OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI

Persentase recovery Survival Rate Tanaman Transgenik Mengandung Ekstra Salinan Gen OsHox6 Sebanyak sepuluh galur, masing-masing 4 galur Ciherang CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197 dan 6 galur IR64 I.33, I.19, I.23, I.29, I.31, dan I.40 diseleksi di media mengandung higromisin 50 mgL -1 sebelum dievaluasi tingkat toleransinya terhadap kekeringan. Semua tanaman kontrol yang tidak ditransformasi tidak ada yang bertahan hidup setelah di kultur selama 2 minggu pada media yang mengandung higromisin 50 mgL -1 , sebaliknya tanaman kontrol positif mengandung dan mengekpresikan hpt tumbuh normal data tidak ditampilkan. Setelah dua minggu ditumbuhkan dimedia seleksi semua tanaman Ciherang yang berdasarkan PCR bersegregasi 3:1 tumbuh terhambat dan kemudian mati. Sebaliknya sebahagian besar tanaman T 1 IR64 tumbuh subur pada media mengandung higromisin 50 mgL -1 Evaluasi tingkat toleransi tanaman transgenik terhadap kekeringan dilakukan dengan tidak menyiram tanaman selama 14 hari. Pada hari ke-14 semua daun tanaman sudah menggulung dan layu akibat kekeringan. Kadar air tanah pada hari ke-14 adalah 9,07 ± 1,96 ∼23 dari kapasitas lapang. Kadar air tanah kapasitas lapang adalah 39,28 ± 6,57 . Setelah disiram kembali sebahagian tanaman segar kembali Gambar 18. . Tanaman toleran higromisin ini kemudian dipindahkan ke dalam pot dan ditumbuhkan selama 2 minggu untuk pemulihan sebelum selanjutnya diuji kekeringan. Tingkat toleran kekeringan dari masing-masing galur dihitung berdasarkan tingkat recovery survival rate tanaman padi umur 5 minggu yang dikeringkan selama 14 hari di rumah kaca, kemudian disiram kembali selama 4 hari sebelum pengamatan. Empat galur, yaitu IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33 menunjukkan tingkat kelangsungan hidup survival rate yang lebih tinggi dibandingkan dengan tipe liarnya Tabel 12, mengindikasikan bahwa OsHox6 meningkatkan toleransi tanaman padi terhadap cekaman kekeringan. Galur I.19 dan I.23 menunjukkan tingkat recovery paling tinggi 87,5 dilanjutkan oleh galur, I.40, dan I.33 masing-masing dengan recovery 83,3 dan 62,5. Dua galur, yaitu I.31 dan I.29, menunjukkan tingkat recovery yang lebih rendah masing-masing 12,5 dan 0 dari kontrol IR64 yang tidak ditransformasi 41,7. Gambar 18 Recovery tanaman transgenik galur IR64 tahan higromisin mengandung 1 salinan gen hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Tanaman ditumbuhkan selama 2 minggu pada kondisi normal, kemudian tidak disiram selama 14 hari dan dikembalikan pada kondisi normal selama 4 hari sebelum pengambilan foto. Tabel 12 Tingkat recovery tanaman transgenik pada kondisi kekeringan Galur Jumlah tanaman hidup Total tanaman yang diuji Tingkat recovery hidup IR64 tipe liar 10 24 41,7 I.19 21 24 87,5 I.23 21 24 87,5 I.29 24 I.31 3 24 12,5 I.33 15 24 62, 5 I.40 20 24 83,3 Tanaman padi transgenik umur 4 minggu yang dikeringkan selama 14 hari di rumah kaca, kemudian disiram kembali dan ditumbuhkan pada kondisi normal selama 4 hari. Jumlah tanaman hidup dibagi total tanaman yang diuji x 100 Pertumbuhan Tanaman Transgenik Secara umum pertumbuhan tanaman transgenik hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda nyata dengan tanaman padi yang tidak ditransformasi dan fertil. Pengamatan terhadap tinggi tanaman, pada kondisi normal, menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara galur tanaman transgenik dengan tanaman pembanding yang tidak ditransformasi Gambar 19. Seperti halnya tanaman pada umumnya, kondisi kekurangan air menyebabkan tanaman transgenik menjadi lebih pendek. Gambar 19 Tinggi tanaman beberapa galur toleran kekeringan. Data merupakan rataan dari 10 tanaman. Pengamatan dilakukan 1 minggu setelah disiram kembali. Pengamantan meliputi pada tanaman kontrol yang disiram N dan tanaman yang diberi perlakuan kekeringan K. Pembahasan Untuk mempelajari fungsi gen OsHox6 pada tanaman padi, dilakukan overekspresi gen OsHox6 pada dua varietas tanaman padi, yaitu IR64 dan Ciherang. IR64 dan Ciherang adalah dua varietas padi sawah irigasi yang tidak toleran kekeringan. Padi IR64 dan Ciherang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Pengamatan pada generasi awal T menunjukkan fenotipe tanaman transgenik hasil transformasi dengan OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3 tidak berbeda nyata dengan fenotipe tanaman kontrol yang tidak ditransformasi dan fertil. Analisis molekuler berdasarkan PCR pada populasi tanaman T dan T 1 padi Ciherang dan IR64 hasil transformasi dengan gen OsHox6 menunjukkan bahwa transgen diwariskan ke generasi T 1 Karena tanaman yang akan digunakan dalam percobaan kekeringan ini adalah tanaman dari generasi bersegregasi atau belum homozigot stabil maka tanaman terlebih dahulu diseleksi pada media mengandung higromisin 50mgL IR64 dan Ciherang mengikuti segregasi 3:1 Tabel 11. -1 Hasil evaluasi tingkat toleransi keenam galur IR64 transgenik terhadap kekeringan menunjukkan tingkat toleransi yang bervariasi. Empat galur, yaitu I.23, I.40, I.19, dan I.33, menunjukkan tingkat toleransi yang lebih tinggi dari kontrol tipe liarnya berdasarkan pengamatan terhadap tingkat kelangsungan hidup survival rate pada fase vegetatif Tabel 12. Sementara pada dua galur lainnya, yaitu I.31 dan I.29, lebih rendah dibandingkan dengan kontrol IR64 yang tidak ditransformasi. Hal ini diduga berhubungan dengan ekspresi gen OsHox6, sehingga analisis ekspresi gen dari masing-masing galur akan dilakukan untuk melihat korelasi antara peningkatan ekspresi gen OsHox6 dengan tingkat kelangsungan hidup tanaman transgenik. Ekspresi transgen pada tanaman transgenik dipengaruhi oleh jumlah salinan gen Rai et al. 2007, posisi integrasi transgen position-effect di dalam genom Bhattachryya et al. 1994 dan integritas transgen Kohli et al. 2003. Meningkatnya toleransi beberapa galur IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33 hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang . Namun, hanya tanaman transgenik IR64 yang hidup di media seleksi mengandung higromisin. Diduga pada tanaman Ciherang transgenik terjadi mekanisme pembungkaman gen seperti yang pernah dilaporkan sebelumnya Li et al. 2002; Lin Zhang 2005. Oleh karena itu, untuk evaluasi tingkat toleransi tanaman padi transgenik terhadap kekeringan maka pengamatan difokuskan pada ke-6 galur padi IR64 yaitu I.33, I.19, I.23, I.29, I.31, dan I.40 yang mengandung ekstra salinan gen OsHox6 berdasarkan hasil analisis Southern. dikendalikan promoter OsLEA3 mengindikasikan bahwa gen OsHox6 bertanggungjawab dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Penelitian ini menunjukkan bahwa transformasi gen OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3 pada tanaman padi IR64 tidak mempengaruhi pertumbuhan vegetatif tanaman tinggi tanaman. Hal ini mungkin karena penggunaan promoter terinduksi kekeringan. Promoter OsLEA3 dilaporkan menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekeringan, sedangkan pada kondisi normal ekspresinya rendah Xiao Xue 2001; Xiao et al. 2007. Penggunaan promoter konstitutif seperti promoter 35S dilaporkan menyebabkan tanaman menjadi tumbuh kerdil dan steril Jaglo-Ottosen et al. 1998; Kasuga et al. 1999; Pino et al. 2007; Purwantomo 2007. Simpulan Empat galur tanaman padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 lebih toleran terhadap kekeringan pada fase vegetatif. Meningkatnya persentase recovery tanaman padi transgenik hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 mengindikasikan bahwa OsHox6 berperan dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Tinggi tanaman padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya.

VI. PEMBAHASAN UMUM

Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetika Alternatif Transformasi genetika merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman dan untuk analisis fungsi gen. Diantara berbagai teknik transformasi genetika yang telah dikembangkan saat ini, teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan. Keunggulan teknik transformasi genetika menggunakan bantuan Agrobacterium adalah tidak diperlukan peralatan yang canggih dan kemungkinan untuk mendapatkan tanaman transgenik dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dibandingkan dengan teknik transformasi genetika lain. Namun, teknik transformasi Agrobacterium telah dipatenkan sehingga menghambat pemanfaatannya untuk pengembangan pertanian terutama untuk negara berkembang. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetika memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T-DNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi, meskipun efisiensi transformasinya rendah. Broothaerts et al. 2005 dan Wendt et al. 2010 menggunakan bakteri pembentuk bintil akar Rhizobia dalam transformasi genetika beberapa tanaman termasuk padi, tembakau, Arabidopsis, dan kentang. Evaluasi efisiensi bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens perlu dilakukan sebagai langkah awal dalam pengembangan transformasi genetika tanaman menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Untuk tujuan tersebut Rhizobium leguminosarum ANU845 dibandingkan dengan Agrobacterium tumefaciens LBA288 Hasil evaluasi terhadap efektifitas R. leguminosarum dalam mentransfer gen ke dalam tiga genotipe padi menunjukkan R. leguminosarum ANU845 yang telah direkayasa mampu mentransfer gen dengan efektifitas sama dengan A. tumefaciens LBA288. Berdasarkan efisiensi regenerasi dan transformasi, ekspresi gen gus dan hpt, jumlah salinan gen target, pola pewarisan gen, serta pertumbuhan dan fertilitas tanaman tanaman hasil transformasi dengan kedua sistim transformasi Tabel 13, R. leguminosarum efektif dalam melakukan transfer gen. Oleh karena itu bakteri Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman padi. Aspek penting lain yang juga perlu dilihat adalah kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA. Penyisipan daerah tulangpunggung plasmid di luar T- DNA ini tidak diinginkan, terutama jika disertai dengan penyisipan gen penyandi antibiotik misalnya, ampisilin, tetrasiklin yang tidak diperbolehkan ada di dalam tanaman transgenik, sehingga dapat menimbulkan masalah dalam pelepasan EFSA 2004. Kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA pada transformasi menggunakan Agrobacterium adalah 20-30 Martineau et al. 1994 , sedangkan Rhizobium belum diketahui. Keberhasilan transformasi menggunakan bakteri Rhizobia sangat tergantung pada genotipe tanaman serta species atau strain bakteri yang digunakan Broothearts et al. 2005, Wendt et al. 2010. Selain itu, bahan tanaman eksplan yang digunakan sangat berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi. Beberapa protokol transformasi Agrobacterium yang sesuai untuk genotipe tanaman padi tertentu telah dikembangkan Hiei komari 2008. Protokol ini mungkin dapat diaplikasikan pada transformasi genetika padi menggunakan Rhizobium atau bakteri selain Agrobacterium agar diperoleh efisiensi transformasi yang lebih tinggi. Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman. Agar teknik transformasi genetika menggunakan perantara Rhizobium dapat digunakan lebih luas di masa mendatang maka tersedianya plasmid yang lebih kecil dan mudah dimanipulasi secara in vitro diperlukan. pCAMBIA 5106 adalah plasmid cointegratif yang memiliki ukuran yang besar ∼42 Kb dan situs restriksi unik yang diperlukan untuk proses kloning gen sangat terbatas. Oleh karena itu, meskipun pCAMBIA 5106 masih dapat digunakan, penggunaan plasmid yang lebih mudah dimanipulasi secara invitro plasmid biner akan lebih bermanfaat. Tabel 13 Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A. tumefaciens dengan R. leguminosarum Parameter Agen transformasi

A. tumefaciens R.leguminosarum

Efisiensi regenerasi 4,85 – 37,21 5,84 – 59,38 Efisiensi transformasi 1,14 – 3,41 2,05 – 12,05 Jumlah tanaman mengekspresikan gen hpt 80 60 Rata-rata jumlah salinan gen 1,35 1.20 Pola segregasi gen Mendel Mendel Fenotipe Normal, fertil Normal, fertil Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Peranan Gen OsHox6 Untuk mempelajari fungsi gen OsHox6 diperlukan tanaman transgenik yang ekspresi gen OsHox6-nya diubah dari kondisi normalnya, yaitu dengan meningkatkan ekspresi overekspresi dan menghilangkan ekspresi knockout OsHox6. Untuk meningkatkan expresi gen OsHox6, tanaman padi ditransformasi menggunakan plasmid mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Hasil transformasi tanaman padi diperoleh 6 galur tanaman padi varietas IR64 transgenik yang mengandung satu salinan gen tunggal dan bersegregasi 3:1 berdasarkan PCR hpt. Namun, konfirmasi lebih lanjut mengenai level ekspresi gen OsHox6 pada tanaman transgenik masih perlu dilakukan. Tanaman transgenik OsHox6 yang diharapkan mengoverekspresikan OsHox6 ini selanjutnya digunakan untuk analisis selanjutnya. Sebaliknya, tanaman yang tidak mengekspresikan OsHox6 belum diperoleh sehingga data atau informasi mengenai pengaruh peniadaan ekspresi gen OsHox6 tidak dapat dilaporkan. Regulasi gen OsHox6 diprediksi menggunakan analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6, sedangkan analisis pola ekspresi gen OsHox6 dilakukan dengan menggunakan padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor β-glucuronidase. Analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6 menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan dan ABA ditandai oleh adanya cis- acting elemen yang penting untuk respon kekeringan MYB1 dan MYC, ABRE likeERD1, ERD1, dan LTRE dan respon ABA ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2. Keberadaan elemen cis-acting terkait respon kekeringan merupakan salah satu petunjuk awal bahwa aktivitas promoter diregulasi oleh kekeringan, meskipun tidak ada jaminan efektifitas ekspresi gen. Oleh karena itu analisis fungsi dari kandidat promoter perlu dilakukan dengan menggabungkan kandidat promoter dengan suatu gen pelapor dan mengujinya pada kondisi cekaman kekeringan. Hasil analisis ekspresi gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 padi menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan. Ekspresi gen OsHox6, yang disimpulkan dari pola ekspresi fusi promoter OsHox6 dengan gen GUSPlus, menunjukkan aktivitas promoter OsHox6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan. Ekspresi GUSPlus diakumulasikan pada jaringan muda yang aktif membelah buku batang, daerah pertemuan antara helaian daun dengan pelepah daun, dan dasar bunga, mengindikasikan bahwa ekspresi gen OsHox6 tinggi pada jaringan meristematis. Pola ekspresi OsHox6 pada batang berbeda dengan organ lainnya. Pada batang ekspresi GUSPlus dapat diamati pada tahap awal dehidrasi, sedangkan pada akar, daun dan bunga ekspresi GUSPlus baru dapat diamati setelah tanaman mengalami kekeringan lebih lanjut 6-7 hari, mengindikasikan adanya kemungkinan mekanisme regulasi gen OsHox6 yang berbeda pada batang dan organ lainnya. Pola ekspresi GUSPlus yang dikendalikan promoter OsHox6 ini mirip dengan ekspresi gen TLD1OsGH3.13 yang terkait dengan keseimbangan hormon pertumbuhan auksin IAA Zhang et al. 2009. Hormon pertumbuhan dilaporkan berinteraksi dengan gen HD-Zip sub-famili I. Deng et al. 2006 melaporkan tanaman yang mengoverekspresikan CpHB-7 HD-Zip I menjadi kurang sensitif terhadap ABA selama perkecambahan. Selanjutnya OsHox4 berfungsi sebagai represor dalam respon giberelin Dai et al. 2008, menyebabkan tanaman menjadi kerdil akibat panjang sel berkurang. Berdasarkan hasil penelitian ini diduga OsHox6 berperan dalam pengaturan pertumbuhan tanaman padi dalam respon terhadap cekaman kekeringan. Interaksi antara hormon pertumbuhan dengan OsHox6 belum diketahui. Penelitian lebih lanjut untuk mempelajari pengaruh hormon terhadap ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 akan dilakukan. Evaluasi awal tingkat toleransi galur padi transgenik OsHox6 terhadap kekeringan mengindikasikan bahwa gen OsHox6 berperan penting dalam mekanisme toleran kekeringan pada tanaman padi. Empat IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33 dari enam galur padi transgenik OsHox6 yang diuji menunjukkan tingkat toleransi yang lebih tinggi dari kontrol tipe liarnya berdasarkan pengamatan terhadap tingkat recovery dari masing-masing galur. Persentase recovery tanaman setelah diberi perlakuan cekaman kekeringan selama 14 hari digunakan sebagai indikator awal tanaman toleran kekeringan. Evaluasi lebih lanjut akan dilakukan pada fase pertumbuhan generatif menggunakan galur stabil homozigot yang mengoverekspresikan OsHox6. Hasil pengamatan terhadap tinggi tanaman padi transgenik hasil transformasi gen OsHox6 yang dikendalikan promoter terinduksi kekeringan menunjukkan tidak ada perbedaan antara tanaman transgenik dengan tanaman kontrol padi tipe liarnya. Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam merespon kekeringan. Identifikasi gen-gen yang ekspresinya berubah pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu menjelaskan peranan gen OsHox6 dalam membantu tanaman padi beradaptasi terhadap cekaman kekeringan. Sejauh ini, berdasarkan fungsi ada 8 kelompok gen yang berperan dalam merespon kekeringan, yaitu protein yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies ROS, protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan Cushman Bohnert 2000. Analisis microarray dapat membantu mengidentifikasi gen yang ekspresinya dipengaruhi oleh ekspresi gen OsHox6. Selanjutnya pengamatan yang lebih mendetil terhadap karakter morfologi ukuran sel, tinggi tanaman, daya hasil, dsb, fisiologi status air daun, konduktan stomata, potensial air daun, fotosintesa, dsb, dan biokimia prolin, gula, asam amino, protein LEA, dsb pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu memperjelas peranan OsHox6 dalam merespon kekeringan. Selanjutnya, informasi dari hasil pengamatan pada tanaman mutan yang ekspresi gen OsHox6 dihambat diperlukan agar kesimpulan mengenai fungsi gen OsHox6 lebih akurat. Akhir-akhir ini pendekatan RNAi RNA interference juga dikenal dengan post-transcriptional gene silencing atau disingkat PTGS umum dilakukan karena sangat efektif dalam menghambat kerja suatu gen Matthew 2004; Small 2007. Pada beberapa gen terutama jika ada dua gen yang memiliki fungsi yang mirip pada tanaman seperti yg terjadi pada gen OsHox4 dengan OsHox20, pendekatan dengan menghilangkan satu fungsi gen sering kurang efektif dan tidak memberikan fenotipe yang jelas berbeda Agalou et al. 2008. Hal ini dapat diatasi dengan menghilangkan fungsi beberapa gen sekaligus yang memiliki fungsi yang mirip atau sama Zhang 2003. 79

VII. SIMPULAN UMUM DAN SARAN

SIMPULAN UMUM R. leguminosarum ANU845 yang telah direkayasa mampu mentransfer gen dengan efektifitas yang sama dengan A. tumefaciens LBA288, sehingga memungkinkan untuk digunakan sebagai agen transformasi alternatif untuk rekayasa genetika tanaman. Seperti halnya terformasi Agrobacterium, maka tingkat keberhasilan transformasi menggunakan Rhizobium dipengaruhi oleh genotipe tanaman yang digunakan Analisis bioinformatik promoter OsHox6 mengindikasikan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan dan ABA. Pola ekspresi gen GUSPlus, menunjukkan aktivitas promoter OsHOx6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan dan aktif pada jaringan meristem. Meskipun skenario utuh mekanisme molekuler toleran kekeringan yang disebabkan oleh OsHox6 masih belum sepenuhnya diketahui, tingkat survival rate pada fase vegetatif mengindikasikan bahwa OsHox6 bertanggung jawab dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi. SARAN Agar transformasi genetik menggunakan Rhizobium dapat lebih luas digunakan pada tanaman maka perlu menggunakan plasmid biner yang lebih kecil dan lebih mudah dimanipulasi secara in vitro. Evaluasi lebih lanjut ketahanan tanaman transgenik stabil homozigot yang mengoverekspresikan OsHox6 pada fase generatif terhadap kekeringan perlu dilakukan. Selanjutnya analisis fenotip tanaman padi yang tidak mengekspresikan gen OsHox6 perlu dilakukan untuk melengkapi data fungsi gen OsHox6 sehingga penjelasan tentang peranan gen OsHox6 pada tanaman padi lebih komprehensif. Identifikasi gen-gen yang ekspresinya berubah pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 membantu untuk menjelaskan mekanisme gen OsHox6 dalam mengendalikan sifat toleran kekeringan. DAFTAR PUSTAKA Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Arabidopsis AtMYC2 bHLH and AtMYB2 MYB function as transcriptional activators in absisic acid signaling. Plant Cell 15:63-78. Agalou A, Purwantomo S, Overnas E, Johannesson A, Zhu X, Estiati A, Kam RJ de, Engstrom P, Slamet-Loedin IH, Zhu Z, Wang M, Xiong L, Meijer AH, Ouwerkerk PBF. 2008. A genome-wide survey of HD-Zip genes in rice and analysis of drought-responsive family members. Plant Mol Biol 66:87-103. Aharoni A, Dixit S, Jetter R, Thoenes E, van Arkel G, Pereira A. 2004. The SHINE Clade of AP2 Domain transcription Factors Activates Wax Biosynthesis, Alters Cuticle Properties, and Confers Drought Tolerance when Overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell 16:2463-2480. Al-Quraini F, Khan S. 2009. Mutagenic effects of sodium azide and its application in crop improvement. World Appl Sci J 6:1589-1601. Ariel FD, Manavella PA, Dezar CA, Chan RL. 2007. The true story of the HD- Zip family. Trends Plant Sci 12:419-426. Ariel FD, Diet A, Crespi M, Chan RL. 2010. The LOB-like transcription factor Mt LBD1 controls Medicago truncatula root architecture under salt stress. Plant Signal Behav 5:1666-1668. Aso K, Kato M, Banks JA, Hasebe M. 1999. Characterization of homeodomain- leucine zipper genes in the fern Ceratopteris richardii and the evolution of the homeodomain-leucine zipper gene family in vascular plants. Mol Biol Evol 16:544-552. [BPS] Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. 2009. Tanaman Pangan – Statistik Indonesia. http:www.bps.go.idtnmn_pgn.php. [9 Desember 2011]. Baker SS, Wilhelm KS, Thomashow MF. 1994. The 5’-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought-, and ABA-regulated gene expression. Plant Mol Biol 24:701-713. Bartels D, Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants. Crit Rev Plant Sci 241:23-58. Bhatnagar-Mathur P, Vadez V, Sharma KK. 2008. Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Rep 27:411-424. Bhattachryya BA, Stermer BA, Dixon RA. 1994. Reduced variation in transgen expression from a binary vector with selectable markers at the right and left T-DNA borders. Plant J 6:957-968. Bohnert HJ, Nelson DF, Jenson RG. 1995. Adaptation to environmental stresses. Plant Cell 7:1099-1111. Boulin T, Etchberger JF, Hobert O, Hughes H. 2006. Reporter gene fusion. http:www.wormbook.orgchapterswww_reportergenefusionsreportergene fusions.pdf. [13 September 2011] Broothaerts W, Mitchell H, Weir B, Kaines S, Smith LMA, Mayer JE, Roa- Rodriguez C, Jefferson RA. 2005. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 433: 629-633. Capell T, Bassie L, Christou P. 2004. Modulation of the polyamine biosynthetic pathway in transgenic rice confers tolerance to drought stress. PNAS 101:9909-9914. Cellier F, Conejero G, Breitler JC, Casse F. 1998. Molecular and physiological response to water deficit in drought toleran and drought sensitive lines of sunflower. Plant Physiol 116:319-328. Chatzidimitriadou K, Nianiou-Obeidat I, Madesis P, Perl-Treves R, Tsaftaris A. 2009. Expression of SOD transgene in pepper confer stress tolerance and improve shoot regeneration. Electr J Biotechnol 124:1-9. Chavez MM, Maroco JP, Pereira JS. 2003. Understanding plant responses to drought-fom genes to the whole plant. Funct Plant Biol 30:239-264. Chen BJ, Wang Y, Hu YL, Wu Q, Lin ZP. 2005. Cloning and characterization of a drought inducible MYB gene from Boea crassifolia. Plant Sci 168:493-500. Chilton MD. 2005. Adding diversity to plant transformation. Nat Biotech 23:309-310. Cho EK, Hong CB. 2006. Overexpression of tobacco NtHSP70-1 contributes to drought stress tolerance in plant. Plant Cell Rep. 25:349-358. Clemente TE, LaVallee BJ, Howe AR, Conner-Ward D, Rozman RJ, Hunter PE, Broyles DL, Kasten DS, Hinchee MA. 2000. Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium- madiated transformation. Crops Sci 40:797-803. Cominelli E, Galbiati M, Tonelli C. 2010. Transcription factors controlling stomatal movements and drought tolerance. Transcription 1:41-45. Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, Conti L, Sala T, Vuylsteke M, Leonhardt N, Dellaporta SL, Tonelli C. 2005. A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance. Curr Biol 15:1196-2000. Cushman JC, Bohnert H. 2000. Genomic approaches to plant stress tolerance. Curr Opin Plant Biol 3:117-124. Dai M, Hu Y, Ma Q, Zhao Y, Zhou DX. 2008. Functional analysis of rice HOMEOBOX4 Oshox4 gene reveals a negative function in gibberellin responses. Plant Mol Biol 66:289-301. Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, Chen S, Beachy RN, Fauquet C. 2001. Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment. Mol Breed 7:25-33. Darley CP, Wuytswinkel OCM van, Woude K van der, MAGER WH, Boer de. 2000. Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae NHX1 genes encode amiloride sensitive electroneutral NauHu exchangers. Biochem J 351:241-249. Deng X, Phillips J, Meijer AH, Salamini F, Bartels D. 2002. Characterization of five novel dehydration-responsive homeodomain leucine zipper genes from the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Mol Biol 49:601- 610. Deng X, Phillips J, Brautigam A, Engstrom P, Johannesson H, Ouwerkerk PBF, Ruberti I, Salinas J, Vera P, Iannacone R, Meijer AH, Bartels D. 2006. A homeodomain leucine zipper gene from Craterostigma plantagineum regulates abscisic acid responsive gene expression and physiological responses. Plant Mol Biol 61:469-489. Deokar AA, Kondawar V, Jain PK, Karuppayil SM, Raju NL, Vadez V, Varsney RK, Srinivasan R. 2011. Comparative analysis of expressed sequence tags ESTs between drought-tolerant and -susceptible genotypes of chickpea under terminal drought stress. BMC Plant Biol 11:70. www. biomedcentral.com1471-22291170 . [13 September 2011] Dezar CA, Gago GM, Gonzalez DH, Chan RL. 2005a. HAHB-4, a sunflower homeobox-leucine zipper gene, confers drought tolerance to Arabidopsis thaliana plants. Transgen Res. 14:429-440. Dezar CA, Fedrigo GV, Chan RL. 2005b. The promoter of the sunflower HD- Zip protein gene Hahb4 directs tissue-specific expression and is inducible by water stress, high salt concentrations and ABA. Plant Sci. 169: 447-456.