BAHAN DAN METODE Persiapan Vaksin dsRNA VP-24
Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 77-84
Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra
RESPONS IM UN UDANG W INDU TERHADAP VAKSIN dsRNA VP-24
Penaeus monodon
#PADA DOSIS BERBEDA
Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum , Andi Parenrengi, Bunga Rant e Tam pangallo, dan Ike Trismawanti
Balai Riset Perikanan Bu didaya Air Payau dan Penyu luhan Pe rikanan
(Naskah dit erima: 10 November 2017; Revisi final: 12 Febr uari 2018; Diset ujui publikasi: 12 Februar i 2018)
ABSTRAKPeningkatan produksi udang windu Penaeus monodon terus diupayakan, salah satunya dengan peningkatan
respons imun udang terhadap infeksi penyakit WSSV. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui respons
imun udang terhadap pemberian vaksin dsRNA VP-24 pada berbagai dosis. Konstruksi vaksin dsRNA VP-24
dilakukan menggunakan Megascript kit dengan DNA genom VP-24 sebagai t emplat e . Vaksinasi dilakukan
dengan metode injeksi pada udang windu yang berukuran rata-rata 15,88 ± 3,50 g; dosis vaksin yang
diujikan adalah 0,02 µg; 0,2 µg; 2 µg; dan sebagai kontrol adalah udang yang tidak diberi vaksin. Penelitian
terdiri atas empat perlakuan dosis vaksin dengan masing-masing dua ulangan dan dipelihara selama lima
hari. Uji tantang dilakukan selama enam hari dengan menginjeksi virus WSSV dalam saline solut ion (1:3 v/v).
Pengamatan terhadap sintasan udang windu dilakukan setiap hari, sedangkan penghitungan total hemocyte
(THC) dan ProPO diamati pada hari I, III, dan VI setelah diinfeksi WSSV. Pada akhir pengujian dilakukan
pengambilan jaringan hepatopankreas untuk analisis histopatologi. Analisis data dilakukan secara statistik
dengan analisis ragam (ANOVA). Hasil yang diperoleh memperlihatkan bahwa injeksi vaksin dsRNA VP-24
dengan dosis 0,2 µg memiliki pengaruh yang signifikan terhadap sintasan dan respons imun udang windu
(P< 0,05). Vaksin dsRNA VP-24 dengan dosis 0,2 µ g mampu memberikan sintasan udang windu P. monodon
tsebesar 65% dan meningkatkan respons imun udang dengan THC (1.550 x 10 sel/mL) dan ProPO (0,042
Abs).P. monodon KATA KUNCI: dsRNA; VP-24; ; WSSV; dosis ABSTRACT: Response immune of black tiger shrimp
Penaeus monodon to dsRNA VP-24 vaccine on different doses. By: Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum, Andi Parenrengi, Bunga Rante Tampangallo, and Ike Trismawanti
One of t he effort s t o increase t he product ion of t iger shrimp Penaeus monodon is increasing t he immune response
against WSSV disease. This st udy aims t o evaluat e shrimp immune response t o dsRNA VP-24 vaccinat ion at various
doses. The const ruct ion of dsRNA VP-24 vaccine was performed using M egascript kit wit h t he VP-24 DNA genome as
a t emplat e. The vaccinat ion was done by inject ion met hod on shrimp sized 15.88 ± 3.50 g. The t est ed vaccine doses
(t reat ment s) were 0.02 ¼ g; 0.2 ¼ g; 2 ¼ g; and unvaccinat ed shrimp as t he cont rol. The st udy consist ed of four
t reatment s of vaccine doses wit h two replicat es for each t reat ment . The challenge test was performed by inject ing t he
WSSV virus in saline solut ion (1:3 v/v). The obser vat ion on shrimp sur vival rat e was done daily, while the t otal hemocyt e
count (THC) and ProPO obser vat ion were performed on t he 1st day, 3rd day, and 6t h day aft er WSSV infect ion. At t he
end of t he experiment , samplings of hepat opancreas for analysis were performed. Dat a were st at ist ically analyzed
using ANOVA. The present st udy indicat ed t hat t he inject ion of 0.2 ¼ g dsRNA VP-24 vaccine had a significant effect
on t he survival rat e and immune response of shrimp (P< 0.05). The dose of 0.2 ¼ g dsRNA VP-24 had result ed in 65%
of sur vival rat e and increased immune response of P. monodon wit h THC (1,550 x 10t cell/mL) and ProPO (0.042 Abs).
KEYW ORDS: dsRNA; VP-24; P. monodon; W SSV; dose
# Ko r esp o n d e n si: Balai Rise t Per ikan an Bu d id aya Air Payau d an Pe nyu lu h an Pe rikan an. Jl. Makm u r Dg . Sitakka No .1 2 9 , Mar o s
9 0 5 1 2 , Su lawe si Se lat an , In d o n e sia. Te l. + 6 2 4 1 1 3 7 1 5 4 4 mulyani ngrum@ kkp.go.i d
E-m ail: Co p yrigh t @ 20 18, Jurnal Riset Akuakultur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534
Respons imun udang windu Penaeus monodon t erhadap vaksin ..... (Sri Redjeki Hesti Mulyaningrum) PENDAHULUAN
: 5’-TA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CGC GGA TCC GAT GCA CAT GTG GGG GGT TTA C-3 ’. VP-24
PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healt h care ).
(Gen e Am p PCR Syst e m 27 0 0, Ap plie d Bio syst em) dengan suhu a nnealing 72°C menggunakan kit
t her macycler
Am p lifik a s i fr a g m e n DNA d ila k u k a n p a d a
: 5 ’-TA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCG GAA TTC TTA TTT TTC CCC AAC CTT AAA CAG-3’.
reverse
forward
µ
., 2010) : VP-24
et al
VP-24 (Sarat hi
) d iko n st ru ksi d ari DNA geno m VP-24 yang t elah diiso lasi dari udang windu dengan t eknik PCR. Iso lasi menggunakan primer T7
t emplat e
Cet akan DNA (
Se b a n ya k 1
L g e n o m VP-2 4 s e b a g a i
gest ion , dan purifikasi.
Nuclease Digestion Sebanyak 20 µL dsRNA yang dihasilkan direaksikan
binding b uf f er
, 10x
50 µL dsRNA dengan nuclease free wat er
Purifikasi dsRNA dilakukan d engan mereaksikan
Purifikasi dsRNA
dengan nuclease free wat er , 10x digest ion buffer , DNase, dan RNase. Larut an diinkubasi pada suhu 37°C selama s a t u ja m d an d s RNA ya n g d ih a s ilka n k e m u d ia n dipurifikasi.
(37°C), T7 en- zyme m ix, dan nuclease fr ee w at er se su ai p ro se du r Megascript RNAi Kit. Larutan yang diperoleh diinkubasi pada 37°C selama enam jam, kemudian dilanjut kan dengan inkubasi pada 75°C selama lima menit . dsRNA yang dipero leh kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 3-4 jam, selanjut nya disimpan pada suhu -20°C at au -80°C.
t em pl at e
react ion buffer
CTP, GTP, UTP, 10x T7
Produksi dsRNA Amplikon sebanyak 1-2 µg direaksikan dengan ATP,
d ip is a h k a n d e n g a n m e n g g u n a k a n t e k n ik elekt ro fo resis menggunakan marker 100 bp pada gel agaro se 2% pada t egangan 50 vo lt selama dua jam. Ampliko n yang diperoleh kemudian digunakan sebagai bahan unt uk mempro duksi vaksin dsRNA.
verse dan forward masing-masing 1 µL) dan dH2O hingga volume total 25 µL., amplikon selanjutnya
direaksikan dengan primer mix (primer T7 VP-24 re-
Persiapan Template DNA
Tahapan dalam ko n st ru ksi vaksin d sRNA VP-2 4 s e s u a i p r o s e d u r Me g a s cr ip t RNAi Kit m e lip u t i: persiapan t emplat e DNA, pro duksi dsRNA, nuclease di-
Udang merupakan salah satu sumberdaya perikanan ya n g b e r n ila i e k o n o m is t in g g i ya n g b a n ya k dib udid ayakan t e rut am a ud ang vanam e
double-st randed
(d s)RNA p ad a t arge t ge n viru s (Haq
double-st r anded
(si)RNA m au p u n
smal l int er fer ence
VP-15. Viral pro t ein ini berpeluang un t uk dijadikan se b aga i va ksin re ko m b in an (Sá n ch e z-Paz, 2 0 1 0 ). Tekno lo gi int erferensi RNA (RNAi) merupakan t eknik vaksinasi DNA reko mbinan yang spesifik dan efekt if unt uk menghambat replikasi virus dengan int ro duksi
DNA (dsDNA) t erbent uk dari makro molekul ko mpleks yang s e c a r a s p e s ifik m e le k a t d a n d is u s u n u n t u k perlindungan dan transfer geno m virus. Gen-gen WSSV yan g dit ranskripsikan pada fase lanjut ( lat e phase ) meliput i gen-gen yang menyandi pro t ein st rukt ural ut ama WSSV yait u VP-28, VP-26, VP-24 , VP-19, dan
Virus WSSV merupakan virus
., 2 0 1 2 ; Jayachandran et al ., 2012; Thammaso rn et al ., 2015). Tekno lo gi vaksinasi menggunakan agen virus dsRNA berkembang sangat pesat t erut ama dibidang medis, pert anian, dan akuakult ur (Jin
., 2013). Kemampuan replikasi yang cepat dan viru le nsi p at o ge n yan g ekst rem m enjad ikan WSSV sebagai isu glo bal. Invert ebrat a sepert i udang t idak m e m ilik i lim fo s it d a n a n t ib o d i fu n g s io n a l (imunoglobulin) dan karenanya sistem kekebalan tubuh udang dikenal sebagai sist em kekebalan ‘no n-spesifik’ at au ‘bawaan’. Pada art hro poda, udang merupakan satu di ant ara spesiesnya, mengandalkan sist em kekebalan bawaan, yang t erdiri at as sist em kekebalan humo ral dan seluler t erhadap infeksi virus (Li & Xiang, 2013). Pada invert ebrat a, vaksin berfungsi sebagai st imulan kekebalan t ubuh no n-spesifik (Ro wley & Po pe, 2012).
et al
(Tassanakajo n
P. monodon
dan udang windu
Lit openaeus vannamei
et al
et al
BAHAN DAN M ETODE Persiapan Vaksin dsRNA VP-24
., 2014; Kumar
.
in vit ro
Iso lasi dan karakt erisasi gen virulen WSSV VP-24, t elah berhasil dilakukan (Tenriulo et al ., 2015), namun p e m a n fa a t a n n ya s e b a g a i va k s in d s RNA u n t u k m e n in gka t kan re sp o n s im u n u d an g win d u m asih memerlukan kajian yan g lebih lanjut . Penelit ian ini b ert u ju an un t u k m en ge t ah ui resp o n s im u n ud an g windu Penaeus monodon t erhadap pemberian vaksin dsRNA VP-2 4 dengan do sis yang berbed a secara
et al ., 2017).
., 2015; Puneet h
et al
et al
., 2010; Lichner
., 2 0 1 4 ). Be b e r a p a p e n e lit ia n va k s in a s i u d a n g menggunakan agen WSSV sebagai sumber vaksin telah menunjukkan kemajuan dan mempero leh hasil yang menggembirakan (Huang
et al
., 2011; Ahanger
et al
., 2003; Ro wley & Po pe, 2012). Di bidang akuakult ur, t e k n o lo g i in i b a n ya k d ik e m b a n g k a n u n t u k menanggulangi penyakit yang disebabkan o leh virus pada udang (Mejía-Ruíz
et al
, d a n e t a n o l 1 0 0 %. Ke m u d ia n d ila k u k a n Co p yrigh t @ 20 18, Jurnal Riset Akuakultur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 77-84
se n t r ifu gas i, u n t u k m e m is ah k an su p e rn at a n d an homogenat . Ho mogenat yang dipero leh dicuci dengan
. (200 9) melapo rkan bahwa konst ruksi vaksin DNA reko mbinan m a m p u m e m p r o t e k s i u d a n g w in d u h in g g a 6 2 % t e r h a d a p s e r a n g a n W SSV. Sa r a t h i
disent rifuge
, pro sedur ini diulang hingga dua kali dan ho mo genat yang dipero leh dibagi dua. Sat u sampel ho mo genat digunakan unt uk pengukuran t ripsin dan sat u sam p e l yan g lain u n t u k p e n gu ku ran LDOPA. Masin g-masing sam pe l diukur abso rbansin ya p ad a spekt ra 490 nm. Pada akhir pengujian dengan WSSV, dilakukan pengambilan sampel hepat o pankreas untuk analisis hist o pat o lo gi.
Pe n e lit ia n d ir a n ca n g d e n g a n r an can g a n a ca k lengkap (RAL) menggunakan analisis ragam (ANOVA), d e n gan e m p at p e rlaku an d an d u a u lan gan u n t u k masing-masing perlakuan do sis vaksin. Dat a hist o lo gi dianalisis secara deskript if.
HASIL DAN BAHASAN Sintasan Udang W indu
Pengamatan t erhadap sintasan udang windu selama uji t ant ang memperlihat kan pemberian vaksin VP-24
dengan dosis 0,2 µg mampu meningkatkan sintasan
udang sebesar 65% dibandingkan kontrol (10%) (Gambar 1). Hasil analisis ragam (ANOVA) menunjukkan bahwa pemberian vaksin dsRNA VP-24 memberikan pengaruh yang signifikan t erhadap sint asan udang (P< 0,05).
Pen elit ian t e rdahu lu o leh Krishnan
et al
et a l
disentrifuge
. (2 0 1 0 ) m em p e ro le h m o rt alit as ko m u lat if u d an g win d u
P. monodon seb esar 37% dengan injeksi dsRNA VP-24.
Sintasan yang dipero leh pada penelit ian ini lebih t inggi dari hasil yang dipero leh o leh Puneet h
et al
. (2017) yang mempero leh sint asan udang windu sebesar 50% dengan injeksi vaksin VP-24
in vivo
dengan do sis 2,5 µg/g bobot udang. Fungsi VP-24 pada siklus hidup WSSV belum banyak d ik e t a h u i, VP-2 4 t e r b u k t i t id ak d a p at m e n g ika t m e m b r a n s e l in a n g . Ha s il p e n e lit ia n t e r d a h u lu membukt ikan adanya interaksi langsung VP-24 dan VP- 28 masing-masing membent uk ko mpleks pro t ein dan b erpart isip asi dalam in fe ksi viru s se cara be rsama- sama. Menurut Chen
et al
. (2007), gen penyandi VP- 2 4 m e m iliki p e r a n se b a ga i p e n gh u b u n g p r o t e in st ru kt u ral d ari p ro t e in VP-2 8, VP-26 , WSV-1 0, d an pro t ein lain unt uk membent uk ikat an ko mpleks pada amplo p virus. Anti-VP-24 IgG dapat mencegah serangan WSSV secara signifikan (Xie & Yang, 2006).
pada suhu 4°C dengan kecepatan 1.000 rpm s e la m a 2 0 m e n it . Ho m o g e n a t ya n g d ip e r o le h d ila r u t k a n d e n g a n cocodyl at e ci t r at e buf f er d a n
Pengamat an t erhadap udang yang t elah diinfeksi WSSV dilakukan selama enam hari. Sint asan udang diamat i set iap hari, sedangkan pengamat an t erhadap THC dan pro PO dilakukan pada awal sebelum injeksi WSSV, h a r i ke -1 , 3 , d a n 6 . Pe n g a m a t a n p ro PO didasarkan pada pengukuran absorbansi menggunakan L-DOPA se b ag ai s u b s t rat . He m o lim u d a n g d ib e ri a n t iko a g u la n Tr is o d iu m cit r a t e 3 ,8 % ke m u d ia n
w ash sol ut ion
dengan
d a n
di sent r i fug e
, h o m o g e n a t ya n g dipero leh kemudian diberi elut io n so lutio n (95°C) dan
di sent r i fuge
ke m b ali. Su p e rn at a n ya n g d ip e ro le h merupakan dsRNA murni sebagai bahan vaksin. Hasil dsRNA yang dipero leh merupakan bahan vaksin dsRNA VP-24 yang akan diaplikasikan pada hewan uji.
Vaksinasi Udang W indu dengan Vaksin dsRNA
VP-24
Va k s in a s i d ila k u ka n d e n g a n m e t o d e in je k s i int ramuskular pada udang windu berukuran rat a-rat a (15,88 ± 3,50 g) dan panjang rat a-rat a (11,91 ± 1,11 cm ). Do s is va k s in ya n g d iu jik a n m e r u ju k p a d a penelit ian Lo y et al . (2012) yakni: 0,02 µg/ekor; 0,2
µg/ekor; dan 2 µg/ekor dan udang yang diinjeksi
saline solut ion (SS) tanpa vaksin sebagai ko nt ro l.
(-80°C) s e b a g a i s t o k vir u s WSSV. St o k WSSV ke m u d ia n d ie n ce rkan de n gan SS pe rban din gan 1:3 (v/v) dan diinjeksikan ke udang dengan volume 100 µL/ekor.
Ud a n g ya n g t e la h d iva ks in d ip e lih a ra p a d a b a k t erko nt ro l yang berukuran 80 cm x 80 cm x 60 cm yang dilengkapi dengan aerasi, dengan kepadat an 10 e k o r /b a k s e b a n ya k t ig a u la n g a n . Pe m e lih a r a a n d ilaku ka n se lam a lim a h ari, k e m u d ian d ilaku k an pengukuran THC dan pro PO sebagai data awal sebelum dilakukan uji t ant ang.
Pengujian Respons Im un Udang W indu
Uji t an t ang d ilakukan lima h ari se t e lah in je ksi vaksin dsRNA VP-24, pengujian dilakukan pada delapan buah bak t erko nt ro l berukuran 80 cm x 80 cm x 60 cm yang dilengkapi dengan aerasi. Set iap bak d iisi d e n ga n 1 0 e ko r u d a n g win d u ya n g t e la h d ib e r i pe rlakuan d o sis vaksin d engan dua ulangan unt uk set iap perlakuan. Udang windu yang t e lah divaksin de ngan do sis se su ai pe rlakuan ke mu dian diinjeksi d e n g a n vir u s WSSV ya n g t e la h d ik o n fir m a s i pat o genit asnya. Virus WSSV dipero leh dari hemo lim u d a n g w in d u ya n g t e r in fe k s i W SSV. He m o lim kemudian
disent rifuge
pada 3.000 g selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernat an yang dipero leh diambil dan
disent rifuge kembali pada 8.000 g selama 30 menit pada
s u h u 4 °C. Su p e r n a t a n ke m u d ia n d ifilt e r d e n ga n menggunakan
cellulose nit rat e membrane filt er 0,2 µm.
Hasil yang dipero leh disimpan dalam
biofreezer
Gen VP-24 memiliki ho mo lo gi yang t inggi dengan sekuens pro t ein-pro t ein hist o n sehingga pro t ein ini
Respons imun udang windu Penaeus monodon t erhadap vaksin ..... (Sri Redjeki Hesti Mulyaningrum)
3
vaksin dsRNA VP-24 dengan dosis 0,2 µg (0,042 Abs) dan terendah pada dosis 0,02 µg (0,012 Abs) seperti
disajikan pada Gambar 3. Gambar 1. Sint asan udang windu pada aplikasi vaksin dsRNA VP-24 secara
in vit ro .
Figure 1. Sur vival rat e of P. monodon on in vit ro dsRNA VP-24 vaccine appli-
cat ion.20
40
60
80 100
1
2
4
Akt ivitas Prophenoloxydase (proPO)
5
6 S
in ta sa n ( S u rv iv a l ra te ) (% )
Wakt u p em eliharaan (hari) /
Rearing period (days)
Ko nt rol (Cont rol) 0.02 µg 0.2 µg 2 µg
Kontrol ( Control ) 0.02 µ g
0.2
µ
Pe ngamat an p ad a akt ivit as pro PO se be lum d an sesudah uji t ant ang den gan WSSV memperlihat kan b ah wa Pro PO t ert in ggi dip ero le h p ada pe m be rian
., 2015).
d ip e rkirakan me m iliki p e ran dalam p en gikat DNA WSSV, m emben t uk p o ro s nukleo pro t ein (
Ju m la h h e m o s it t e r t in g g i d ip e r o le h p a d a
nucleopro- t ein core
) dan berperan dalam infeksi sist emik pada ud an g, d an d ap at m en st im ulasi mu nculnya sist em kekebalan pada udang windu (Underwoo d
et al ., 2013).
Pa d a h e w a n a k u a t ik t e r u t a m a k r u s t a s e a , mekanisme int ereferensi RNA t erjadi pada beberapa t ahap, pada saat dsRNA diinduksi ke dalam sel t arget t e rle b ih d ah u lu t e rjad i p e m b e n t u kan siRNA yan g kemudian mendegradasi mRNA sehingga ekspresi gen se cara sp e sifik m e n jad i in akt if p a d a t ah ap p o s t - t ranskripsi (Reshi
et al
., 2014; He
et al ., 2015).
Total Hemocyte Count (THC)
Hasil penghit ungan t o t al hemo sit (THC) nampak t erjadi adanya peningkat an pada udang windu yang diberi vaksin dsRNA VP-24 (Gambar 2).
pemberian vaksin sebesar 0,2 µg (1.550 x 10 t
et al
sel/mL) d an t e re n d a h p ad a k o n t ro l (4 9 0 x 1 0 t se l/m L). Pemberian vaksin dsRNA VP-24 t erhadap udang windu m e m b e rika n p e n ga ru h yan g s ig n ifika n t e r h a d a p penghit ungan jumlah hemo sit , THC (P< 0,05). Pada ko nt ro l t erjadi penurunan THC set elah dilakukan uji t an t an g (Ga m b a r 3 ). Me n u r u t Ye h
et al
. (2 0 0 9 ), t e r ja d in ya p e n u r u n a n THC p a s c a u ji t a n t a n g disebabkan o leh bermigrasinya sel hemo sit dari sistem sirkulasi t ubuh menuju jaringan, dengan banyaknya sel yang t erinfeksi. Infeksi WSSV yang berada pada fase kr it is m e n ye b a b kan t e rjad in ya re aksi s e l-se l h e m o s it u n t u k m e la ku k a n b e rb a g ai m e k a n is m e pert ahanan t ubuh yang t erdiri atas pro ses pengenalan pat o gen, fago sit o sis, melanisasi, dan sit o t o ksisit as.
Pada pemberian vaksin dengan dosis 2 µg juga terjadi
penurunan jumlah THC, menurut Harikrishnan
et al .
(2011) pemberian imuno st imulan melebihi do sis o p- t imal dapat menyebabkan imuno supresi pada udang uji, t et api dap at mempro t eksi ikan /udang t erhadap se ran gan p e n yakit . Efe kt o r u t am a s e l-se l s ist e m ke ke balan t u b uh p ad a kru st ase a ad alah h e mo sit , sement ara hepat o pankreas bert anggung jawab unt uk bio sint esis dari beberapa fakto r humoral. Peningkatan sel-sel hemo sit dalam t ubuh udang berperan pent ing dalam menghambat atau menghancurkan pato gen yang masuk ke dalam t ubuh udang. Pada ud ang, sepert i dalam krust asea lainnya, t e rdap at t iga jenis ut ama hemo sit (sel darah) yakni sel hialin, sel semi-granular dan sel granular (granulo sit ), yang semuanya berperan dalam kekebalan tubuh dan pertahanan terhadap infeksi penyakit . Pemberian imuno st imulan yang dilakukan s e ca r a t e r u s -m e n e r u s d a p a t m e n g a t u r d a n mempert ahankan sist em imun pada ko ndisi o pt imal s a m p a i d e n g a n p e m b e r ia n b e r h e n t i d ila k u k a n (Cerenius
et al
., 2010; Ro wley & Po pe, 2014; Jane
g 2 µ g Co p yrigh t @ 20 18, Jurnal Riset Akuakultur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 77-84
Hasil an alisis ragam (ANOVA) m e mp e rlih at kan bahwa perlakuan do sis vaksin memberikan pengaruh yang nyat a pada akt ivit as pro PO (P< 0,05). Akt ivit as Pro PO meningkat pada 24 jam hingga 72 jam set elah d iin jeksi. Paria et al . (2 0 13 ) me m p ero leh h asil u ji t ant an g WSSV p ada p en gu jian d sRNA VP-2 8 pad a u d a n g win d u t id ak m e m b e r ikan p e ru b a h an yan g signifikan pada ekspresi gen pro PO hingga 24 jam, namun t erjadi peningkat an ekspresi hingga t iga kali lipat pada 48 jam set elah injeksi.
dengan aplikasi vaksin pada do sis yang berbeda set elah diuji t ant ang dengan WSSV.
6 t h day )
Hari ke-6 (
3 rd day )
Hari ke-3 (
1 st day )
Awal ( Initial ) Hari ke-1 (
Awal (Init ial) 24 jam (24 ho urs) 72 jam (72 ho urs) 144 jam (144 hours)
Do sis vaksin ( Vaccine doses ) (µg)
ro P O ( A b s)
2 P
0.2
0.02
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120
Figure 3. ProPO act ivit y of black t iger shrimp P. monodon t est ed wit h different
doses of vaccine applicat ion aft er WSSV challenge .P. monodon
Pro PO merupakan ko mpo nen mayo r pada sist em imunit as ‘innat e’ pada udang. Sist em kekebalan no n- spesifik seluler memiliki dua ko mpo nen ut ama yakni sist em humo ral dan seluler, keduanya bekerja secara b e r s a m a -s a m a d a n d ia k t ifk a n p a d a s a a t t e r ja d i t ant angan kekebalan . Ko mp o ne n selu le r d ime diasi o le h h e m o s it s e d a n g k a n h u m o r a l m e lib a t k a n ko mpo nen yang bebas dari sel hemo lymph. Keduanya bersifat int erakt if dan saling t erkait yang berfungsi s e ca r a s in e r g is u n t u k m e lin d u n g i u d a n g d a n
0.2
Gambar 2. Jumlah hemo sit udang windu pada aplikasi vaksin dsRNA VP-24 dengan do sis berbeda.
Figure 2. Tot al hemocyt e count of black t iger shrimp P. monodon t est ed wit h
dsRNA VP- 24 vaccine applicat io n
wit h diffenrent doses .
500 1000 1500 2000
0.02
2 T
Gambar 3. Akt ivit as pro PO udang windu
H C ( x
1
4 se l/ m L )
T H C ( x
1 4 ce ll /m L )
Dosis vaksin ( Vaccine doses ) (µg) Awal (Init ial) Hari ke-1 (1st day) Hari ke-3 (3rd day) Hari ke-6 (6t h day)
Awal ( Initial ) 24 jam ( 24 hours ) 72 jam ( 72 hours ) 144 jam ( 144 hours )
Respons imun udang windu Penaeus monodon t erhadap vaksin ..... (Sri Redjeki Hesti Mulyaningrum)
et al
badan inklusi (hit am) dan nekro t ik sel (merah); (b) peningkat an degenerasi lemak; dan (c) lisis sel dan degenerasi lemak.
Profil kerusakan sel hepatopankreas pada udang windu (skala bar= 10 µm): (a)
a b c Gambar 4.
jenis inklusi muncul sebagai zo na t ransparan ant ara viro genic st ro ma dan sangat padat elekt ro n berbat as kro mat in . Int i men jadi hipert ro fi dan bulat . Tahap-3 pada int i; n ukleo kapsid mu ncul dengan kerapatan elektron rendah dan secara bertahap t u mb u h d ari sat u u ju ng ke arah yan g lain , m asih t erbuka. Pusat inklusi int ranuklear muncul lebih kecil d ar i d ala m se l d a n le b ih p a d a t e le k t r o n k ar e n a k e h ad ir an p a rt ik e l vir u s ya n g b e r lim p a h . Ke t ik a kro mat in menghilang, int i membran t erganggu, dan
Cowdry-A
. (2008), pada t ahap awal t erin fe ksi virus WSSV, se l m e n u nju kkan in t i s e d ik it h ip e rt r o fi. Da la m s it o p la sm a , re t ik u lu m endo plasma (RE) menjadi membesar dengan berlimpah ribo so m bebas. Pada t ahap-2; dalam int i, mat erial fibril menginduksi pembent ukan membran yang segera diisi dengan mat eri int i virus membent uk ikat an viral. Pada t ahap ini,
Menurut Esco bedo -Bo nilla
menghilangkan part ikel asing dan pat o gen. Di ant ara berbagai jenis respo ns kekebalan humo ral, salah sat u t eknik imun invert ebrat a yang paling efekt if melawan part ikel asing adalah enkapsulasi melano t ik seluler. Melanisasi m erupakan ko mpo nen pert ahanan imun pada krust asea di mana sint esis melanin dilakukan dengan mengakt ivasi sist em pro PO yang melibat kan e n z im PO (Tassa n akajo n
rus WSSV. Tahap t iga infeksi t erlihat pada Gambar 4b, di mana int i membran t erganggu dan zo na pembat as menjadi t ransparan, dan pada Gambar 4c t erlihat sel ya n g t e r in fe k s i r u sa k d a n m e n g ala m i lisis ya n g merupakan t ahap akhir infeksi WSSV.
A ) t ipe inklusi yang merupakan t ahap awal infeksi vi-
., 2013). Hasil analisis hist o pat o lo gi pada hepat o pankreas udang yang t erserang WSSV memperlihat kan adanya beberapa tingkat kerusakan sel hepatopankreas seperti inklusi badan, nekro t ik sel, peningkat an degenerasi le m ak, d an lisis se l (Gam b ar 4 ). Pad a Gam b ar 4 a t erlihat adanya hipert ro pi pada int i sel ( Cowdry t ype-
et al
., 2 0 1 3 ). Ra n gka ian m e la n is a s i k o m p le k s m e m e r lu k a n k o m b in a s i p ere d aran h e m o sit in a d an b e b erapa p ro t e in yan g t erkait dengan sist em pengakt ifan pro pheno lo xidase (pro PO). Sist em ini merupakan salah sat u unsur hu- mo ral yang sering berhasil unt uk mengat asi penyakit pada invert ebrat a. Penurunan akt ivit as sist em pro PO d a p a t m e n ye b a b k a n k e g a g a la n fa g o s it o s is d a n menyebabkan kerusakan jaringan (Ampar yup
et al
Figure 4. Profile of hepat opancreas cells damage on black t iger shrimp P. monodon (scale bar=
10 µm): (a) inclution bodies (black arrow) and necrotic cells (red arrow); (b) increased degenerat ion of fat (black arrows), and (c) cell lysis and fat degenerat ion (black arrow) .Co p yrigh t @ 20 18, Jurnal Riset Akuakultur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 77-84
In t e rfe re n ce as a ce llu lar d e fe n s e m e ch an ism against t he DNA virus baculo virus.
Impact o f plant pro duct s o n innat e and adapt ive immune syst em o f cult ured finfish and shellfish.
Aquacult ure , 317, 1-15.
He, Y., Jua, C., & Zhanga, X. (2015). Ro les o f small RNAs in t he immune defense mechanisms o f crus- t aceans.
M olecular Immunology , 68, 399-403.
Huan g, P.Y., Leu , J.H., & Che n, L.L. (2014 ). A n ewly ident ified pro t ein co mp lex t hat mediat es whit e spo t syndro me virus infect io n via chit in-binding pro t ein.
Journal of General Virology , 95, 1799-1808.
Jan e , M.S., Am ar, A., & Am ar, E.C. (2 0 1 5 ). Use o f immuno st imulans in shrimp cult ure: An updat e.
Bio t echno lo gical advances in shrimp healt h man- agement in t he Philippines.
Research Signpost , p.
45-71. Jayachandran, B., Hussain, M., & Asgari, S. (2012). RNA
Journal of Virol- ogy
Asian Pacific Journal of Tropical Disease
, 86(24), 13729-13734. Jin, B., Sun, T., Yu, X.H., Liu, C.Q. Yang, Y.X. Lu, P., Fu, S. F. , Qiu , H. B., & Ye o , A. E. T. (2 0 1 0 ).
Immuno mo dulat o r y effect s o f dsRNA and it s po - t ent ial as vaccine adjuvant . Review Art icle.
Jour- nal of Biomedicine and Biot echnology
, p. 1-17. Krishnan, P., GireshBabu, P., Saravanan, S., Rajendran,
K.V., & Ch au d h ar i, A. (2 0 0 9 ). DNA co n st r u ct s e xp r e sin g lo n g -h a ir p in RNA (lh RNA) p ro t e ct s
Penaeus monodon against wh it e sp o t syn dro m e virus.
Vaccine , 27, 3849-3855.
Kumar, A., Laramo re, S., Alexander, P., Allnut t , F.C.T., & Sayre, R.T. (2015). Do uble st randed RNA simul- t an eo usly t arge t ing fo ur wh it e spo t syn dro m e virus (WSSV) genes pro vides pro t ect io n against WSSV in
Lit openaeus vannamei .
Int . J. M arine Sci. Ocean Technol ., 2(2), 5-10.
, p. 73-77. Harikrishnan, R., Balasundaram, C., & Heo , M. (2011).
A review.
zo na pembat as menjadi t ransparan menyat u dengan sit o plasma. Tahap-4 dalam int i, nukleo kapsid menjadi b e n ar-b e n ar t e rt u t u p o le h am p lo p viru s. Tah ap -5 merupakan t ahap akhir mo rfogenesis virus. Pada tahap a k h ir in i, s e l ya n g t e r in fe k s i r u s a k p a r a h d a n t erganggu, ruang vo id pada jaringan t eramat i sebagai sel hancur.
Penelit ian ini dibiaya o leh APBN Tahun Anggaran 2017 Balai Rise t Perikanan Budidaya Air Payau dan Pe n yu lu h a n Pe r ik a n a n . Uc a p a n t e r im a k a s ih disampaikan kepada Ibu Andi Tenriulo, M.Si. yang telah banyak berko nt ribusi dalam pelaksanaan penelit ian, Drh . Wah yu n i d alam an alisis h ist o p at o lo gi, se rt a t e knisi lit kayasa dan n o n lit kayasa yang mem ban t u penelit ian ini.
Journal of Fish Diseases
(2008). A review o n t he mo rpho lo gy, mo lecular charact erizat io n, mo rpho genesis, and pat ho gen- esis o f whit e spo t syndro me virus.
, 364, 208-213. Esco b e d o -Bo n illa, C.M., Alday-San z, V., Wille , M., So rge lo o s, P., Pe nsaert , M.B., & Nau wyn ck, H.J.
Virology
Chen, J., Li, Z., & Hew, C.L. (2007). Charact erizat io n o f a no vel envelo pe pro t ein WSV010 o f shrimp whit e spo t syndro me virus and its interactio n wit h a major viral st ruct ural pro t ein VP24.
Hingga saat ini pe rso alan p en yakit u dan g yang disebabkan o leh virus WSSV belum dapat diatasi secara efekt if. Pem ah am an m en ge nai in t e raksi mo le ku le r virus pat o gen WSSV dengan inang dapat memberikan ko nt ribusi unt uk mengat asi perso alan penyakit WSSV pada udang (Verbruggen et al ., 2016). Pro duksi vaksin dsRNA merupakan salah sat u upaya unt uk mengat asi perso alan WSSV yang didasarkan pada pemahaman in t e raksi mo lekuler viru s de ngan inan g. Dari hasil penelit ian ini diharapkan dapat memberikan implikasi pada peningkat an pro duksi udang windu
P. monodon
khususnya di Indo nesia melalui pencegahan penyakit WSSV.
KESIM PULAN
Hasil penelit ian menunjukkan bahwa do sis vaksin
dsRNA VP-24 sebesar 0,2 µg memiliki pengaruh yang
, 31, 1-18. Haq, MA.B., Vignesh, R., & Srinivasan, M. (2012). Deep insight int o whit e spo t syndro me virus vaccines:
sign ifikan t e rh adap sin t asan (65 %), m e n in gkat kan jumlah hemo sit (1.550 x 10 4 sel/mL) dan respo ns imun udang windu yang diindikasikan dari akt ivit as Pro PO (0,042 Abs).
UCAPAN TERIM A KASIH
DAFTAR ACUAN
Ah ange r, S., San d aka, S., Anan ad , D., Man i, M.K., Ko n d a d h asu la, R., Re d d y, C.S., Marap p an , M., Valap p il, R.K., Maju m d a r, K.C., & Mish ra, R.K.
(20 1 4 ). Pro t ect io n o f shrim p Penaeus monodon fro m WSSV infect io n using ant isense co nst ruct s.
M ar. Biot echnol ., 16, 63-73.
(2013). Pro pheno lo xidase syst em and it s ro le in shrimp immune respo nses against majo r pat ho - gens.
Fish & Shellfish Immunology , 34, 990-1001.
Cerenius, L., Jiravanichpaisal, P., Liu, H., & Sö derhäll, I. (2 010). Crust acean immunit y. In Sö d erhäll, K.
(Ed.),
Invertebrat e immunity
. New Yo rk, USA: Landes Bio science and Springer Science Business Media, LLC, p. 239-258.
Ampar yup, P., Charo ensapsri, W., & Tassanakajo n, A.
Respons imun udang windu Penaeus monodon t erhadap vaksin ..... (Sri Redjeki Hesti Mulyaningrum)
Tenriulo, A., Tampangallo , B.R., Parenrengi, A., & Dewi, R.A. (2015). Iso lasi dan karakt erisasi gen penyandi pro t ein VP-24 WSSV pada udang windu (
Sánchez-Paz, A. (2010). Whit e spo t syndro me virus: an o ver vie w o n an emergent co ncern. Vet . Res ., 41(43), 34.
Sarat h i, M., Simo n , M.C., Ven kat esan , C., Tho mas, J., Ravi, M., Madan, N., Thiyagarajan, S., & Hameed, A.S.S. (2 0 10 ). Efficacy o f bact e rially exp re sse d dsRNA specific t o differen t st ru ct ural gen es o f whit e spo t syndro me virus (WSSV) in pro t ect io n o f shrim p fro m WSSV in fe ct io n.
Jour nal of Fish Diseases
, 33, 603-607. Th a m m a s o r n , T., Sa n g s u r iya , P., Me e m e t t a , W.,
Senapin, S., Saro cha Jit rako rn, S., Rat t anaro jpo ng, T., & Saksmerpro me , V. (2015). Large-scale pro - d u ct io n an d an t ivira l e fficacy o f m u lt i-t a rg e t do uble-st randed RNA fo r t he prevent io n o f whit e spo t syndro me virus (WSSV) in shrimp.
BM C Bio- t echnology
, 15, 110-116. Tassanakajo n, A., So mbo o nwiwat , K., Supungul, P., &
Tang, S. (2013). Disco ver y o f immune mo lecules and t heir crucial funct io ns in shrimp immun it y.
Fish & Shellfish Immunology , 34, 954-967.
Penaeus monodon ) unt uk pengembangan t ekno lo gi RNAi. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakult ur , hlm.
Ro wley, A.F., & Po pe, E.C. (2012). Vaccines and crus- t acean aq uacult ure : A mechan ist ic exp lo rat io n.
593-598. Under wo o d, D.J., Co wley J.A., & Jo hnso n, K.N. (2013).
An t iviral im m u n it y an d p ro t e ct io n in p e n ae id shrimp. Review Art icle.
Versit a, Invert ebrat e Immu- nit y
, p. 2-14. Verbruggen , B., Bickle y, L.K., Ae rle, R.V., Bat em an , K.S., St ent ifo rd, G.D., Sant o s, E.M., & Tyler, C.R.
(2016). Mo lecular mechanisms o f whit e spo t syn- dro me virus infect io n and perspect ives o n t reat - ment s. Viruses, 8(23), 1-29. Xie, X., & Yang, F. (2006). Whit e spo t syndro me virus
VP24 int eract s wit h VP28 and is invo lved in virus infect io n. Journal of General Virology , 87, 1903-1908. Ye h, S.P., Che n, Y.N., Hsieh , S.L., Chen g, W., & Liu,
C.H. (2009). Immune respo nse o f whit e shrimp,
Lit openaeus vannamei
, aft er a co ncurrent infect io n wit h whit e sp o t syndro me virus and infe ct io us hypo dermal and hemato poietic necro sis virus.
Fish Shellfish Immun
Aquacult ure , 334-337, 1-11.
Fish & Shellfish Immu- nology , 40, 14-23.
Li, F., & Xiang, J. (2013). Recent advances in researches o n t he innat e immunit y o f shrimp in China.
Litopenaeus vannamei
Dev. Com. Immunol ., 39, 11-26.
Lichner, Z., Silhavy, D., & Burgya´ n, J. (2003). Do uble- st rand ed RNA-b in ding p ro t e in s co uld su pp re ss RNA int erference-mediated ant iviral defences.
Jour- nal of General Virology , 84, 975-980.
Lo y, J.D., Mo gler, M.A., Lo y, D.S., Janke, B., Kamrud, K., Scura, E.D., Harris, D.L.H., & Bart ho lo may, L.C.
(2012). dsRNA pro vides sequence-dependent pro - t e ct io n against infe ct io us myo necro sis virus in
Lit openaeus vannamei .
Journal of General Virology
, 93, 880-888. Mejía-Ru íz, C.H., Ve ga-Pe ña, S., Alvare z-Ruiz, P., &
Esco bedo -Bo nilla, C.M. (2011). Do uble-st randed RNA against whit e spo t syndro me virus (WSSV)
VP28 o r VP26 reduced suscept ibilit y o f
t o WSSV, an d sur vivo rs e xhibit ed d e- creased suscept ibilit y in subsequent re-infect io ns.
RNA int erference t echno lo gy used fo r t he st udy o f aquat ic virus infect io ns.
Journal of Invert ebrat e Pat hology , 107, 65-68.
Paria, A., Greeshma, S.S., Chaudhari, A., Makesh, M., Pu rusho t h aman, C.S., & Rajen dran, K.V. (2 013 ).
No n specific effe ct o f do u ble-st ran ded (ds) RNA o n p r o p h e n o lo xid a s e (p r o PO) e xp r e ss io n in
Penaeus monodon .
Appl. Biochem. Biot echnol
., 169, 281-289. Pu n e e t h , T.G., Ak h ila , D.S., De c h a m m a , M.M.,
Shreeharsha, J.M., Shivakumar, S.K., & Venugo pal, M.N. (2017). Co mparat ive efficacy o f dsRNA VP24,
VP26, RR1 and WSV477 gene against WSSV infec- t io n in
Penaeus monodon. Int . J. Curr. M icrobiol. App. Sci ., 6(2), 665-674.
Reshi, M.L., Wu, J.L., Wang, H.V., & Ho ng, J.R. (2014).
., 26, 582-588.