasam daging sapi, bakteriosin,
plantaricin S
ABSTRACT
RABIATUL ADAWIYAH. Construction of Gene Encoding Plantaricin S
Lactobacillus plantarum S34. Under supervision of SURYANI and APON
ZAENAL MUSTOPA.
Bacteriocins are antibacterial peptides that commonly used as food
biopreservative. Bacteriocins were produced by both either Gram positive or
Gram negative bacteria, one of them is Lactobacillus plantarum S34 isolated from
beef bekasam. L. plantarum S34 produced bacteriocins called plantaricin. PlnS
gene is gene that encoding plantaricin. The study purposed is to isolate plnS gene
from L. plantarum S34. The plnS gene amplified by PCR (Polymerase Chain
Reaction) technique, and then cloned into cloning vector pGEM-T Easy and
transformed into E. coli DH5α. Transformation gene using heat shock method.
Selection of transformants using the blue and white colonies. Gene amplification
produces plnS gene amplicon size about ±500 bp. PlnS gene ligation with pGEMT Easy (3015 bp) vector generating plasmid size about ±3500 bp. The
confirmation of white colonies from blue-white screening was carried out with
PCR colony, generated amplicons size was about ±500 bp. Recombinant plasmid
in colony 2 was confirmed by restricition analysis using SalI and NcoI. The result
showed that the gene insert had expected size ±500 bp.
Keyword: Lactobacillus plantarum S34, beef bekasam, bacteriocins, plantaricin S
KONSTRUKSI GEN PENYANDI PLANTARICIN S DARI
Lactobacillus plantarum S34
RABIATUL ADAWIYAH
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Konstruksi Gen Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus
plantarum S34
Nama
: Rabiatul Adawiyah
NIM
: G84080001
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Ketua
A. Zaenal Mustopa, M.Si
Anggota
Diketahui oleh
Dr. I Made Artika M.App.Sc.
Ketua Depertemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT. yang telah melimpahkan
berkah, rahmat, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah ini sebagai tugas akhir pada program studi Biokimia, Departemen
Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor. Shalawat serta salam selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW,
keluarga, dan para sahabat. Penelitian yang dilakukan berjudul “Konstruksi Gen
Penyandi Plantaricin S dari Lactobacillus plantarum S34”. Penelitian ini
dilakukan dari bulan Maret hingga Desember 2012 di Laboratorium Bakteriologi
dan Virologi Molekular, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong. Penelitian
ini didanai dari Hibah Bersaing tahun 2012 dengan peneliti utama Dr. Suryani,
M.Sc.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan dukungan selama proses penulisan karya ilimiah ini. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Dr. Suryani, S.P, M.Sc selaku pembimbing
utama dan A. Zaenal Mustopa, M.Si selaku pembimbing kedua yang telah
memberikan saran, kritik, dan bimbingannya, Nenek Siti Sanariah tercinta,
Ayahanda Alimuddin Paada dan Ibunda Elfira Abubakar, serta Kakak Nona,
Kakak Ayu, dan Adik Adit atas segala doa yang telah diberikan kepada penulis.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Linda Sukmarini, M.Eng,
Rifqiyah Umami, M.S, M. Ridwan, S.Farm, Kak Meita, Neng Tanty, Krisna,
Harry, Aksar, Yuni, Putri, Mba Anggun, Mas Bobby, Mas Aris, Kang Ace atas
segala bantuannya selama di Lab, Dita, Anis, Isul, Aros, Yoan, Nur, Dhani.
Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi berbagai pihak dan ilmu
pengetahuan, khususnya ilmu Biokimia.
Bogor, Mei 2013
Rabiatul Adawiyah
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode Penelitian
2
HASIL
4
Genom L. plantarum S34
4
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
4
Plasmid Rekombinan PlnS
4
Transforman E. coli DH5 yang Membawa Gen PlnS
5
PCR Koloni dan Pemotongan Plasmid Rekombinan
6
PEMBAHASAN
7
Isolasi Genom L. plantarum S34
7
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
8
Plasmid Rekombinan PlnS
9
Transforman E. coli DH5α
9
E. coli DH5 yang Membawa Gen plnS
10
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Elektroforegram genom L. plantarum S34
5
Elektroforegram gen plnS dari L. plantarum S34
5
Elektroforegram plasmid rekombinan plnS
5
Hasil seleksi koloni biru-putih dari E. coli DH5α yang membawa plasmid
rekombinan plnS
6
Elektroforegram PCR koloni pada plasmid rekombinan plnS
6
Elektroforegram pemotongan plasmid rekombinan plnS
6
Peta vektor pGEM-T Easy
11
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
BLAST Primer Forward Gen PlnS
BLAST Primer Reverse Gen PlnS
14
14
PENDAHULUAN
Daging sapi, susu maupun produk olahan ternak lainnya, seperti bakso
daging, sosis, keju merupakan pangan yang mudah rusak. Kerusakan bahan
pangan dan produk olahannya dapat terjadi saat proses pengolahan, distribusi,
maupun penyimpanan. Penyimpanan dalam jangka waktu lama dapat
menyebabkan terjadinya pertumbuhan mikroba yang dapat merusak bahan pangan
sehingga diperlukan teknik pengawetan bahan pangan tersebut. Pengawetan
bertujuan mencegah pertumbuhan mikroba perusak pada bahan pangan maupun
produk olahannya, menghambat reaksi enzimatis, kimiawi, serta kerusakan fisik
sehingga dapat memperpanjang waktu penyimpanannya (Marselly 2012).
Pemanfaatan BAL (bakteri asam laktat) sebagai pengawet pangan alami
telah digunakan sejak Awal tahun 1900 karena mampu menghasilkan asam laktat.
Selain itu, BAL juga menghasilkan peptida yang memiliki kemampuan
antimikrobial yang disebut bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL
umumnya diisolasi dari bahan pangan, seperti produk susu dan daging, sehingga
bakteriosin aman untuk digunakan sebagai bahan pengawet alami (Udhayashree et
al. 2012; Kalmokoff et al. 1996).
Salah satu spesies BAL penghasil bakteriosin adalah Lactobacillus
plantarum. Bakteriosin yang dihasilkan oleh L. plantarum dikenal dengan nama
plantaricin. Salah satu plantaricin yang dihasilkan oleh L. plantarum adalah
plantaricin S. Plantaricin S termasuk dalam bakteriosin kelas IIb (kecil, tahan
panas, dua peptida). Plantaricin S memiliki motif GxxxG yang berperan dalam
mediasi interaksi heliks-heliks antara dua peptida sebelum memasuki membran
sel bakteri patogen. Motif ini menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada
plantaricin S. Plantaricin S juga aktif melawan Listeria monocytogenes,
Enterococcus faecalis, dan Staphylococcus aureus (Soliman et al. 2011).
Penapisan komponen bioaktif dari 34 isolat bakteri asam laktat yang
diisolasi dari bekasam daging sapi diuji aktivitas inhibisinya terhadap
pertumbuhan Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Listeria
monocytogenes, dan enzim RNA (ribonucleic acid) helikase virus hepatitis C.
Aktivitas komponen bioaktif BAL tertinggi terdapat pada isolat S34, namun jenis
BAL dan komponen bioaktifnya belum diketahui (Mustopa et al. 2010; Solehudin
2010). Putri (2011) melaporkan bahwa isolat S34 tersebut memiliki kesamaan
99% dengan sekuen DNA (deoxyrinonucleic acid) bakteri L. plantarum WCFS1
yang kemudian diberi nama L. plantarum S34. Bakteri L. plantarum S34 juga
dilaporkan menghasilkan bakteriosin kelas II. Bakteriosin kelas II meliputi
plantaricin EF, JK, dan S. Isolasi dan karakterisasi gen pln dari L. plantarum S34
yang telah dilakukan oleh Nurhaeni (2011), yaitu gen plnEF (penyandi
plantaricin EF) dan gen plnJK (plantaricin JK). Oleh karena itu, gen plnS perlu
diisolasi dari genom L. plantarum S34 agar gen tersebut dapat dianalisis sehingga
didapatkan informasi mengenai plnS.
Penelitian bertujuan mengisolasi gen plnS dari L. plantarum S34 dengan
teknik PCR menggunakan primer spesifik plnS. Hipotesis penelitian adalah gen
plnS dari L. plantarum S34 dapat diisolasi dengan menggunakan sepasang primer
spesifik melalui teknik PCR. Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi
tentang isolasi gen plnS L. plantarum S34 yang dapat dimanfaatkan untuk
menghasilkan plantaricin S.
2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Pembiakan L. plantarum adalah isolat L. plantarum S34, MRS (de Man,
Rogosa, Sharpe) broth (10 g pepton, 8 g ‘lab-lemco’ powder, 4 g ekstrak ragi, 20
g glukosa, 1 ml sorbitan mono-oleat, 2 g dikalium fosfat, 5 g natrium asetat, 2 g
triamonium sitrat, 0.2 g magnesium sulfat, dan 0.05 mangan sulfat per liter), dan
natrium azida 20%. Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi genom terdiri atas
biakan L. plantarum S34 (koleksi Laboratorium Bakteriologi dan Virologi
Molekular,
LIPI),
bufer
Tris-EDTA
(Tris-HCl
10
mM
dan
etilenadiaminatetraasetat 1 mM) pH 8, lisozim 60 mg/mL, SDS (sodium dodesil
sulfat) 10%, NaCl (natrium klorida) 5 M, CTAB (cetyl Trimethylammonium
bromide) 10%, kloroform 10%, isopropanol, etanol 70%, ultrapure distilled
water, dan RNase 1 mg/mL. Elektroforesis menggunakan agarosa 1%, 1x TBE
(tris borat EDTA), DNA marker berukuran 100 pb dan 1000 pb, loading dye, dan
EtBr (etidium bromida). Bahan amplifikasi gen, yaitu kit PCR KAPA2G Robust,
ultrapure distilled water, primer forward gen plnS (5’ ACT AAA TAT CAC TGT
GGT AAA GTA AAG-3’), dan primer reverse gen plnS (5’ GAC CGA AAC
AAT CAT GGG AAG-3’). Pemurnian hasil PCR menggunakan kit komersial
QIAquick Gel Extraction, sedangkan ligasi gen plnS menggunakan kit pGEM-T
Easy vector system. Media selektif transforman, yaitu LB agar, ampisilin 100
mg/mL, X-gal, dan IPTG (isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosida). Isolasi plasmid
rekombinan menggunakan kit GeneJet plasmid miniprep. sedangkan bahan-bahan
yang diperlukan untuk restriksi plasmid adalah bufer 10x T, serta enzim restriksi
SalI dan NcoI.
Peralatan yang digunakan, yaitu tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas piala,
gelas ukur, pipet mikro, tip, laminar air flow ESCO, penangas bunsen, sudip,
timbangan, hot plate stirrer CIMAREC, inkubator n-biotek inc., sentrifuga high
speed Hermle Z 32K, mikrosentrifuga SCF1, autoklaf SA-300VL, tabung 1.5 mL,
cawan petri, parafilm, elektroforesis Mupid exu, kamera digital, perangkat PCR
2720 Thermal Cycler, minicolumn Promega, penangas air, oven, dan GeneJet spin
column.
Metode Penelitian
Isolasi genom L. plantarum S34 (Cho et al. 2010; Zheng et al. 1995 yang
dimodifikasi)
Kultur L. plantarum S34 dibiakkan pada media MRS, dan diinkubasi pada
suhu 37C selama 16-18 jam. Biakan L. plantarum S34 disentrifugasi dengan
kecepatan 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. Pelet L. plantarum S34
ditambahkan 500 µL bufer Tris-EDTA pH 8, kemudian ditambahkan 40 µL
lisozim 60 mg/mL, dihomogenasikan, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 60
menit. Larutan SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB 10% ditambahkan setelah inkubasi
secara berturut-turut sebanyak 200 µL, 100 µL, dan 80 µL, kemudian diinkubasi
lagi selama 30 menit pada suhu 68C. Kloroform (%v/v) ditambahkan pada
3
campuran yang telah diinkubasi, kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 13000 rpm. Lapisan atas ditambahkan isopropanol sebanyak 0.6 kali
volume supernatan tersebut, selanjutnya diinkubasi selama 2 jam pada suhu 20C. Sentrifugasi kembali dilakukan dengan kecepatan 13000 rpm selama 6
menit. Pelet ditambahkan etanol 70% sebanyak 1 mL, kemudian kembali
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 6 menit, dan pelet
dikeringkan. Tahap selanjutnya adalah penambahan RNase 0.1 mg/mL pada pelet
yang telah dikeringkan, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit.
Genom hasil isolasi disimpan pada suhu -20C. Uji kualitatif genom dilakukan
melalui elektroforesis gel agarosa 1% dan uji kuantitatif dilakukan pada A260 nm
dan A280 nm.
Amplifikasi Gen PlnS pada Genom L. plantarum S34 (Saenz et al. 2009 yang
dimodifikasi; QIAGEN 2008)
Amplifikasi gen plnS L. plantarum menggunakan PCR. Volume total
amplifikasi sebanyak 20 µL yang mengandung 11.2 µL ultrapure distilled water,
1x bufer A KAPA2G, MgCl2 1.25 mM, dNTP Mix 2.5 mM, 2.5 µM untuk
masing-masing primer forward dan reverse, 1.5 U DNA polimerase KAPA2G
Robust, dan 30.65 ng/µL DNA genom L. plantarum S34. Reaksi PCR diawali
pradenaturasi pada suhu 94C selama 3 menit, denaturasi selama 30 detik,
annealing pada suhu 56.5C selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72C selama
30 detik. Tahap denaturasi, annealing, dan ekstensi dilakukan sebanyak 32 siklus,
dan diikuti dengan tahap ekstensi akhir pada suhu 72C selama 6 menit. Produk
PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Pemurnian hasil PCR dari
gel agarosa dilakukan dengan metode ekstraksi gel menggunakan kit komersial
QIAGEN QIAquick Gel Extraction. Hasil pemurnian DNA dianalisis dengan
elektroforesis gel agarosa.
Ligasi Gen plnS pada vektor pGEM-T Easy (Promega 2010)
Gen plnS yang didapatkan dari hasil PCR diligasikan pada vektor pGEM-T.
Bufer 2X rapid ligation T4 DNA ligase sebanyak 4 µL ditambahkan ke dalam
tabung 1.5 mL, kemudian ditambahkan vektor pGEM-T Easy sebanyak 1 µL.
Produk PCR dan T4 DNA ligase ditambahkan secara berturut sebanyak 4 µL dan
1 µL. Campuran tersebut diinkubasi overnight pada suhu 4C untuk mendapatkan
jumlah transforman maksimal.
Transformasi Plasmid Rekombinan plnS ke Escherichia coli DH5
(Sambrook & Rusell 2001)
Hasil ligasi vektor pGEM-T Easy dan gen plnS sebanyak 5 µL dimasukkan
ke dalam tabung mikrosentrifugasi yang telah diisi dengan sel kompeten E. coli
DH5 sebanyak 100 µL, kemudian disimpan pada es selama 30 menit. Campuran
diinkubasi pada suhu 42C tepat 45 detik, kemudian segera diinkubasi pada kotak
es selama 2 menit. Medium LB sebanyak 400 µL ditambahkan pada campuran sel
kompeten dan plasmid rekombinan, diinkubasi pada suhu 37C selama 45 menit.
Kultur tersebut sebanyak 150 µL ditumbuhkan pada media seleksi LB agar yang
4
mengandung ampisilin, 50 µL IPTG 200 mM dan 20 µL X-gal 50 mg/mL dengan
menggunakan metode cawan sebar. Koloni tunggal berwarna putih diambil untuk
PCR koloni.
Isolasi Plasmid Rekombinan plnS dari E. coli DH5 Menggunakan
GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas 2011)
Proses isolasi plasmid dikerjakan pada suhu ruang. Kultur bakteri yang telah
ditumbuhkan selama 16 jam disentrifugasi selama 10 menit. Tahap isolasi plasmid
rekombinan dilakukan sesuai dengan protokol kit GeneJETTM plasmid miniprep.
Restriksi Plasmid Rekombinan plnS E. coli DH5 (Takara 2012)
Hasil isolasi plasmid dipotong dengan enzim restriksi SalI dan NcoI. Reaksi
dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: 13 µL ddH2O dimasukkan ke dalam
tabung. Bufer 10x T ditambahkan sebanyak 2 µL, kemudian dilanjutkan dengan
penambahan SalI dan Nco I masing-masing sebanyak 1 µL. Plasmid ditambahkan
sebanyak 3 µL. Tabung kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37C. Hasil
restriksi selanjutnya dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
HASIL
Genom L. plantarum S34
Genom L. plantarum S34 yang telah diisolasi diuji secara kuantitatif dan uji
kualitatif melalui pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280
nm. Konsentrasi genom yang diisolasi sebesar 306.5 ng/µL. Nilai rasio absorbansi
pada A260/A280 sebesar 1.019. Elektroforegram genom L. plantarum S34
menunjukkan ukuran genom lebih dari 10000 pb (Gambar 1).
Amplikon Gen PlnS dari L. plantarum S34
Elektroforegram gen plnS ditunjukkan oleh Gambar 2(a). Gen plnS pada
lajur 1 berukuran sekitar ±500 pb. Elektroforegram gen plnS yang telah
dimurnikan ditunjukkan oleh Gambar 2(b) juga berukuran sekitar ±500 pb.
Konsentrasi gen plnS hasil pemurnian ini sebesar 67.2 ng/µL dan rasio A260/A280
sebesar 2.
Plasmid Rekombinan PlnS
Elektroforegram plasmid rekombinan plnS ditunjukkan pleh Gambar 3. Pita
plasmid rekombinan tersebut terdapat pada lajur 1 yang ukurannya di antara 30004000 pb, yaitu sekitar 3500 pb. Ukuran tersebut masih berada di antara ukuran
total vektor pGEM-T Easy dan gen plnS.
5
Gambar 1 Elektroforegram genom L. plantarum S34 (1) genom L. plantarum
S34; (2) marker DNA 1 kb
(a)
(b)
Gambar 2 Elektroforegram gen plnS dari L. plantarum S34; (1) gen plnS; (2)
marker DNA 100 pb; (3) gen plnS telah dimurnikan; (4) marker DNA
100 pb
Gambar 3 Elektroforegram plasmid rekombinan plnS (1) plasmid rekombinan
plnS; (2) marker DNA 1000 pb
Transforman E. coli DH5 yang Membawa Gen PlnS
Transforman E. coli DH5α yang tumbuh di media seleksi koloni biru putih
ditunjukkan oleh Gambar 4. Koloni yang mengandung gen plnS tumbuh menjadi
koloni putih. Koloni putih yang tumbuh sebanyak 69 koloni, sedangkan koloni
biru yang tumbuh sebanyak 61 koloni.
6
Koloni
putih
Koloni
biru
Gambar 4 Hasil seleksi koloni biru-putih dari E. coli DH5α yang membawa
plasmid rekombinan plnS
±500 pb
500 pb
400 pb
Gambar 5 Elektroforegram PCR koloni pada plasmid rekombinan plnS (1) koloni
1; (2) koloni 2; (3) koloni 3; (4) koloni 5; (6) koloni 6; (7) koloni 7; (8)
marker DNA 100 pb
Gambar 6 Elektroforegram pemotongan plasmid rekombinan plnS (1) plasmid E.
coli DH5 koloni 2 hasil restriksi; (2) marker DNA 100 pb
PCR Koloni dan Pemotongan Plasmid Rekombinan
Hasil PCR koloni ditunjukkan oleh Gambar 6. Koloni 1 sampai 7
menunjukkan koloni tersebut mengandung DNA dengan ukuran sekitar 500 pb.
Koloni 2 dipilih untuk diisolasi plasmidnya, kemudian plasmid tersebut
direstriksi. Plasmid tersebut kemudian dipotong dengan enzim restriksi untuk
7
memastikan terdapatnya gen plnS pada plasmid tersebut. Enzim restriksi yang
digunakan adalah NcoI dan SalI. Pemotongan dengan kedua enzim restriksi ini
menghasilkan dua pita dengan ukuran sekitar ±3000 pb dan ±500 pb (Gambar 6).
PEMBAHASAN
Genom L. plantarum S34
Kualitas DNA genom ditentukan melalui analisis elektroforesis gel agarosa
1%. Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita DNA yang cukup tebal,
integritas yang cukup baik, dan tidak terjadi degradasi pada pita DNA. Tebalnya
pita DNA tersebut menunjukkan konsentrasi DNA yang cukup tinggi. Ukuran
DNA ditentukan berdasarkan DNA marker yang digunakan.
Analisis
elektroforesis ini menggunakan DNA marker 1000 pb. Genom L. plantarum
WCSF1 yang homolog dengan L. Plantarum S34 berukuran sebesar 3,3 Mb
(Siezen & Vlieg 2011). Pita DNA genom L. plantarum S34 terdapat pada bagian
atas DNA marker yang digunakan, dan oleh karena itu, ukurannya belum dapat
ditentukan secara akurat karena DNA L. plantarum S34 melebihi ukuran DNA
marker yang digunakan. Namun, posisi pita yang berada di atas DNA marker
menunjukkan bahwa ukuran genom L. plantarum S34 cukup besar dan melebihi
ukuran 10000 pb.
Konsentrasi DNA ditentukan melalui pengukuran absorbansi sampel DNA
pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi DNA genom L. plantarum S34
hasil isolasi sebesar 306.5 ng/µL. Nurhaeni (2011) melakukan isolasi DNA
genom L. plantarum S34 dengan metode yang sama dan menghasilkan
konsentrasi DNA genom sebesar 76.4 ng/µL. Isolasi DNA genom juga dilakukan
oleh Sachinandan et al. (2010) terhadap Lactobacillus yang berasal dari susu
fermentasi dengan menggunakan kit komersial dan metode ampisilin-lisozim.
Isolasi DNA genom dengan menggunakan kit komersial menghasilkan rerata
konsentrasi DNA sebesar 760.5 ng/µL, sedangkan isolasi menggunakan metode
ampisilin-lisozim menghasilkan rerata konsentrasi DNA sebesar 2187.654 ng/µL.
Konsentrasi DNA genom yang didapatkan pada penelitian ini sudah cukup tinggi
jika dibandingkan dengan hasil isolasi yang dilakukan oleh Nurhaeni (2011),
tetapi masih relatif rendah jika dibandingkan dengan hasil isolasi DNA yang
dilakukan oleh Sachinandan et al. (2010). Namun, konsentrasi DNA genom hasil
isolasi sudah cukup baik untuk digunakan sebagai cetakan DNA pada tahap PCR
gen plnS.
Kualitas genom hasil isolasi juga dapat diketahui melalui rasio absorbansi
genom pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Rasio tersebut
menunjukkan kemurnian DNA terhadap protein. Panjang gelombang 260 nm
merupakan panjang gelombang optimum yang dapat diserap oleh asam nukleat,
sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang optimum
yang dapat diserap oleh protein. Nilai rasio 1.7-2.0 menunjukkan kemurnian DNA
yang baik, sedangkan jika nilainya