AKTIVITAS INFUSA DAUN Piper betle Linn DAN Piper crocatum Ruiz Pav TERHADAP VIABILITAS SEL HeLa Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz Pav on HeLa cell line viability

  

AKTIVITAS INFUSA DAUN Piper betle Linn DAN Piper crocatum Ruiz & Pav

TERHADAP VIABILITAS SEL HeLa

Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz & Pav on HeLa

cell line viability

• * * **
• _* Sari Haryanti , Yuli Widiyastuti , Nita Etikawati

  Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbang _** Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret, Surakarta e-mail: sari.haryanti@gmail.com

  

ABSTRAK

Sirih hijau(Piper betle L.) dan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) merupakan tanaman yang sering

dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia untuk mengobati berbagai macam penyakit, termasuk kanker. Bukti

ilmiah untuk memperkuat dasar penggunaannya sebagai antikanker masih sangat diperlukan. Penelitian ini

dilakukan untuk mengetahui efek infusa daun sirih hijau dan sirih merah terhadap viabilitas sel kanker serviks

HeLa, serta potensinya dalam menghambat ekspresi protein antiapoptosis Bcl2 secara immunositokimia.

Infusa sirih dikeringkan di atas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering. Pengaruh ekstrak terhadap

viabilitas sel HeLa ditetapkan melaluiuji sitotoksik dengan metode MTT assay hingga diperoleh nilai IC .

₅₀ Pengaruh ekstrak aktif terhadap protein Bcl2 dilakukan dengan pengecatan immunositokimia. Uji sitotoksik

infusa sirih hijau memberikan nilai IC 49.14 µg/ml, sedangkan sirih merah tidak menunjukkan efek sitotoksik.

₅₀ Hasil pengecatan immunositokima secara kualitatif memperlihatkan pengurangan ekspresi protein Bcl2.

  

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa sirih hijau mempengaruhi viabilitas sel HeLa dengan menginduksi

kematian sel melalui penghambatan ekspresi protein antiapoptosis Bcl2. Dengan demikian sirih hijau cukup

potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif untuk kanker serviks.

  Kata kunci: Piper betle, Piper crocatum, sitotoksik, sel HeLa

ABSTRACT

  

Piper betle L. (betel leaves) and red betel (Piper crocatum Ruiz & Pav) are medicinal plant that are often used

by the Indonesian people to treat various diseases, including cancer. Scientific evidence to strengthen then use

as anticancer is still necessary. This study was conducted to determine the effect of green and red betel leaf

infusion against HeLa cervical cancer cell viability, as well as its potential to inhibit the expression of Bcl2 protein

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 Volume 6, No. 2, Desember 2013 Sari Haryanti, Yuli Widiyastuti, Nita Etikawati PENDAHULUAN

  Kanker merupakan jenis penyakit kompleks dengan karakteristik berupa kemampuan sel kanker untuk terus memenuhi sendiri sinyal proliferasi, menolak supresor pertumbuhan, menghindari sinyal kematian, menginduksi angiogenesis, menginvasi jaringan di sekitarnya, metastasis, re-program metabolisme energi, dan mencegah destruksi sistem imun (Hanahan and Weinberg, 2011). Jenis kanker yang paling banyak diderita wanita adalah kanker payudara, diikuti kanker kolon, kemudian kanker serviks. Di negara-negara Afrika Timur dan Asia Selatan kanker serviks merupakan jenis kanker dengan insidensi dan mortalitas tertinggi. Sebesar 86% kasus dan 88% kematian kanker serviks di seluruh dunia terjadi di negara berkembang (Singh et al., 2012). Lebih dari 99% kasus kanker serviks dikaitkan dengan infeksi genital oleh human papilloma virus/HPV (Nazari et al., 2007). Pengembangan terapi yang komprehensif untuk mengatasi kanker serviks sangat diperlukan untuk menekan jumlah kematian dan meningkatkan kualitas hidup penderita kanker.

  Salah satu pengembangan terapi kanker diarahkan pada terapi kombinasi antara suatu agen kemoterapi dengan senyawa kemopreventif.

  Senyawa kemopreventif didefinisikan sebagai agen yang berasal dari bahan alam, sintetik, mau- pun biologis yang dapat membalikkan, menekan dan atau mencegah perkembangan tahapan karsinogenesis (Tsao et al., 2004). Salah satu pendekatan penemuan senyawa kemopreventif adalah eksplorasi bahan alam terutama tumbuh- tumbuhan. Bahan alam mengandung berbagai senyawa biologis yang beraksi pada sel kanker melalui mekanisme yang kompleks. Tumbuhan berperan penting dalam pencegahan dan pen- gobatan kanker melalui beberapa cara: sebagai sumber potensial senyawa baru, mencegah dan menghambat terjadinya kanker, memperbaiki sistem imun, mencegah dan menurunkan efek samping pengobatan konvensional, serta mencu- kupi kebutuhan nutrisi dan psikologi (Bachrah, 2012).

  Piper betle L. (sirih hijau) dan Piper crocatum Ruiz & Pav (sirih merah) merupakan

  tumbuhan dari famili Piperaceae yang banyak ditemukan di Indonesia. Beberapa publikasi melaporkan aktivitas daun sirih hijau sebagai antifungal (Ali et al., 2010), antibakteri (Datta

  et al., 2011), anti histamin (Hajare et al., 2011),

  antioksidan dan antiproliferasi pada sel kanker payudara MCF-7 (Abrahim et al., 2012) dan menghambat pertumbuhan tumor melanoma

  

qualitatively. Infusionof betel leaves were dried over a water bath to obtain a dry extract. Effect of extracts on the

viability of HeLa cells determined by the cytotoxic test with MTT assay method to obtain IC ₅₀ values . Effect the

activity against Bcl2 protein was tested byimmunocyitochemical test. Cytotoxic test infution of green betel leaves

gave IC ₅₀ value of 49.14 ug/ml, whereas the red betel showed no cytotoxic effects. The immunocytochemical test

showed a reduction in Bcl-2 protein expression.The results of this study showed that green betel leaves affect HeLa

cell viability by inducing cell death through inhibition of anti-apoptotic Bcl2 protein expression. Thus green betel

leaves are potential to be developed as a chemopreventive agent.

  Keywords: Piper betle, Piper crocatum, cytotoxic, HeLa cells

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 AKTIVITAS INFUSA DAUN Piper betle Linn DAN Piper crocatum Ruiz & Pav TERHADAP VIABILITAS SEL HeLa Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz & Pav on HeLa cell line viability

  pada tikus (Patel et al., 2012), sedangkan daun sirih merah memiliki aktivitas menurunkan gula darah (Safithri dan Fahma, 2008) dan antioksidan (Alfarabi et al., 2010). Penelitian sirih merah sebagai antikanker payudara telah dilakukan Wicaksono et al., 2009. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih merah terbukti memiliki efek antiproliferasi pada sel T47D dengan IC50 44.25 µg/ml (Wicaksono et

  al., 2009). Berdasarkan publikasi yang ada saat

  ini, kedua jenis sirih tersebut cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif. mengenai aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan kanker serviks. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek infusa daun sirih hijau dan sirih merah terhadap viabilitas sel kanker serviks HeLa, serta potensinya dalam menghambat ekspresi protein antiapoptosis Bcl2 secara immunositokimia.

  Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu.

  Bahan

  Daun sirih hijau diambil dari Kecamatan Mojosongo, Solo. Daun sirih merah merupakan koleksi kebun B2P2TO-OT. Keduanya dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi B2P2TO-OT. Daun dicuci, dikeringkan dan diserbuk, kemudian direbus dalam panci infusa dan dibiarkan mendidih selama 10 menit. Selanjutnya infusa yang didapat dikeringkan diatas waterbath hingga diperoleh ekstrak kering.

  Sel kanker serviks HeLa yang digunakan adalah koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta pada tahun 2008 kemudian ditumbuhkan, diperbanyak melalui subkultur dan disimpan dalam nitrogen cair di Laboratorium Biologi Molekuler B2P2TO-OT. Kultur sel ditumbuhkan dalam media penumbuh

  Dulbecco’s Modified Eagle Media/DMEM (Gibco)

  yang diperkaya dengan Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin-streptomisin 1 % (v/v) (Gibco).

  Sejumlah 5.000 sel HeLa /sumuran ditanam pada microplate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu medium diganti yang baru dengan ditambahkan ekstrak kering infusa daun sirih berbagai konsentrasi (5-160 mg/ml) kemudian diinkubasi pada 37°C dalam inkubator CO ₂ 5% selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang, sel dicuci dengan PBS. Pada masing- masing sumuran, ditambahkan 100 µl larutan MTT [(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ ml dalam media kultur. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen asam isopropanol (1 bagian HCl 4N dalam 100

METODE PENELITIAN

  bagian isopropanol), digoyang di atas shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.

  Sel HeLa (kepadatan 5x10 ⁴ sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam24 well plate sampai 80% konfluen. Sel diinkubasi dengan Sari Haryanti, Yuli Widiyastuti, Nita Etikawati

  ekstrak infusa daun sirih dosis 100 µg/ml selama sel, terdapat hubungan linier antara konsentrasi 24 jam. Media diambil, dicuci dengan PBS. Cover dan efek sitotoksik yang dihasilkan. Perubahan slip diangkat, diletakkan di dalam 6 well plate. morfologi tersebut dimungkinkan mengarah Preparat difiksasi dengan methanol dingin. pada kematian sel dengan IC sebesar 49.14 ₅₀ Preparat dicuci dengan PBS 3x2 menit, kemudian µg/ml. Ekstrak infusa daun sirih merah tidak ditetesi dengan hidrogen peroxidase blocking menunjukkan adanya perubahan viabilitas dan

  

solution 3% selama 10 menit, kemudian dibuang. kematian sel. Morfologi sel HeLa serta grafik

  Pengecatan immunositokimia dilakukan dengan hubungan konsentrasi dan % viabilitas dapat metode Streptavidin Biotin Amplification system dilihat pada Gambar 1. sesuai petunjuk dalam kit yang digunakan (Histostain Kits-Invitrogen). Antibodi primer yang digunakan adalah Monoklonal anti Bcl- inkubasi selama 1 jam. Ekspresi protein diamati di bawah mikroskop dengan cahaya perbesaran 100-400x.

  Analisis Data

  Data absorbansi hasil pembacaan Elisa Reader panjang gelombang 595 nm pada uji si- totoksik diolah dengan regresi linier program Excell MS Office 2007. Ekspresi protein Bcl2 pada pengecatan immunositokimia diamati se- cara kualitatif, dibandingkan intensitas warna coklat antara perlakuan ekstrak dan tanpa per- lakuan. Warna coklat merupakan warna dari substrat DAB kromogen yang sebanding dengan interaksi antara protein Bcl2 dalam sel dengan

  Gambar 1. Viabilitas sel HeLa akibat perlakuan antibodi primer Bcl2. ekstrak infusa daun sirih hijau dan sirih merah.

  HASIL DAN PEMBAHASAN

  Uji sitotoksik menunjukkan bahwa per-

  Keterangan: ₃

  lakuan ekstrak infusa daun sirih hijau kadar Uji dilakukan dengan menginkubasi 5x10 sel dengan

  ekstrak (5-160 µg/ml) selama 48 jam. (a) sel kontrol,

  5-160 µg/mL pada sel HeLa menyebabkan ter-

  (b) perlakuan sirih merah. Terjadi perubahan mor-

  jadinya penurunan viabilitas dibandingkan sel

  fologi pada perlakuan (c) sirih hijau 40 µg/mL dan

  tanpa perlakuan. Berdasarkan hasil penghitun-

  (d) 100 µg/mL (perbesaran 100x). Grafik (e) menun- jukkan korelasi konsentrasi dan % viabilitas sel.

  gan korelasi konsentrasi ekstrak dan % viabilitas

  Volume 6, No. 2, Desember 2013

  Volume 6, No. 2, Desember 2013 AKTIVITAS INFUSA DAUN Piper betle Linn DAN Piper crocatum Ruiz & Pav TERHADAP VIABILITAS SEL HeLa Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz & Pav on HeLa cell line viability

  Ekstrak infusa daun sirih hijau menurunk- an viabilitas sel kanker serviks HeLa dengan IC ₅₀ yang relatif kecil, 49.14 μg/ml sehingga cukup potensial dikembangkan sebagai alternatif agen kemopreventif. Penurunan viabilitas disebabkan karena terjadinya hambatan proliferasi dan in- duksi kematian sel. Pengamatan perubahan mor- fologi sel pada perlakuan sirih hijau memperli- hatkan terjadinya pengkerutan dan fragmentasi sel yang merupakan salah satu karakteristik ter- jadinya apoptosis. Apoptosis merupakan salah satu bentuk kematian sel yang menghasilkan ba- makrofag atau sel di dekatnya dan didegradasi di dalam lisosom (Hetz et al., 2005).

  Penelusuran mekanisme apoptosis ber- hubungan dengan ekspresi beberapa protein regulator, di antaranya protein antiapoptosis yai- tu Bcl2. Bcl2 meregulasi apoptosis jalur intrinsik yang ditimbulkan oleh stres intraseluler seperti radiasi dan senyawa sitotoksik yang menginduk- si terjadinya pelepasan sitokrom c dari mitokon- dria yang rusak. Sitokrom c kemudian berika- tan dengan molekul adaptor APAF-1 dan iniator caspase inaktif yaitu procaspase 9, dalam suatu kompleks multiprotein yang disebut apopto- some. Selanjutnya terjadi aktivasi jalur caspase yang menghasilkan perubahan morfologi dan biokimia yang mencirikan peristiwa apoptosis (Tzifi et al., 2012).

  Hasil pengecatan immunositokimia menunjukkan pengurangan intensitas warna coklat pada sel dengan perlakuan ekstrak infusa sirih hijau. Hal tersebut merupakan indikasi ter- jadinya penurunan ekspresi protein Bcl2.

  Gambar 2. Efek perlakuan ekstrak infusa sirih hijau terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa. Keterangan: Pengecatan dilakukan setelah sel diinkubasi selama 24 jam. (a) Kontrol sel tanpa perlakuan dengan anti- bodi Bcl2 dan (b) tanpa antibodi Bcl2. (c) Perlakuan ekstrak sirih hijau 100 µg/mL dan (d) 200 µg/mL. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya, dengan per- besaran 400x

  Pengecatan imunositokimia memperli- hatkan warna coklat di bagian sitoplasma dan nukleus, yang menunjukkan ekspresi protein Bcl2 pada bagian tersebut. Menurut Tzifi et al. (2012) Bcl2 terlokalisasi di membran luar mito- kondria, membran nukleus dan membran retiku- lum endoplasma. Perlakuan ekstrak infusa daun sirih hijau mampu menekan ekpresi Bcl-2, yang ditunjukkan dengan penurunan intensitas warna coklat di bagian sitoplasma dan nukleus. Hal ini menunjukkan sirih hijau potensial digunakan se- bagai agen pemacu apoptosis melalui pengham- batan ekspresi protein Bcl-2. Induksi apoptosis adalah salah satu strategi dalam terapi kanker dengan mekanisme spesifik sehingga hanya me- matikan sel-sel dengan ekspresi gen antiapopto- sis berlebihan (salah satu karakteristik sel kank- er). Volume 6, No. 2, Desember 2013 Sari Haryanti, Yuli Widiyastuti, Nita Etikawati

  Perbedaan aktivitas sirih hijau dan merah diduga berkaitan dengan perbedaan jenis dan jumlah senyawa fenolik. Berdasarkan hasil penelitian Abrahim et al., 2012, terdapat korelasi positif antara kadar fenolik dengan aktivitas antioksidan dan antiproliferasi sel MCF-7. Senyawa fenolik daun sirih hijau yang berperan sebagai antikanker adalah hydroxychavicol dan eugenol. Keberadaan hydroxychavicol cukup berlimpah dalam ekstrak air dan lebih poten dibandingkan eugenol (Pin et al., 2006). Batubara

  International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR), 2(3): 104-109

  71

  Study on the Effect of Piper betle on the Growth of Transplanted B16F10 Melanoma in Mice. Int J Recent Adv Pharm Res., 2(1):67-

  Cervical carcinoma simulating advanced ovarian cancer. Eur. J. Surg. Oncol., 33(1): 123-124. Patel G., Patil UK., and Devi PU. 2012. Preliminary

  Nazari Z., Behtash N., Gilan MM., Ganjoei TA. 2007.

  Cell Biol., 83(5): 579–588.

  Hetz CA., Torres V. and Quest AVG. 2005. Beyond Apoptosis: Nonapoptotic Cell Death in Physiology and Disease. Review. Biochem.

  Hanahan D. and Weinberg RA. 2011. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell,144: 647-674

  Pharmacol., 5(2): 113-117,

  2011. Evaluation of antihistaminic activity of Piper betel leaf in guinea pig. Afr. J. Pharm.

  Hajare R., Darvhekar VM., Shewale A. dan Patil V.

  University of Brawijaya. Malang Indonesia. Datta A., Ghoshdastidar S. dan Singh M. 2011. leaf against Clinical Isolates of Bacteria.

  et al. (2011) membandingkan komponen

  Proceedings of The International Conference on Basic Science. Faculty of Science.

  Batubara I., Rahminiwati M., Darusman LK. dan Mitsunaga T. 2011. Tyrosinase activity of Piper betle and Piper crocatum Essential Oil.

  Medicine in Niš., 29(3): 117-123

  Bachrah ZY., 2012. Contribution of Selected Medicinal Plants for Cancer Prevention and Therapy. Scientific Journal of the Faculty of

  Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation and Free Radical Scavenging. Hayati J Biosci., 17(4): 201-204

  and Alternative Medicine, 12:220 Alfarabi M., Bintang M., Suryani, dan Safithri M. 2010. The Comparative Ability of

  A. 2012. Piper betle shows antioxidant activities, inhibits MCF-7 cell proliferation and increases activities of catalase and superoxide dismutase. BMC Complementary

  Abrahim NN., Kanthimathi MS. dan Abdul-Aziz

  Ekstrak infusa daun sirih hijau menurunkan viabilitas sel melalui induksi kematian sel melalui penurunan ekspresi protein antiapoptosis Bcl2. Sirih hijau cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif.

  KESIMPULAN

  penyusun minyak atsiri daun sirih hijau dan merah. Analisis spektra tidak mengandung champene, chavicol dan eugenol (Batubara et al., 2011).

DAFTAR PUSTAKA

  AKTIVITAS INFUSA DAUN Piper betle Linn DAN Piper crocatum Ruiz & Pav TERHADAP VIABILITAS SEL HeLa Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz & Pav on HeLa cell line viability

  Pin KY., Chuah TG., Abdull Rashih A., Rasadah MA., Law CL., and Choong TSY.. 2006.

  Aqueous Extraction of Hydroxychavicol from Piper Betle L. Leaves. Proceedings of

  the 1st International Conference on Natural Resources Engineering & Technology.

  Putrajaya, Malaysia, 146-152 Safithri M. and Fahma F. 2008. Potency of Piper

  crocatum Decoction as an Antihiperglycemia

  in Rat Strain Sprague dawley. Hayati J

  Biosci., 15(1): 45-48 Singh GK., Azuine RE., and Siahpush M. 2012.

  Global Inequalities in Cervical Cancer Incidence and Mortality are Linked to Deprivation, Low Socioeconomic Status, and Human Development. International

  Journal of MCH and AIDS, I(1): 13-26 Tsao AS., Kim ES., Hong WK., 2004.

  Chemoprevention of Cancer. Cancer J Clin., 54:150-18

  Tzifi F., Economopoulus C., Gourgiotis D., Ardavanis A., Papageorgiou S., and Scorilas

  A. 2012. The Role of BCL2 Family of Apoptosis Regulator Proteins in Acute and Chronic Leukemias. Advances in Hematology 2012: 524308

  Wicaksono BD., Handoko YA., Arung ET, Kusuma

  IW, Yulia D., Pancaputra AN. and Sandra

  F. 2009. Antiproliferative Effect of the Methanol Extract of Piper crocatum Ruiz & Pav Leaves on Human Breast (T47D) Cells In-vitro. Trop J Pharm Res., 8(4): 345-352

  Volume 6, No. 2, Desember 2013