Validasi metode analisis cemaran staphylococcus aureus pada pupuk hayati
VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN
Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
LESTARI. Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati.
Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Pupuk hayati komersial harus bebas kontaminan sebelum dipasarkan, sehingga pupuk
hayati harus diuji mikrobiologi cemarannya. Metode analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati
yang tervalidasi belum tersedia, oleh sebab itu metode uji yang terstandard harus dibuat. Penelitian
ini bertujuan untuk menyediakan metode standard pengujian cemaran S. aureus pada pupuk hayati
melalui validasi metode berdasarkan presisi dan akurasi. Presisi ditetapkan berdasarkan nilai
Horwitz sedangkan akurasi ditetapkan berdasarkan persen perolehan kembali dan uji T. Metode
acuannya adalah SNI 2332.9:2011 untuk menguji keberadaan S. aureus. Dalam pengujian ini
mikrob rujukan yang digunakan ialah mikrob yang tersertifikasi (S. aureus IPBCC 5.11.666).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode SNI 2332.9:2011 yang diterapkan untuk pupuk
hayati memiliki presisi cukup baik. Simpangan baku relatif (SBR) untuk sampel yang membawa
cemaran S. aureus (berturut-turut sebesar 0,20 dan 0,19) kurang dari 2/3 nilai Horwitz (0,84 dan
0,78). Persen perolehan kembali cemaran S. aureus ialah sebesar 172,34 %. Nilai perolehan
kembali masuk dalam kisaran (48-291%) yang ditetapkan oleh Environmental Protection Agency.
Uji T pada akurasi dan presisi jumlah sel S. aureus memperlihatkan hasil yang berbeda nyata pada
α = 0,05. Berdasarkan nilai presisi dan akurasi (persen perolehan kembali), metode SNI
2332.9:2011 dapat diaplikasikan sebagai metode uji cemaran mikrob pupuk hayati.
Kata kunci : validasi, metode analisis mikrobiologi, presisi, akurasi.
ABSTRACT
LESTARI. Validation Method of Staphylococcus aureus Contamination Analysis in Biological
Fertilizer. Supervised by GAYUH RAHAYU and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Commercial bio-fertilizers must be free from contaminants. Yet, microbial testing
methodology which validated for bio-fertilizers is not available. Therefore, such a method should
be made available by validation procedure of certain reference method. This study aims to provide
a standard method of testing microbial contamination S. aureus on bio-fertilizer. This method
should fulfill the validation parameters, such as precision and accuracy. Precision is estimated by
the Horwitz’s value and that of accuracy from the percent recovery. Precision is estimated by
comparing the relative standard deviation (RSD) to the Horwitz’s value and accuracy is estimated
by percentage of recovery and T test. The reference methods used is SNI 2332.9:2011 for the
presence of S. aureus. In this research the contaminatS. aureus IPBCC 5.11.666)is used as a
reference mataerial. he result indicated that SNI 2332.9:2011 have a high precision, since the
relative standard deviation for sample and contaminant (0.20 and 0.19) of less than 2/3 value
Horwitz (0.84 and 0.78). Percent recovery of contaminant S. aureus is 172.34%. The value of S.
aureus were in the range limit (48-291%) of the Environmental Protection Agency. T-test of the
accuracy and precision S. aureus test showed significantly different at α = 0.05. Based on the value
of precision and accuracy (% recovery), SNI 2332.9:2011 can be applied as microbial
contamination test method bio-fertilizer.
Key word: validation, testing method for microbiology, precision, accuracy.
VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN
Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Judul : Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk
Hayati
Nama : Lestari
NIM : G34070090
Disetujui :
Pembimbing II
Pembimbing I
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
NIP. 195801051983032002
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP. 19671127 199302 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
RAWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 10 Januari 1989 dari Bapak Timan dan Ibu
Warti. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SD Negeri 025 Delik, Kabupaten Kampar, Riau. Tahun 2004
penulis lulus dari SLTP Negeri 4 Bulukerto, Kabupaten Wonogiri, Jawa Tengah. Tahun 2007
penulis lulus dari SMA Negeri 1 Kerinci Kanan, Kabupaten Siak Sri Indrapura, Riau. Pada tahun
yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Bibit Unggul Daerah (BUD).
Pada tahun 2008 penulis diterima di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar TPA di desa Balumbang Jaya
tahun 2009. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Serambi Ruhiyah Mahasiswa Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (SERUM-G) pada tahun 2008-2009 serta menjadi panitia
diberbagai kegiatan antara lain Ekspresi Muslimah (Eksmus), dan Masa Perkenalan Mahasiswa
Baru (MPKMB) IPB angkatan 45. Pada tahun 2010/2011 penulis pernah menjadi Senior Resident
(SR) di Asrama TPB IPB.
PRAKATA
Segala puji bagi Tuhan Yang Mahaesa atas segala limpahan rizki dan rahmat-Nya sehingga
karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah dengan judul “Validasi Metode Analisis
Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati” Ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari
bulan Maret sampai September 2011.
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Ibu Dr. Ir. Gayuh Rahayu dan Ibu Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saran
selama penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga disampaiakan
kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan koreksi dan
saran-saran dalam perbaikan skripsi ini.
Terima kasih kepada Bapak, Ibu, Sugeng Widodo, Mulyani, Arief Nur Din Syah, Yunus
Budiawan serta Pemerintah Daerah (Pemda) Kabupaten Siak atas segala dukungan baik moril,
materil, serta doa selama penulis menempuh pendidikan hingga karya ilmiah ini terselesaikan.
Terima kasih kepada laboran Laboratorium Mikologi, IPBCC dan Laboratorium
Mikrobiologi: Bu Emi, Bu Riana, Pak Kus, Bu Heni, Pak Jaka, Pak Aldian atas bantuannya, dan
teman-teman dari Sekolah Pascasarjana: Ibu Yuyun, Ibu Dini, Ibu Ade, Pak Yosi serta temanteman seperjuangan di laboratorium mikologi (IPBCC): Rahmah, Sepri, dan teman-teman Biologi
44, terima kasih atas kerjasamanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2011
Lestari
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................................... 2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................................ 2
Bahan dan Alat....................................................................................................................... 2
Metode ................................................................................................................................... 2
Persiapan Kultur Kerja .................................................................................................. 2
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ........................................................................ 2
Pembuatan Cemaran (spike) dari CRM ......................................................................... 2
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ...................................................................... 2
Pengolahan Data ............................................................................................................ 3
HASIL
Kultur Kerja... ........................................................................................................................ 3
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ................................................................................ 3
Cemaran (spike) dari CRM .................................................................................................... 4
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ............................................................................... 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Pertumbuhan Certified Reference Material (CRM) S. aureus pada media BPA... ........................ 3
2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat pada pupuk hayati di media BPA... ....................................... 3
3 Hasil uji kontrol positif S. aureus pada pupuk hayati di media BPA ............................................ 4
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Di dalam sebuah pengujian diperlukan
metode dan peralatan yang absah. Hal ini
dilakukan agar metode dapat dijamin dan
sesuai untuk penggunaan yang dimaksud
dengan hasil uji cukup handal (reliable).
Evaluasi metode ini dikenal dengan istilah
validasi. Validasi adalah konfirmasi dengan
pengujian dan penyediaan bukti objektif
bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud khusus dipenuhi (ISO 2008). Metode
yang harus divalidasi yaitu metode yang tidak
baku,
metode
yang
dikembangkan
laboratorium, metode baku yang digunakan
di luar lingkup dan metode baku yang
dimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa
metode itu sesuai untuk penggunaan yang
dimaksud (ISO 2008).
Validasi metode bermanfaat untuk
mengevaluasi unjuk kerja suatu metode
analisis, menjamin prosedur analisis yang
akurat, menekan sekecil-kecilnya resiko
penyimpangan yang timbul, dan menjamin
kedapatulangan yang tepat. Suatu metode
analisis dikatakan absah jika telah memenuhi
syarat keberterimaan parameter validasi.
Parameter yang dimaksud yaitu presisi dan
akurasi.
Metode yang telah divalidasi eksternal
seperti Association Official of Analytical
Chemistry (AOAC) harus memenuhi
persyaratan presisi dan akurasi. Presisi
(keseksamaan) didefinisikan sebagai ukuran
derajat kesesuaian antara hasil individual dari
rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil
dari campuran yang homogen (Harmita
2004). Presisi dapat dilihat dari simpangan
baku (SB) dan simpangan baku relatif (SBR)
yang diperoleh dari pengukuran. Presisi yang
baik akan memberikan nilai median dari
ulangan di antara selang rata-rata ± SB
(Saefuddin et al. 2009) dan SBR kurang dari
2/3 nilai Horwitz (AOAC 2005). Menurut
ISO, akurasi (kecermatan) didefinisikan
sebagai kesesuaian antara hasil analisis
dengan nilai benar atau nilai acuan yang
dapat diterima. Kecermatan dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (recovery)
dari mikrob cemaran yang ditambahkan.
Persen perolehan kembali adalah angka yang
menunjukkan besarnya penambahan standar
yang mampu diidentifikasi kembali dengan
suatu metode. Nilai perolehan kembali
bergantung pada matriks sampel, prosedur
proses sampel, dan konsentrasi cemaran.
Batas penerimaan perolehan kembali menurut
EPA (2005) ialah 48-291%.
Laboratorium IPB Culture Collection
(IPBCC) saat ini sedang dalam proses
persiapan diri untuk akreditasi ISO/IEC
17025:2005. Salah satu persyaratan akreditasi
ialah implementasi metode uji yang sudah
divalidasi sesuai dengan ketentuan pada
ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4 (BSN 2008a).
Metode analisis yang akan divalidasi
diadopsi dari metode standard yang valid.
Untuk akreditasi IPBCC perlu melakukan
validasi metode uji pada ruang lingkup
parameter yang akan diakreditasi. Ruang
lingkup IPBCC yang akan diakreditasi ialah
pupuk hayati dengan parameter cemaran
mikrob nonsimbiotik. Metode standard
sebagai rujukannya ialah metode Standard
Nasional Indonesia (SNI). Metode SNI
banyak merujuk pada buku AOAC. Metode
ini akan digunakan untuk menguji mikrob
pada pupuk hayati karena pupuk tersebut
mengandung berbagai organisme hidup.
Pupuk hayati didefinisikan sebagai
inokulan berbahan aktif organisme hidup
yang berfungsi untuk menambat hara tertentu
atau memfasilitasi tersedianya hara dalam
tanah bagi tanaman, misal pupuk hayati
Rhiphosan mengandung bakteri Bradyrhizobium japonicum perangsang bintil akar
dan Aeromonas punctata untuk pelarutan
fosfat. Ketersediaan hara ini dapat
berlangsung melalui peningkatan akses
tanaman terhadap hara misalnya oleh
cendawan mikoriza arbuskuler, pelarutan
oleh mikrob pelarut fosfat, maupun
perombakan oleh aktinomiset (Simanungkalit
et al. 2006). Pupuk hayati semacam itu harus
diuji bebas cemaran yaitu mikrob lain selain
mikrob komposisi pada pupuk. Mikrob lain
yang
tumbuh
dapat
mengganggu
pertumbuhan mikrob komposisi. Hal ini
dapat menurunkan efektivitas pupuk hayati.
Dalam pengujian cemaran mikrob
digunakan mikrob indikator, karena selain
mudah dideteksi juga dapat memberikan
gambaran tentang kondisi higienis dari
produk yang diuji (BPOM RI 2008). Mikrob
indikator adalah golongan atau spesies
bakteri yang kehadirannya dalam jumlah di
atas batas (limit) tertentu, merupakan
pertanda bahwa bahan telah terpapar dengan
kondisi-kondisi
yang
memungkinkan
berkembangbiaknya mikrob patogen (BPOM
RI 2008). Mikrob indikator digunakan untuk
menilai keamanan dan mutu mikrobiologi
bahan (BPOM RI 2008).
2
Pada saat ini metode standard uji
analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati
belum tersedia. Oleh sebab itu, metode
standard untuk keperluan ini harus divalidasi.
Metode yang divalidasi ialah metode yang
telah valid akan tetapi diterapkan pada
sampel yang berbeda. Metode yang akan
divalidasi pada penelitian ini termasuk ke
dalam kategori metode baku yang digunakan
di luar lingkup yang dimaksud. Metode
analisis mikrobiologi dihitung secara
kuantitatif dengan metode angka lempeng
total (ALT). Angka lempeng total
dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah
mikrob yang terdapat dalam suatu produk
dengan cara menghitung koloni bakteri yang
ditumbuhkan pada media agar (BSN 2008b).
Validasi metode uji cemaran mikrob
sedikit berbeda dengan validasi metode uji
kimia. Dalam cemaran mikrob sebagai CRMnya digunakan makhluk hidup yang dikenal
sebagai kultur murni bakteri. Metode rujukan
yang digunakan dalam penelitian ini ialah
metode SNI 2332.9:2011 untuk menguji
keberadaan S. aureus (BSN 2011). Produk
makanan diganti dengan sampel pupuk
hayati.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan memvalidasi
metode
standard
pengujian
dengan
mengevaluasi kinerja metode, meliputi presisi
dan akurasi sebagai pembuktian kinerja
metode uji cemaran mikrob Staphylococcus
aureus pada pupuk hayati.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Maret 2011 sampai bulan September 2011 di
Laboratorium Analis Uji IPBCC, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam
penelitian
ini
ialah
pupuk
hayati
(Rhiphosant),
dan
mikrob
rujukan
Staphylococcus aureus IPBCC 5.11.666
(ATCC 6538) yang merupakan Certified
Reference Material (CRM). Baird Parker
Agar (BPA) dan Butterields Phosphate
Buffered (BPB) (Lampiran 1). Alat-alat
laboratorium yang digunakan ialah laminar,
autoklaf, inkubator, neraca analitik, pipet
mikro, cawan petri, tabung reaksi,
Erlenmeyer, serta peralatan umum yang
digunakan di laboratorium.
Metode
Persiapan Kultur Kerja. Kultur
stok dari CRM dibiakkan kembali dan
dijadikan kultur kerja. Kultur kerja S. aureus
dibuat dengan cara menggoreskan satu lup
biakan pada media NA cawan dan biakan
diinkubasi pada kondisi ruang selama 48 jam.
S. aureus yang telah tumbuh pada media NA
digores ke media selektif BPA untuk
pembanding.
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk
Hayati. Sebanyak 10 gram pupuk hayati
tanpa sterilisasi dicampur dalam 90 mL BPB
dan
dihomogenkan
di
atas
mesin
penggoyang. Sebanyak 0,1 mL disebarkan
pada media BPA.
Pembuatan Cemaran (Spike) dari
CRM. Suspensi cemaran S. aureus dibuat
dengan cara sebanyak 2 lup biakan
dimasukkan ke dalam 100 mL BPB dalam
Erlenmeyer ukuran 1L. Bakteri yang berada
dalam media cair tersebut diinkubasi selama
24 jam pada suhu ± 35 ˚C. Setelah masa
inkubasi berakhir, sebanyak 0,1 mL suspensi
biakan disebar pada media BPA dan
diinkubasi pada suhu ± 35 ˚C. konsentrasi
bakteri dihitung dengan metode ALT. Setelah
dianalisis, spike tersebut disimpan di lemari
pendingin 10 ˚C untuk dipergunakan sebagai
sumber cemaran.
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk
Hayati. Sampel yang dianalisis terbagi dalam
2 kelompok perlakuan yaitu pupuk hayati
yang diberi cemaran (sampel positif) dan
pupuk hayati tanpa cemaran (sampel negatif).
Sampel positif merupakan matriks
yang membawa cemaran pada konsentrasi
yang diketahui. Sebanyak 10 mL spike S.
aureus (dengan konsentrasi terstandard)
ditambahkan ke dalam masing-masing 10 g
sampel pupuk hayati. Kemudian ke dalam
campuran tadi ditambahkan media BPB
sehingga volume campuran mencapai 100
mL. Kemudian campuran didiamkan selama
2 menit dan dihomogenkan di atas mesin
penggoyang. Konsentrasi cemaran yang ada
pada sampel dihitung secara kuantitatif
dengan metode ALT cawan sebar pada media
BPA. Sebelum dianalisis, suspensi sampel
3
dihomogenkan
kemudian
dicawankan.
Sebanyak 0,1 mL disebarkan pada media
BPA. Biakan S. aureus diinkubasi pada suhu
± 35˚C selama 2-3 hari. Jumlah koloni yang
tumbuh pada cawan dihitung dan dinyatakan
dalam colony formy unit (cfu) mL-1.
Pengenceran dengan kerapatan koloni 25-250
koloni/cawan (BSN 2008b) digunakan dalam
perhitungan presisi dan akurasi.
Prosedur yang sama dilakukan untuk
sampel negatif yaitu sampel tanpa cemaran.
Sampel tanpa cemaran adalah pupuk hayati
yang disterilisasi. Sterilisasi dilakukan untuk
lebih meyakinkan bahwa pupuk tersebut
bebas dari cemaran yang akan diujikan.
Sterilisasi pupuk juga dilakukan agar tidak
ada mikrob lain yang tumbuh sehingga
menghambat pertumbuhan cemaran di dalam
pupuk. Masing-masing perlakuan minimal
diulang sebanyak tujuh kali.
Pengolahan Data. Data diolah untuk
mendapatkan nilai presisi dan akurasi. Presisi
ditetapkan berdasarkan simpangan baku (SB)
dan simpangan baku relatif (SBR) (Saefuddin
et al. 2009) dari ulangan. SB dan SBR
dihitung dengan rumus berikut :
C: cemaran tanpa sampel (kontrol
positif)
Tingkat
akurasi
metode
ditetapkan
berdasarkan perbandingannya terhadap nilai
perolehan kembali yang ditetapkan oleh EPA
(2005).
Uji komparatif dilakukan untuk
membuktikan kekuatan dari metode uji
melalui uji beda nyata antara sampel positif
dan kontrol positif. Uji komparatif dilakukan
dengan uji T dengan menghitung nilai P
menggunakan software Minitab 14.
HASIL
Kultur Kerja
Kultur CRM S. aureus tumbuh pada
media BPA dengan ciri koloni berwarna abuabu hingga kehitaman dan sekeliling tepi
koloni bening (terbentuk halo). Koloni
berbentuk bundar, cembung, licin/halus
dengan tepian rata, tumbuh setelah 48 jam
inkubasi di media BPA (Gambar 1).
a
b
SB =
SBR = SB/χ
SB
SBR
: simpangan baku
: simpangan baku relatif
(koefisien keragaman)
x
: rata-rata dari ulangan
n
: ulangan
x1, x2,....xn : nilai konsentrasi ke-1.... n
Jika SBR kurang dari 2/3 nilai Horwitz
(AOAC 2005) maka metode dapat diterima.
Nilai Horwitz dihitung dengan persamaan
berikut:
Nilai Horwitz = 2(1-0,5log Y)
Y: rata-rata konsentrasi cemaran
(kontrol positif)
Akurasi diukur dengan persentase
perolehan kembali melalui uji komparatif.
Persentase perolehan kembali adalah
banyaknya cemaran yang dapat diisolasi
kembali dari sejumlah cemaran yang
dimasukkan ke dalam sampel. Persen
perolehan kembali (recovery) dihitung
dengan rumus berikut:
% recovery (R) = [(A-B)/C] × 100
A: sampel dengan cemaran (sampel
positif)
B: sampel tanpa cemaran (sampel
negatif)
Gambar 1 Pertumbuhan Certified Reference
Material (CRM) S. aureus pada
media BPA (a) S. aureus dari media
NA (b) koloni tunggal S. aureus
setelah diencerkan.
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati
Hasil analisis awal pupuk hayati
mengandung bakteri pada media selektif BPA
(Gambar 2). Bakteri yang tumbuh berwarna
hitam akan tetapi tidak memiliki zona bening
setelah diinkubasi selama 2-3 hari. Analisis
ini dibandingkan terhadap CRM-nya yang
menunjukkan bahwa pupuk hayati yang
digunakan dinyatakan bebas dari S. aureus.
Gambar 2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat
pada pupuk hayati di media BPA.
4
ulangan ke-3 (385) dan ke-4 (400). Pada
Cemaran (Spike) dari CRM
sampel positif terdapat dua data yang berbeda
Konsentrasi sumber inokulum S.
nyata dengan uji T yaitu pada ulangan ke-2
aureus sebagai spike kontrol positif yang
dan ke-3 (650).
tumbuh pada media BPA sebesar
315
cfu.mL-1 (Gambar 3) (Tabel 1).
Tabel 1 Presisi uji cemaran S. aureus
Ulangan
1
2
3
4
5
6
7
Rata-rata
SB
Median
Batas atas
Batas bawah
SBR
2/3 nilai Horwitz
Jumlah sel S. aureus (cfu mL-1)
KPa
SPb
260
600
355
650 d
650 d
385d
d
400
400
265
450
285
600
255
450
315,00
542,86
62,92
105,79
285,00
600,00
377,92
648,64
252,08
437,07
0,20
0,19
0,84
0,78
SNc
0
0
0
0
0
0
0
0
-
Keterangan: a: Jumlah sel yang tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 10x ; b: Jumlah sel yang
tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 100x; c: Jumlah sel yang tumbuh dari
pupuk hayati yang disterilisasi; d: berbeda nyata dengan uji T pada taraf α= 0,05.
PEMBAHASAN
Gambar 3 Hasil uji kontrol positif S. aureus
pada pupuk hayati di media BPA.
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati
Konsentrasi S. aureus dari spike yang
ditambahkan ke dalam pupuk hayati sebagai
sampel positif yang tumbuh pada media BPA
sebesar 543 cfu.mL-1 (Tabel 1). Nilai SB dan
SBR metode uji berturut-turut sebesar 62,92
dan 0,20 pada kontrol positif serta 105,79 dan
0,19 pada sampel positif (Tabel 1).
Data perolehan kembali cemaran S.
aureus dan nilai P (software Minitab 14)
berturut-turut yaitu sebesar 172,34 % dan P=
0,002. Nilai persen perolehan kembali
menunjukkan bahwa metode S. aureus
memiliki akurasi tinggi karena memenuhi
batas penerimaan EPA (2005) yaitu 48291%.
Nilai
P
yang
diperoleh
menggambarkan penyimpangan kesalahan
data (standard eror) yang fungsinya sama
dengan α.
Dari ketujuh data kontrol positif pada
S. aureus yang diperoleh terdapat dua data
yang berbeda nyata dengan uji T yaitu pada
Pupuk hayati yang beredar di pasaran
sangat
beragam
diantaranya
yaitu
Rhiphosant. Pupuk Rhiphosant mengandung
bakteri
Bradyrhizobium
japonicum
perangsang pembentukan bintil akar dan
Aeromonas punctata untuk pelarutan fosfat.
Sebelum dipasarkan pupuk hayati
harus melewati uji efektivitas dan uji
mikrobiologi cemaran. Bakteri adalah jenisjenis kontaminan biologi. akteri S. aureus
merupakan salah satu jenis bakteri yang
umum ditemukan di tanah. Pupuk hayati
yang dianalisis tidak mengandung S. aureus
sehingga bakteri ini digunakan sebagai
pencemar (spike). Menteri Pertanian RI
(2009) menetapkan persyaratan teknis
cemaran pupuk hayati untuk kontaminan
Escherichia coli dan Salmonella sp. minimal
nol pada pengenceran 10-3. Pada penelitian
ini cemaran S. aureus pada pupuk hayati
sebesar kurang dari 10 pada pengenceran
10-2. Dengan demikian pada pengenceran 10-3
diduga tidak dijumpai lagi cemaran S. aureus.
Spike adalah cemaran sebagai kontrol
positif yang telah diketahui dengan pasti
jumlah koloni/ml. Cemaran S. aureus dipilih
menjadi bakteri pencemar karena bakteri ini
dapat diisolasi dari tanah rhizospher pada
gandum. Bakteri ini dapat dimanfaatkan
5
sebagai mikrob pendegradasi anilin di tanah
(Ahmed 2010).
Dari kontrol positif diketahui bahwa
mikrob cemaran yang ditambahkan ke dalam
pupuk sebesar 315 cfu/mL. Konsentrasi ini
tidak menunjukkan jumlah yang sama
dengan konsentrasi sumber cemaran yang
ditambahkan pada sampel positif. Hal ini
mengindikasikan bahwa spike konsentrasi
cemaran pada saat diuji sukar dijaga untuk
tetap konstan jumlah selnya. Meskipun spike
yang sudah ditetapkan konsentrasinya
disimpan dalam lemari pendingin 10˚C. Pada
penelitian ini, dilakukan 7 kali ulangan dan
lebih besar dari jumlah ulangan yang
dianjurkan oleh Harmita (2004) yaitu paling
sedikit 6 kali. Keterulangan digunakan untuk
meningkatkan ketelitian percobaan dan
mengendalikan ragam galat. Untuk bahan
yang sudah terdeskripsi secara jelas seperti
pupuk buatan maka diperlukan ulangan yang
kecil.
Metode analisis cemaran S. aureus
pada pupuk hayati memperlihatkan nilai
simpangan baku relatif yang telah memenuhi
kriteria yang ditetapkan oleh AOAC (2005)
untuk dapat disebut sebagai metode yang
menghasilkan ketelitian cukup baik, yaitu
dengan nilai SBR (0,20 dan 0,19) < 2/3
Horwitz (0,84 dan 0,78) (Tabel 1).
Presisi merupakan kedekatan di antara
beberapa individu hasil pengujian oleh analis
yang sama pada kondisi sama dan dalam
interval waktu yang pendek (intraday)
(Harmita 2004). Presisi untuk uji cemaran
mikrob diukur dengan melihat kandungan
cemaran yang ada dalam sampel, membuat
cemaran dan memberi cemaran pada sampel.
Setelah uji presisi maka dapat
dilanjutkan dengan uji akurasi. Metode
analisis S. aureus memberikan persen
perolehan kembali sebesar 172,34 %.
Artinya, metode ALT yang digunakan untuk
menghitung jumlah sel S. aureus dalam
kontrol positif dan sampel positif dapat
menunjukkan jumlah sel S. aureus dengan
ketepatan rata-rata sebesar 172,34 % dari
jumlah sel terhitung pada kultur awal.
Berdasarkan nilai perolehan kembali
ketetapan EPA (2005) yaitu 48-291% maka
metode analisis S. aureus telah memenuhi
batas penerimaan EPA. Hal ini dapat
dikatakan bahwa metode analisis cemaran S.
aureus pada pupuk hayati dapat diterapkan di
laboratorium
IPBCC
berdasarkan
keakuratannya. Menurut Harmita (2004)
akurasi sangat tergantung pada sebaran galat
sistematik di dalam keseluruhan tahap
analisis. Oleh karena itu untuk mencapai
kecermatan yang tinggi hanya dapat
dilakukan dengan cara mengurangi galat
sistematik tersebut seperti menggunakan
peralatan
yang
telah
dikalibrasi,
menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik,
pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang
cermat, taat asas sesuai prosedur. Pada
penelitian
ini
metode
pengambilan
homogenasi dengan pipet mikro terganggu
oleh partikel pupuk yang menggunakan
bahan pembawa gambut yang tidak larut,
sehingga mengganggu kecermatan.
Berdasarkan uji T diketahui bahwa
dari ketujuh data sampel positif S. aureus
yang diperoleh, terdapat dua data yang
berbeda nyata dengan uji T pada taraf α =
0,05, yaitu pada ulangan ke-2 dan ke-3 yaitu
650 cfu mL-1. Hasil yang berbeda nyata ini
menunjukkan bahwa metode ALT yang
digunakan untuk menghitung sel S. aureus
pada pupuk hayati memiliki keragaman data
pada taraf α = 0,05.
Analisis beda nyata yang dilakukan
menunjukkan bahwa nilai P pada data hasil
analisis S. aureus sebesar 0,002. Nilai P yang
diperoleh menunjukkan bahwa ketujuh data
analisis yang didapat berbeda nyata pada
taraf α sebesar 0,05. Keragaman data yang
dimaksud adalah selisih jumlah sel pada
ulangan yang satu dengan ulangan yang
lainnya. Nilai simpangan baku (SB) yang
diperoleh akan menunjukkan keragaman data
yang diperoleh. Nilai SB juga akan
membentuk selang data. Selang data yang
terdiri atas batas bawah dan batas atas akan
menentukan data-data yang berbeda nyata
pada taraf α = 0,05.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Validasi
metode
analisis
Staphylococcus aureus pada pupuk hayati
dengan menggunakan SNI 2332.9:2011 yaitu
Cara Uji Mikrobiologi-Bagian 9: Penentuan
Staphylococcus
aureus
pada
produk
perikanan dapat memenuhi kriteria presisi
dan akurasi yang memenuhi kriteria sebagai
metode uji sampel pupuk hayati. Metode ini
dapat diterapkan sebagai metode standard uji
di laboratorium IPB Culture Collection.
Saran
Penyimpanan spike pada kondisi
lingkunngan yang baik perlu dicari agar
jumlah mikrob dalam spike relatif konstan.
Uji ketertiruan untuk parameter ketelitian
6
perlu dilakukan agar dapat diketahui
pengaruh dari kerja analis, kondisi instrumen
dan waktu analisis yang berbeda dalam
laboratorium yang sama maupun berbeda
terhadap hasil akhir. Perlu juga dilakukan
pembuatan formulasi pupuk dengan cemaran
terlebih dahulu sebelum dianalisis.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed S et al. 2010. Isolation and
characterization of a bacteria strain
for aniline degradation. Afr J
Biotechnol 9:1173-1179.
[AOAC] Association Official of Analytical
Chemistry. 2005. Official Method of
Analysis. Washington DC: AOAC.
[BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia. 2008.
Pengujian mikrobiologi pangan.
Jakarta: Badan POM RI.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008a.
Pelatihan Audit Internal Sistim
Manajemen Mutu Laboratorium.
Jakarta: BSN.
[BSN] Badan Standar Nasional. 2008b.
Metode pengujian cemaran mikrob
dalam daging, telur dan susu, serta
hasil olahannya. Jakarta: BSN;
(Standard
Nasional
Indonesia
2897:2008).
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2011.
Cara uji mikrobiologi - bagian 9:
penentuan Staphylococcus aureus
pada produk perikanan. Jakarta:
BSN; (Standard Nasional Indonesia
2332.9:2011).
[EPA] Environmental Protection Agency.
2005. Manual for the Certification
of Laboratories Analyzing Drinking
Water: Criteria and Procedurer
Quality Assurance. Edke-5. Ohio:
US International Protection Agency
Office of Water.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya.
Majal Ilm Kefarm 1:117-135.
[ISO]
International
Organization
for
Standardization. 2008. Persyaratan
umum kompetensi laboratorium
pengujian
dan
laboratorium
kalibrasi. Jakarta: ISO; (SNI
ISO/IEC
17025:2008
(klausul
5.4.5.1 dan 5.4.5.2).
Menteri Pertanian Republik Indonesia. 2009.
Peraturan
Menteri
Pertanian
28/Permentan/SR.130/5:2009
Tentang Pupuk Organik, Pupuk
Hayati dan Pembenah Tanah.
Jakarta: Menteri Pertanian RI.
Saefuddin A, Notodiputro KH, Alamudi A,
Sadik K. 2009. Statistika Dasar.
Jakarta: PT Grasindo.
Simanungkalit RDM, Suriadikarta DA,
Saraswati R, Setyorini D, Hartatik
W. 2006. Pupuk Organik dan Pupuk
Bogor:
Balai
Besar
Hayati.
Penelitian
dan
Pengembangan.
LAMPIRAN
8
Lampiran 1 Pembuatan Pereaksi Media BPA dan BPB
1. Larutan media baird parker agar (BPA) menurut SNI 2332.9:2011
BPA sintetik
60 g
Aquades
1L
Egg Yolk
50 mL
Larutan BPA dan aquades tersebut dididihkan. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama
15 menit. Media didinginkan hingga suhu 45 ˚C kemudian ditambahkan egg yolk.
2. Larutan butterfield’s phosphate buffered (BPB) menurut SNI 2332.9:2011
Larutan stok
34 g
KH2PO4
Aquades
500 mL
pH larutan diatur 7,2 dengan menggunakan 1 N NaOH. Volume larutan ditepatkan hingga
1000 mL dengan penambahan aquades. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15
menit. Larutan stok disimpan dalam refrigerator. Cara membuat larutan kerja yaitu sebanyak
10 mL larutan stok diambil dan ditepatkan hingga 1000 mL dengan penambahan aqudes.
Kemudia larutan disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15 menit.
Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
LESTARI. Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati.
Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Pupuk hayati komersial harus bebas kontaminan sebelum dipasarkan, sehingga pupuk
hayati harus diuji mikrobiologi cemarannya. Metode analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati
yang tervalidasi belum tersedia, oleh sebab itu metode uji yang terstandard harus dibuat. Penelitian
ini bertujuan untuk menyediakan metode standard pengujian cemaran S. aureus pada pupuk hayati
melalui validasi metode berdasarkan presisi dan akurasi. Presisi ditetapkan berdasarkan nilai
Horwitz sedangkan akurasi ditetapkan berdasarkan persen perolehan kembali dan uji T. Metode
acuannya adalah SNI 2332.9:2011 untuk menguji keberadaan S. aureus. Dalam pengujian ini
mikrob rujukan yang digunakan ialah mikrob yang tersertifikasi (S. aureus IPBCC 5.11.666).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode SNI 2332.9:2011 yang diterapkan untuk pupuk
hayati memiliki presisi cukup baik. Simpangan baku relatif (SBR) untuk sampel yang membawa
cemaran S. aureus (berturut-turut sebesar 0,20 dan 0,19) kurang dari 2/3 nilai Horwitz (0,84 dan
0,78). Persen perolehan kembali cemaran S. aureus ialah sebesar 172,34 %. Nilai perolehan
kembali masuk dalam kisaran (48-291%) yang ditetapkan oleh Environmental Protection Agency.
Uji T pada akurasi dan presisi jumlah sel S. aureus memperlihatkan hasil yang berbeda nyata pada
α = 0,05. Berdasarkan nilai presisi dan akurasi (persen perolehan kembali), metode SNI
2332.9:2011 dapat diaplikasikan sebagai metode uji cemaran mikrob pupuk hayati.
Kata kunci : validasi, metode analisis mikrobiologi, presisi, akurasi.
ABSTRACT
LESTARI. Validation Method of Staphylococcus aureus Contamination Analysis in Biological
Fertilizer. Supervised by GAYUH RAHAYU and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Commercial bio-fertilizers must be free from contaminants. Yet, microbial testing
methodology which validated for bio-fertilizers is not available. Therefore, such a method should
be made available by validation procedure of certain reference method. This study aims to provide
a standard method of testing microbial contamination S. aureus on bio-fertilizer. This method
should fulfill the validation parameters, such as precision and accuracy. Precision is estimated by
the Horwitz’s value and that of accuracy from the percent recovery. Precision is estimated by
comparing the relative standard deviation (RSD) to the Horwitz’s value and accuracy is estimated
by percentage of recovery and T test. The reference methods used is SNI 2332.9:2011 for the
presence of S. aureus. In this research the contaminatS. aureus IPBCC 5.11.666)is used as a
reference mataerial. he result indicated that SNI 2332.9:2011 have a high precision, since the
relative standard deviation for sample and contaminant (0.20 and 0.19) of less than 2/3 value
Horwitz (0.84 and 0.78). Percent recovery of contaminant S. aureus is 172.34%. The value of S.
aureus were in the range limit (48-291%) of the Environmental Protection Agency. T-test of the
accuracy and precision S. aureus test showed significantly different at α = 0.05. Based on the value
of precision and accuracy (% recovery), SNI 2332.9:2011 can be applied as microbial
contamination test method bio-fertilizer.
Key word: validation, testing method for microbiology, precision, accuracy.
VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN
Staphylococcus aureus PADA PUPUK HAYATI
LESTARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Judul : Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk
Hayati
Nama : Lestari
NIM : G34070090
Disetujui :
Pembimbing II
Pembimbing I
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
NIP. 195801051983032002
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP. 19671127 199302 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
RAWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 10 Januari 1989 dari Bapak Timan dan Ibu
Warti. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SD Negeri 025 Delik, Kabupaten Kampar, Riau. Tahun 2004
penulis lulus dari SLTP Negeri 4 Bulukerto, Kabupaten Wonogiri, Jawa Tengah. Tahun 2007
penulis lulus dari SMA Negeri 1 Kerinci Kanan, Kabupaten Siak Sri Indrapura, Riau. Pada tahun
yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Bibit Unggul Daerah (BUD).
Pada tahun 2008 penulis diterima di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar TPA di desa Balumbang Jaya
tahun 2009. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Serambi Ruhiyah Mahasiswa Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (SERUM-G) pada tahun 2008-2009 serta menjadi panitia
diberbagai kegiatan antara lain Ekspresi Muslimah (Eksmus), dan Masa Perkenalan Mahasiswa
Baru (MPKMB) IPB angkatan 45. Pada tahun 2010/2011 penulis pernah menjadi Senior Resident
(SR) di Asrama TPB IPB.
PRAKATA
Segala puji bagi Tuhan Yang Mahaesa atas segala limpahan rizki dan rahmat-Nya sehingga
karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah dengan judul “Validasi Metode Analisis
Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati” Ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari
bulan Maret sampai September 2011.
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Ibu Dr. Ir. Gayuh Rahayu dan Ibu Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saran
selama penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga disampaiakan
kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan koreksi dan
saran-saran dalam perbaikan skripsi ini.
Terima kasih kepada Bapak, Ibu, Sugeng Widodo, Mulyani, Arief Nur Din Syah, Yunus
Budiawan serta Pemerintah Daerah (Pemda) Kabupaten Siak atas segala dukungan baik moril,
materil, serta doa selama penulis menempuh pendidikan hingga karya ilmiah ini terselesaikan.
Terima kasih kepada laboran Laboratorium Mikologi, IPBCC dan Laboratorium
Mikrobiologi: Bu Emi, Bu Riana, Pak Kus, Bu Heni, Pak Jaka, Pak Aldian atas bantuannya, dan
teman-teman dari Sekolah Pascasarjana: Ibu Yuyun, Ibu Dini, Ibu Ade, Pak Yosi serta temanteman seperjuangan di laboratorium mikologi (IPBCC): Rahmah, Sepri, dan teman-teman Biologi
44, terima kasih atas kerjasamanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2011
Lestari
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................................... 2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................................ 2
Bahan dan Alat....................................................................................................................... 2
Metode ................................................................................................................................... 2
Persiapan Kultur Kerja .................................................................................................. 2
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ........................................................................ 2
Pembuatan Cemaran (spike) dari CRM ......................................................................... 2
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ...................................................................... 2
Pengolahan Data ............................................................................................................ 3
HASIL
Kultur Kerja... ........................................................................................................................ 3
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ................................................................................ 3
Cemaran (spike) dari CRM .................................................................................................... 4
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ............................................................................... 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Pertumbuhan Certified Reference Material (CRM) S. aureus pada media BPA... ........................ 3
2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat pada pupuk hayati di media BPA... ....................................... 3
3 Hasil uji kontrol positif S. aureus pada pupuk hayati di media BPA ............................................ 4
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Di dalam sebuah pengujian diperlukan
metode dan peralatan yang absah. Hal ini
dilakukan agar metode dapat dijamin dan
sesuai untuk penggunaan yang dimaksud
dengan hasil uji cukup handal (reliable).
Evaluasi metode ini dikenal dengan istilah
validasi. Validasi adalah konfirmasi dengan
pengujian dan penyediaan bukti objektif
bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud khusus dipenuhi (ISO 2008). Metode
yang harus divalidasi yaitu metode yang tidak
baku,
metode
yang
dikembangkan
laboratorium, metode baku yang digunakan
di luar lingkup dan metode baku yang
dimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa
metode itu sesuai untuk penggunaan yang
dimaksud (ISO 2008).
Validasi metode bermanfaat untuk
mengevaluasi unjuk kerja suatu metode
analisis, menjamin prosedur analisis yang
akurat, menekan sekecil-kecilnya resiko
penyimpangan yang timbul, dan menjamin
kedapatulangan yang tepat. Suatu metode
analisis dikatakan absah jika telah memenuhi
syarat keberterimaan parameter validasi.
Parameter yang dimaksud yaitu presisi dan
akurasi.
Metode yang telah divalidasi eksternal
seperti Association Official of Analytical
Chemistry (AOAC) harus memenuhi
persyaratan presisi dan akurasi. Presisi
(keseksamaan) didefinisikan sebagai ukuran
derajat kesesuaian antara hasil individual dari
rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil
dari campuran yang homogen (Harmita
2004). Presisi dapat dilihat dari simpangan
baku (SB) dan simpangan baku relatif (SBR)
yang diperoleh dari pengukuran. Presisi yang
baik akan memberikan nilai median dari
ulangan di antara selang rata-rata ± SB
(Saefuddin et al. 2009) dan SBR kurang dari
2/3 nilai Horwitz (AOAC 2005). Menurut
ISO, akurasi (kecermatan) didefinisikan
sebagai kesesuaian antara hasil analisis
dengan nilai benar atau nilai acuan yang
dapat diterima. Kecermatan dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (recovery)
dari mikrob cemaran yang ditambahkan.
Persen perolehan kembali adalah angka yang
menunjukkan besarnya penambahan standar
yang mampu diidentifikasi kembali dengan
suatu metode. Nilai perolehan kembali
bergantung pada matriks sampel, prosedur
proses sampel, dan konsentrasi cemaran.
Batas penerimaan perolehan kembali menurut
EPA (2005) ialah 48-291%.
Laboratorium IPB Culture Collection
(IPBCC) saat ini sedang dalam proses
persiapan diri untuk akreditasi ISO/IEC
17025:2005. Salah satu persyaratan akreditasi
ialah implementasi metode uji yang sudah
divalidasi sesuai dengan ketentuan pada
ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4 (BSN 2008a).
Metode analisis yang akan divalidasi
diadopsi dari metode standard yang valid.
Untuk akreditasi IPBCC perlu melakukan
validasi metode uji pada ruang lingkup
parameter yang akan diakreditasi. Ruang
lingkup IPBCC yang akan diakreditasi ialah
pupuk hayati dengan parameter cemaran
mikrob nonsimbiotik. Metode standard
sebagai rujukannya ialah metode Standard
Nasional Indonesia (SNI). Metode SNI
banyak merujuk pada buku AOAC. Metode
ini akan digunakan untuk menguji mikrob
pada pupuk hayati karena pupuk tersebut
mengandung berbagai organisme hidup.
Pupuk hayati didefinisikan sebagai
inokulan berbahan aktif organisme hidup
yang berfungsi untuk menambat hara tertentu
atau memfasilitasi tersedianya hara dalam
tanah bagi tanaman, misal pupuk hayati
Rhiphosan mengandung bakteri Bradyrhizobium japonicum perangsang bintil akar
dan Aeromonas punctata untuk pelarutan
fosfat. Ketersediaan hara ini dapat
berlangsung melalui peningkatan akses
tanaman terhadap hara misalnya oleh
cendawan mikoriza arbuskuler, pelarutan
oleh mikrob pelarut fosfat, maupun
perombakan oleh aktinomiset (Simanungkalit
et al. 2006). Pupuk hayati semacam itu harus
diuji bebas cemaran yaitu mikrob lain selain
mikrob komposisi pada pupuk. Mikrob lain
yang
tumbuh
dapat
mengganggu
pertumbuhan mikrob komposisi. Hal ini
dapat menurunkan efektivitas pupuk hayati.
Dalam pengujian cemaran mikrob
digunakan mikrob indikator, karena selain
mudah dideteksi juga dapat memberikan
gambaran tentang kondisi higienis dari
produk yang diuji (BPOM RI 2008). Mikrob
indikator adalah golongan atau spesies
bakteri yang kehadirannya dalam jumlah di
atas batas (limit) tertentu, merupakan
pertanda bahwa bahan telah terpapar dengan
kondisi-kondisi
yang
memungkinkan
berkembangbiaknya mikrob patogen (BPOM
RI 2008). Mikrob indikator digunakan untuk
menilai keamanan dan mutu mikrobiologi
bahan (BPOM RI 2008).
2
Pada saat ini metode standard uji
analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati
belum tersedia. Oleh sebab itu, metode
standard untuk keperluan ini harus divalidasi.
Metode yang divalidasi ialah metode yang
telah valid akan tetapi diterapkan pada
sampel yang berbeda. Metode yang akan
divalidasi pada penelitian ini termasuk ke
dalam kategori metode baku yang digunakan
di luar lingkup yang dimaksud. Metode
analisis mikrobiologi dihitung secara
kuantitatif dengan metode angka lempeng
total (ALT). Angka lempeng total
dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah
mikrob yang terdapat dalam suatu produk
dengan cara menghitung koloni bakteri yang
ditumbuhkan pada media agar (BSN 2008b).
Validasi metode uji cemaran mikrob
sedikit berbeda dengan validasi metode uji
kimia. Dalam cemaran mikrob sebagai CRMnya digunakan makhluk hidup yang dikenal
sebagai kultur murni bakteri. Metode rujukan
yang digunakan dalam penelitian ini ialah
metode SNI 2332.9:2011 untuk menguji
keberadaan S. aureus (BSN 2011). Produk
makanan diganti dengan sampel pupuk
hayati.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan memvalidasi
metode
standard
pengujian
dengan
mengevaluasi kinerja metode, meliputi presisi
dan akurasi sebagai pembuktian kinerja
metode uji cemaran mikrob Staphylococcus
aureus pada pupuk hayati.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Maret 2011 sampai bulan September 2011 di
Laboratorium Analis Uji IPBCC, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam
penelitian
ini
ialah
pupuk
hayati
(Rhiphosant),
dan
mikrob
rujukan
Staphylococcus aureus IPBCC 5.11.666
(ATCC 6538) yang merupakan Certified
Reference Material (CRM). Baird Parker
Agar (BPA) dan Butterields Phosphate
Buffered (BPB) (Lampiran 1). Alat-alat
laboratorium yang digunakan ialah laminar,
autoklaf, inkubator, neraca analitik, pipet
mikro, cawan petri, tabung reaksi,
Erlenmeyer, serta peralatan umum yang
digunakan di laboratorium.
Metode
Persiapan Kultur Kerja. Kultur
stok dari CRM dibiakkan kembali dan
dijadikan kultur kerja. Kultur kerja S. aureus
dibuat dengan cara menggoreskan satu lup
biakan pada media NA cawan dan biakan
diinkubasi pada kondisi ruang selama 48 jam.
S. aureus yang telah tumbuh pada media NA
digores ke media selektif BPA untuk
pembanding.
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk
Hayati. Sebanyak 10 gram pupuk hayati
tanpa sterilisasi dicampur dalam 90 mL BPB
dan
dihomogenkan
di
atas
mesin
penggoyang. Sebanyak 0,1 mL disebarkan
pada media BPA.
Pembuatan Cemaran (Spike) dari
CRM. Suspensi cemaran S. aureus dibuat
dengan cara sebanyak 2 lup biakan
dimasukkan ke dalam 100 mL BPB dalam
Erlenmeyer ukuran 1L. Bakteri yang berada
dalam media cair tersebut diinkubasi selama
24 jam pada suhu ± 35 ˚C. Setelah masa
inkubasi berakhir, sebanyak 0,1 mL suspensi
biakan disebar pada media BPA dan
diinkubasi pada suhu ± 35 ˚C. konsentrasi
bakteri dihitung dengan metode ALT. Setelah
dianalisis, spike tersebut disimpan di lemari
pendingin 10 ˚C untuk dipergunakan sebagai
sumber cemaran.
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk
Hayati. Sampel yang dianalisis terbagi dalam
2 kelompok perlakuan yaitu pupuk hayati
yang diberi cemaran (sampel positif) dan
pupuk hayati tanpa cemaran (sampel negatif).
Sampel positif merupakan matriks
yang membawa cemaran pada konsentrasi
yang diketahui. Sebanyak 10 mL spike S.
aureus (dengan konsentrasi terstandard)
ditambahkan ke dalam masing-masing 10 g
sampel pupuk hayati. Kemudian ke dalam
campuran tadi ditambahkan media BPB
sehingga volume campuran mencapai 100
mL. Kemudian campuran didiamkan selama
2 menit dan dihomogenkan di atas mesin
penggoyang. Konsentrasi cemaran yang ada
pada sampel dihitung secara kuantitatif
dengan metode ALT cawan sebar pada media
BPA. Sebelum dianalisis, suspensi sampel
3
dihomogenkan
kemudian
dicawankan.
Sebanyak 0,1 mL disebarkan pada media
BPA. Biakan S. aureus diinkubasi pada suhu
± 35˚C selama 2-3 hari. Jumlah koloni yang
tumbuh pada cawan dihitung dan dinyatakan
dalam colony formy unit (cfu) mL-1.
Pengenceran dengan kerapatan koloni 25-250
koloni/cawan (BSN 2008b) digunakan dalam
perhitungan presisi dan akurasi.
Prosedur yang sama dilakukan untuk
sampel negatif yaitu sampel tanpa cemaran.
Sampel tanpa cemaran adalah pupuk hayati
yang disterilisasi. Sterilisasi dilakukan untuk
lebih meyakinkan bahwa pupuk tersebut
bebas dari cemaran yang akan diujikan.
Sterilisasi pupuk juga dilakukan agar tidak
ada mikrob lain yang tumbuh sehingga
menghambat pertumbuhan cemaran di dalam
pupuk. Masing-masing perlakuan minimal
diulang sebanyak tujuh kali.
Pengolahan Data. Data diolah untuk
mendapatkan nilai presisi dan akurasi. Presisi
ditetapkan berdasarkan simpangan baku (SB)
dan simpangan baku relatif (SBR) (Saefuddin
et al. 2009) dari ulangan. SB dan SBR
dihitung dengan rumus berikut :
C: cemaran tanpa sampel (kontrol
positif)
Tingkat
akurasi
metode
ditetapkan
berdasarkan perbandingannya terhadap nilai
perolehan kembali yang ditetapkan oleh EPA
(2005).
Uji komparatif dilakukan untuk
membuktikan kekuatan dari metode uji
melalui uji beda nyata antara sampel positif
dan kontrol positif. Uji komparatif dilakukan
dengan uji T dengan menghitung nilai P
menggunakan software Minitab 14.
HASIL
Kultur Kerja
Kultur CRM S. aureus tumbuh pada
media BPA dengan ciri koloni berwarna abuabu hingga kehitaman dan sekeliling tepi
koloni bening (terbentuk halo). Koloni
berbentuk bundar, cembung, licin/halus
dengan tepian rata, tumbuh setelah 48 jam
inkubasi di media BPA (Gambar 1).
a
b
SB =
SBR = SB/χ
SB
SBR
: simpangan baku
: simpangan baku relatif
(koefisien keragaman)
x
: rata-rata dari ulangan
n
: ulangan
x1, x2,....xn : nilai konsentrasi ke-1.... n
Jika SBR kurang dari 2/3 nilai Horwitz
(AOAC 2005) maka metode dapat diterima.
Nilai Horwitz dihitung dengan persamaan
berikut:
Nilai Horwitz = 2(1-0,5log Y)
Y: rata-rata konsentrasi cemaran
(kontrol positif)
Akurasi diukur dengan persentase
perolehan kembali melalui uji komparatif.
Persentase perolehan kembali adalah
banyaknya cemaran yang dapat diisolasi
kembali dari sejumlah cemaran yang
dimasukkan ke dalam sampel. Persen
perolehan kembali (recovery) dihitung
dengan rumus berikut:
% recovery (R) = [(A-B)/C] × 100
A: sampel dengan cemaran (sampel
positif)
B: sampel tanpa cemaran (sampel
negatif)
Gambar 1 Pertumbuhan Certified Reference
Material (CRM) S. aureus pada
media BPA (a) S. aureus dari media
NA (b) koloni tunggal S. aureus
setelah diencerkan.
Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati
Hasil analisis awal pupuk hayati
mengandung bakteri pada media selektif BPA
(Gambar 2). Bakteri yang tumbuh berwarna
hitam akan tetapi tidak memiliki zona bening
setelah diinkubasi selama 2-3 hari. Analisis
ini dibandingkan terhadap CRM-nya yang
menunjukkan bahwa pupuk hayati yang
digunakan dinyatakan bebas dari S. aureus.
Gambar 2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat
pada pupuk hayati di media BPA.
4
ulangan ke-3 (385) dan ke-4 (400). Pada
Cemaran (Spike) dari CRM
sampel positif terdapat dua data yang berbeda
Konsentrasi sumber inokulum S.
nyata dengan uji T yaitu pada ulangan ke-2
aureus sebagai spike kontrol positif yang
dan ke-3 (650).
tumbuh pada media BPA sebesar
315
cfu.mL-1 (Gambar 3) (Tabel 1).
Tabel 1 Presisi uji cemaran S. aureus
Ulangan
1
2
3
4
5
6
7
Rata-rata
SB
Median
Batas atas
Batas bawah
SBR
2/3 nilai Horwitz
Jumlah sel S. aureus (cfu mL-1)
KPa
SPb
260
600
355
650 d
650 d
385d
d
400
400
265
450
285
600
255
450
315,00
542,86
62,92
105,79
285,00
600,00
377,92
648,64
252,08
437,07
0,20
0,19
0,84
0,78
SNc
0
0
0
0
0
0
0
0
-
Keterangan: a: Jumlah sel yang tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 10x ; b: Jumlah sel yang
tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 100x; c: Jumlah sel yang tumbuh dari
pupuk hayati yang disterilisasi; d: berbeda nyata dengan uji T pada taraf α= 0,05.
PEMBAHASAN
Gambar 3 Hasil uji kontrol positif S. aureus
pada pupuk hayati di media BPA.
Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati
Konsentrasi S. aureus dari spike yang
ditambahkan ke dalam pupuk hayati sebagai
sampel positif yang tumbuh pada media BPA
sebesar 543 cfu.mL-1 (Tabel 1). Nilai SB dan
SBR metode uji berturut-turut sebesar 62,92
dan 0,20 pada kontrol positif serta 105,79 dan
0,19 pada sampel positif (Tabel 1).
Data perolehan kembali cemaran S.
aureus dan nilai P (software Minitab 14)
berturut-turut yaitu sebesar 172,34 % dan P=
0,002. Nilai persen perolehan kembali
menunjukkan bahwa metode S. aureus
memiliki akurasi tinggi karena memenuhi
batas penerimaan EPA (2005) yaitu 48291%.
Nilai
P
yang
diperoleh
menggambarkan penyimpangan kesalahan
data (standard eror) yang fungsinya sama
dengan α.
Dari ketujuh data kontrol positif pada
S. aureus yang diperoleh terdapat dua data
yang berbeda nyata dengan uji T yaitu pada
Pupuk hayati yang beredar di pasaran
sangat
beragam
diantaranya
yaitu
Rhiphosant. Pupuk Rhiphosant mengandung
bakteri
Bradyrhizobium
japonicum
perangsang pembentukan bintil akar dan
Aeromonas punctata untuk pelarutan fosfat.
Sebelum dipasarkan pupuk hayati
harus melewati uji efektivitas dan uji
mikrobiologi cemaran. Bakteri adalah jenisjenis kontaminan biologi. akteri S. aureus
merupakan salah satu jenis bakteri yang
umum ditemukan di tanah. Pupuk hayati
yang dianalisis tidak mengandung S. aureus
sehingga bakteri ini digunakan sebagai
pencemar (spike). Menteri Pertanian RI
(2009) menetapkan persyaratan teknis
cemaran pupuk hayati untuk kontaminan
Escherichia coli dan Salmonella sp. minimal
nol pada pengenceran 10-3. Pada penelitian
ini cemaran S. aureus pada pupuk hayati
sebesar kurang dari 10 pada pengenceran
10-2. Dengan demikian pada pengenceran 10-3
diduga tidak dijumpai lagi cemaran S. aureus.
Spike adalah cemaran sebagai kontrol
positif yang telah diketahui dengan pasti
jumlah koloni/ml. Cemaran S. aureus dipilih
menjadi bakteri pencemar karena bakteri ini
dapat diisolasi dari tanah rhizospher pada
gandum. Bakteri ini dapat dimanfaatkan
5
sebagai mikrob pendegradasi anilin di tanah
(Ahmed 2010).
Dari kontrol positif diketahui bahwa
mikrob cemaran yang ditambahkan ke dalam
pupuk sebesar 315 cfu/mL. Konsentrasi ini
tidak menunjukkan jumlah yang sama
dengan konsentrasi sumber cemaran yang
ditambahkan pada sampel positif. Hal ini
mengindikasikan bahwa spike konsentrasi
cemaran pada saat diuji sukar dijaga untuk
tetap konstan jumlah selnya. Meskipun spike
yang sudah ditetapkan konsentrasinya
disimpan dalam lemari pendingin 10˚C. Pada
penelitian ini, dilakukan 7 kali ulangan dan
lebih besar dari jumlah ulangan yang
dianjurkan oleh Harmita (2004) yaitu paling
sedikit 6 kali. Keterulangan digunakan untuk
meningkatkan ketelitian percobaan dan
mengendalikan ragam galat. Untuk bahan
yang sudah terdeskripsi secara jelas seperti
pupuk buatan maka diperlukan ulangan yang
kecil.
Metode analisis cemaran S. aureus
pada pupuk hayati memperlihatkan nilai
simpangan baku relatif yang telah memenuhi
kriteria yang ditetapkan oleh AOAC (2005)
untuk dapat disebut sebagai metode yang
menghasilkan ketelitian cukup baik, yaitu
dengan nilai SBR (0,20 dan 0,19) < 2/3
Horwitz (0,84 dan 0,78) (Tabel 1).
Presisi merupakan kedekatan di antara
beberapa individu hasil pengujian oleh analis
yang sama pada kondisi sama dan dalam
interval waktu yang pendek (intraday)
(Harmita 2004). Presisi untuk uji cemaran
mikrob diukur dengan melihat kandungan
cemaran yang ada dalam sampel, membuat
cemaran dan memberi cemaran pada sampel.
Setelah uji presisi maka dapat
dilanjutkan dengan uji akurasi. Metode
analisis S. aureus memberikan persen
perolehan kembali sebesar 172,34 %.
Artinya, metode ALT yang digunakan untuk
menghitung jumlah sel S. aureus dalam
kontrol positif dan sampel positif dapat
menunjukkan jumlah sel S. aureus dengan
ketepatan rata-rata sebesar 172,34 % dari
jumlah sel terhitung pada kultur awal.
Berdasarkan nilai perolehan kembali
ketetapan EPA (2005) yaitu 48-291% maka
metode analisis S. aureus telah memenuhi
batas penerimaan EPA. Hal ini dapat
dikatakan bahwa metode analisis cemaran S.
aureus pada pupuk hayati dapat diterapkan di
laboratorium
IPBCC
berdasarkan
keakuratannya. Menurut Harmita (2004)
akurasi sangat tergantung pada sebaran galat
sistematik di dalam keseluruhan tahap
analisis. Oleh karena itu untuk mencapai
kecermatan yang tinggi hanya dapat
dilakukan dengan cara mengurangi galat
sistematik tersebut seperti menggunakan
peralatan
yang
telah
dikalibrasi,
menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik,
pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang
cermat, taat asas sesuai prosedur. Pada
penelitian
ini
metode
pengambilan
homogenasi dengan pipet mikro terganggu
oleh partikel pupuk yang menggunakan
bahan pembawa gambut yang tidak larut,
sehingga mengganggu kecermatan.
Berdasarkan uji T diketahui bahwa
dari ketujuh data sampel positif S. aureus
yang diperoleh, terdapat dua data yang
berbeda nyata dengan uji T pada taraf α =
0,05, yaitu pada ulangan ke-2 dan ke-3 yaitu
650 cfu mL-1. Hasil yang berbeda nyata ini
menunjukkan bahwa metode ALT yang
digunakan untuk menghitung sel S. aureus
pada pupuk hayati memiliki keragaman data
pada taraf α = 0,05.
Analisis beda nyata yang dilakukan
menunjukkan bahwa nilai P pada data hasil
analisis S. aureus sebesar 0,002. Nilai P yang
diperoleh menunjukkan bahwa ketujuh data
analisis yang didapat berbeda nyata pada
taraf α sebesar 0,05. Keragaman data yang
dimaksud adalah selisih jumlah sel pada
ulangan yang satu dengan ulangan yang
lainnya. Nilai simpangan baku (SB) yang
diperoleh akan menunjukkan keragaman data
yang diperoleh. Nilai SB juga akan
membentuk selang data. Selang data yang
terdiri atas batas bawah dan batas atas akan
menentukan data-data yang berbeda nyata
pada taraf α = 0,05.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Validasi
metode
analisis
Staphylococcus aureus pada pupuk hayati
dengan menggunakan SNI 2332.9:2011 yaitu
Cara Uji Mikrobiologi-Bagian 9: Penentuan
Staphylococcus
aureus
pada
produk
perikanan dapat memenuhi kriteria presisi
dan akurasi yang memenuhi kriteria sebagai
metode uji sampel pupuk hayati. Metode ini
dapat diterapkan sebagai metode standard uji
di laboratorium IPB Culture Collection.
Saran
Penyimpanan spike pada kondisi
lingkunngan yang baik perlu dicari agar
jumlah mikrob dalam spike relatif konstan.
Uji ketertiruan untuk parameter ketelitian
6
perlu dilakukan agar dapat diketahui
pengaruh dari kerja analis, kondisi instrumen
dan waktu analisis yang berbeda dalam
laboratorium yang sama maupun berbeda
terhadap hasil akhir. Perlu juga dilakukan
pembuatan formulasi pupuk dengan cemaran
terlebih dahulu sebelum dianalisis.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed S et al. 2010. Isolation and
characterization of a bacteria strain
for aniline degradation. Afr J
Biotechnol 9:1173-1179.
[AOAC] Association Official of Analytical
Chemistry. 2005. Official Method of
Analysis. Washington DC: AOAC.
[BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia. 2008.
Pengujian mikrobiologi pangan.
Jakarta: Badan POM RI.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008a.
Pelatihan Audit Internal Sistim
Manajemen Mutu Laboratorium.
Jakarta: BSN.
[BSN] Badan Standar Nasional. 2008b.
Metode pengujian cemaran mikrob
dalam daging, telur dan susu, serta
hasil olahannya. Jakarta: BSN;
(Standard
Nasional
Indonesia
2897:2008).
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2011.
Cara uji mikrobiologi - bagian 9:
penentuan Staphylococcus aureus
pada produk perikanan. Jakarta:
BSN; (Standard Nasional Indonesia
2332.9:2011).
[EPA] Environmental Protection Agency.
2005. Manual for the Certification
of Laboratories Analyzing Drinking
Water: Criteria and Procedurer
Quality Assurance. Edke-5. Ohio:
US International Protection Agency
Office of Water.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya.
Majal Ilm Kefarm 1:117-135.
[ISO]
International
Organization
for
Standardization. 2008. Persyaratan
umum kompetensi laboratorium
pengujian
dan
laboratorium
kalibrasi. Jakarta: ISO; (SNI
ISO/IEC
17025:2008
(klausul
5.4.5.1 dan 5.4.5.2).
Menteri Pertanian Republik Indonesia. 2009.
Peraturan
Menteri
Pertanian
28/Permentan/SR.130/5:2009
Tentang Pupuk Organik, Pupuk
Hayati dan Pembenah Tanah.
Jakarta: Menteri Pertanian RI.
Saefuddin A, Notodiputro KH, Alamudi A,
Sadik K. 2009. Statistika Dasar.
Jakarta: PT Grasindo.
Simanungkalit RDM, Suriadikarta DA,
Saraswati R, Setyorini D, Hartatik
W. 2006. Pupuk Organik dan Pupuk
Bogor:
Balai
Besar
Hayati.
Penelitian
dan
Pengembangan.
LAMPIRAN
8
Lampiran 1 Pembuatan Pereaksi Media BPA dan BPB
1. Larutan media baird parker agar (BPA) menurut SNI 2332.9:2011
BPA sintetik
60 g
Aquades
1L
Egg Yolk
50 mL
Larutan BPA dan aquades tersebut dididihkan. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama
15 menit. Media didinginkan hingga suhu 45 ˚C kemudian ditambahkan egg yolk.
2. Larutan butterfield’s phosphate buffered (BPB) menurut SNI 2332.9:2011
Larutan stok
34 g
KH2PO4
Aquades
500 mL
pH larutan diatur 7,2 dengan menggunakan 1 N NaOH. Volume larutan ditepatkan hingga
1000 mL dengan penambahan aquades. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15
menit. Larutan stok disimpan dalam refrigerator. Cara membuat larutan kerja yaitu sebanyak
10 mL larutan stok diambil dan ditepatkan hingga 1000 mL dengan penambahan aqudes.
Kemudia larutan disterilisasi pada suhu 121 ˚C selama 15 menit.