Penerapan Metode Spektrofotometri Ultraviolet Pada Penetapan Kadar Clopidogrel Dalam Sediaan Tablet
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Uraian Bahan
2.1.1 Sifat Fisikokimia
Struktur Kimia:
Rumus Molekul
Nama Kimia
: C16H16ClNO2S
: (α S)- α(2-klorofenil)-6,7-dihidrotieno [3,2-c]
piridin-5(4H)-asam asetat, metil ester.
Berat molekul
: 321,50
Rotasi Optik
: 560
Titik Lebur
: 1840
Pemerian
: Serbuk putih atau hampir putih
Kelarutan
: Praktis tidak larut dalam air, mudah larut dalam
larutan asam dengan pH=1, larut dalam metanol,
sedikit larut dalam metilen klorida dan praktis
tidak larut dalam etil eter (Moffat, 2004).
2.1.2 Farmakologi
Untuk menghambat terjadinya pembentukan bekuan darah sehingga dapat
mencegah terjadinya serangan jantung dan stroke yang diakibatkan dari
penyumbatan
pembuluh
darah
(Ndadari,
2007).
Mengurangi
kejadian
aterosklerosis pada pasien yang ditandai dengan stroke yang belum lama terjadi
Universitas Sumatera Utara
serta mencegah terjadinya infark miokard atau penyakit arteri perifer dan angina
tidak stabil (MIMS, 2009).
2.1.3 Farmakokinetik
Makanan
tidak
secara
signifikan
mengubah
ketersediaan
hayati
clopidogrel. Clopidogrel dengan cepat diserap setelah pemberian dosis oral
berulang yaitu 75 mg, dengan kadar plasma sekitar 35 mg/L dari metabolitnya.
Penyerapan minimal 50% sesuai dengan ekskresi dari metabolit clopidogrel.
Clopidogrel didistribusikan dalam bentuk metabolit aktif dan mengalami
pengikatan dengan protein plasma (94% - 98%). Metabolismenya terjadi dengan
dua cara yaitu melalui hidrolisis menghasilkan metabolit tidak aktif yaitu asam
karboksilat dan dengan bantuan enzim sitokrom P450 sehingga menghasilkan 2oxo-clopidogrel
(metabolit
aktif);
yang
berperan
sebagai
antiplatelet
(Ndadari, 2007). Ekskresi clopidogrel terjadi melalui urin (50%) dan melalui feses
(46%) (Anonim, 2010).
2.1.4 Efek Samping
Perdarahan pada otak dan gastrointestinal (saluran pencernaan), nyeri
abdominal (perut), konstipasi, dan pruritus (ruam atau gatal), infeksi pernafasan
atas, sesak napas, batuk, nyeri dada, udema, neutropenia (menurunnya jumlah sel
darah putih) (Anonim, 2010).
2.1.5 Dosis
Dosis oral untuk orang dewasa: myocardial infarction (MI) dan stroke
yang belum lama terjadi, atau penyakit perifer arteri yang sudah terbukti: satu kali
sehari satu tablet 75 mg. Sindrom koroner akut: dosis muatan 300 mg; diikuti
dengan 1 tablet/hari: 75 mg (dikombinasikan dengan aspirin 75-325 mg, 1
Universitas Sumatera Utara
tablet/hari). Pasien dengan alergi terhadap aspirin, dosis muatan: 300 mg/6 jam;
dosis penjagaan: 50-100 mg/hari (Ndadari, 2007).
2.1.6 Sediaan
Dalam perdagangan, clopidogrel tersedia dalam bentuk tablet salut film
(oral) 75 mg/tablet (Ndadari, 2007).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet
2.2.1 Teori Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang
untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm,
daerah infra merah dekat 780-3000 nm dan daerah infra merah 2,5-4,0 µm atau
4000-250 cm-1 (Ditjen POM, 1995).
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik
aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi atau atom yang
mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut
sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif (Satiadarma, 2004).
Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dan daerah
tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari π→π*, yang menyerap pada λmax
kecil dari 200 nm (tidak terkonjugasi), misalnya pada >C=C< dan -C≡C-.
Universitas Sumatera Utara
Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π
pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konjugasi,
perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Gugus fungsi seperti –OH, -NH2, dan –Cl yang mepunyai elektronelektron valensi bukan ikatan disebut ausokhrom yang tidak menyerap radiasi
pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada
daerah ultraviolet jauh. Bila suatu ausokhrom terikat pada suatu khromofor, maka
pita serapan khromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang (efek
batokromik) dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokromik adalah suatu
pergeseran pita serapan ke panjang gelombang lebih pendek, yang seringkali
terjadi bila muatan positif dimasukkan ke dalam molekul dan bila pelarut berubah
dari non polar ke pelarut polar (Dachriyanus, 2004).
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi
(panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang
dibolehkan (allowed transistion) untuk suatu molekul dengan struktur kimia yag
berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan
demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat
untuk analisa kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang
gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi
Universitas Sumatera Utara
sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisa kuantitatif
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri
ultraviolet:
a. Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisa kuantitatif adalah
panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh
panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan dengan membuat kurva
hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku
pada konsentrasi tertentu.
b. Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara
absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva
kalibrasi berupa garis lurus.
c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,6.
Anjuran ini berdasarkan anggapan pada kisaran nilai absorbansi tersebut
kesalahan
fotometrik
yang
terjadi
adalah
paling
minimal
(Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.2
Hukum Lambert-Beer
Menurut Hukum Lambert, serapan berbading lurus terhadap ketebalan sel
yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus
terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dalam persamaan:
A= a.b.c g/liter atau A= ε.b.C mol/liter
Dimana: A = serapan (tanpa dimensi)
a = absortivitas (g-1 cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
c = konsentrasi (g.l-1)
ε = absortivitas molar (M-1 cm-1)
Jadi, dengan Hukum lambert-Beer; konsentrasi dapat dihitung dari
ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini memberikan serapan larutan 1 %
(b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A = A11.b.C
Dimana: A11 = absorptivitas spesifik (ml g-1 cm-1)
2.2.3
b
= ketebalan sel (cm)
C
= konsentrasi senyawa terlarut (g/100 ml larutan)
Penggunan Spektrofotometri Ultraviolet
Pada umumnya spektrofotometri ultraviolet dalam analisis senyawa
organik digunakan untuk:
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan
ausokhrom dari suatu senyawa organik.
Universitas Sumatera Utara
2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang serapan
maksimum sutau senyawa.
3. Mampu
menganalisis
senyawa
organik
secara
kuantitatif
dengan
menggunakan Hukum Lambert-Beer (Dachriyanus, 2004).
Analisis Kualitatif
Kegunaan spektrofotmetri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat
terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat
mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena
itu
identifikasi
senyawa
yang
tidak
diketahui
tidak
memungkinkan
(Satiadarma, 2002).
Penggunaannya terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan
parameter panjang gelombang puncak absorpsi maksimum, λmax, nilai
absoprtivitas (a), nilai absorptivitas molar (ε), atau nilai ekstingsi (A1 %, 1cm), yang
spesifik untuk suatu senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut dan pH
tertentu (Satiadarma, 2002).
Analisis Kuantitatif
Penggunaan utama spetrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar
analisis kuantitatif. Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai gugus
khromofor dan mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak, penggunaannya
Universitas Sumatera Utara
cukup luas. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10 sampai 20 mcg/ml,
tetapi untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada
konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi
ultraviolet-sinar tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri
ultaviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya
menjadi khromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi khromofor
(Satiadarma, 2002).
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri dapat dilakukan dengan
metode:
1. Metode Regresi
Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan
persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi
standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5
rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan linier,
kemudian di plot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi.
Konsentrasi
suatu
sampel
dapat
dihitung
berdasarkan
kurva
tersebut
(Holme dan Peck, 1983).
2. Metode Pendekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan
serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel.
Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan C= As.Cb/Ab
dimana As= serapan sampel, Ab= serapan standar, Cb= konsentrasi standar, dan
C= konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983).
Universitas Sumatera Utara
2.2.4
Instrumen Spektrofotometer
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau serapan
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Alat ini terdiri dari spektrometer
yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi (Khopkar, 2003).
Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum, monokromator, sel
pengabsorpsi dan detektor.
1. Sumber
Sumber yang biasa digunakan adalah lampu wolfram, tetapi untuk daerah
ultraviolet digunakan lampu hidrogen atau lampu deutrium pada panjang
gelombang 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten
digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara 350-900 nm
(Khopkar, 2003).
2. Monokromator
Digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya
beupa prisma ataupun grating, untuk mengarahkan sinar monokromatis yang
diinginkan dari hasil penguraian (Khopkar, 2003).
3. Sel Absorpsi (Kuvet)
Pada pengukuraan didaerah tampak, kuvet kaca dapat digunakan, tetapi
untuk pengukuran pada daerah ultraviolet kita harus menggunakan sel kuarsa
karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal kuvetnya
adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan.
Sel yang biasa digunakan adalah yang berbentuk persegi, tetapi bentuk silinder
Universitas Sumatera Utara
dapat juga digunakan. Kita harus menggunakan kuvet yang tertutup untuk pelarut
organik (Khopkar, 2003).
4. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang (Khopkar, 2003).
2.3 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi
metode adalah akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi,
linearitas dan rentang.
1. Kecermatan (Akurasi)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil
analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan
ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi dan metode penambahan bahan
baku (Harmita, 2004).
2. Keseksamaan (Presisi)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara
hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika
prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari
campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau
Universitas Sumatera Utara
simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai
keterulangan atau ketertiruan dari prosedur analisis (Harmita, 2004).
3. Selektifitas (Spesifisitas)
Selektifitas (Spesifisitas) adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat
tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektifitas seringkali dapat dinyatakan
sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap
sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis
sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).
4. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Limit (batas) deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan
blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi
merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama
(Harmita, 2004).
5. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon
yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah
pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima
(Harmita, 2004).
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Uraian Bahan
2.1.1 Sifat Fisikokimia
Struktur Kimia:
Rumus Molekul
Nama Kimia
: C16H16ClNO2S
: (α S)- α(2-klorofenil)-6,7-dihidrotieno [3,2-c]
piridin-5(4H)-asam asetat, metil ester.
Berat molekul
: 321,50
Rotasi Optik
: 560
Titik Lebur
: 1840
Pemerian
: Serbuk putih atau hampir putih
Kelarutan
: Praktis tidak larut dalam air, mudah larut dalam
larutan asam dengan pH=1, larut dalam metanol,
sedikit larut dalam metilen klorida dan praktis
tidak larut dalam etil eter (Moffat, 2004).
2.1.2 Farmakologi
Untuk menghambat terjadinya pembentukan bekuan darah sehingga dapat
mencegah terjadinya serangan jantung dan stroke yang diakibatkan dari
penyumbatan
pembuluh
darah
(Ndadari,
2007).
Mengurangi
kejadian
aterosklerosis pada pasien yang ditandai dengan stroke yang belum lama terjadi
Universitas Sumatera Utara
serta mencegah terjadinya infark miokard atau penyakit arteri perifer dan angina
tidak stabil (MIMS, 2009).
2.1.3 Farmakokinetik
Makanan
tidak
secara
signifikan
mengubah
ketersediaan
hayati
clopidogrel. Clopidogrel dengan cepat diserap setelah pemberian dosis oral
berulang yaitu 75 mg, dengan kadar plasma sekitar 35 mg/L dari metabolitnya.
Penyerapan minimal 50% sesuai dengan ekskresi dari metabolit clopidogrel.
Clopidogrel didistribusikan dalam bentuk metabolit aktif dan mengalami
pengikatan dengan protein plasma (94% - 98%). Metabolismenya terjadi dengan
dua cara yaitu melalui hidrolisis menghasilkan metabolit tidak aktif yaitu asam
karboksilat dan dengan bantuan enzim sitokrom P450 sehingga menghasilkan 2oxo-clopidogrel
(metabolit
aktif);
yang
berperan
sebagai
antiplatelet
(Ndadari, 2007). Ekskresi clopidogrel terjadi melalui urin (50%) dan melalui feses
(46%) (Anonim, 2010).
2.1.4 Efek Samping
Perdarahan pada otak dan gastrointestinal (saluran pencernaan), nyeri
abdominal (perut), konstipasi, dan pruritus (ruam atau gatal), infeksi pernafasan
atas, sesak napas, batuk, nyeri dada, udema, neutropenia (menurunnya jumlah sel
darah putih) (Anonim, 2010).
2.1.5 Dosis
Dosis oral untuk orang dewasa: myocardial infarction (MI) dan stroke
yang belum lama terjadi, atau penyakit perifer arteri yang sudah terbukti: satu kali
sehari satu tablet 75 mg. Sindrom koroner akut: dosis muatan 300 mg; diikuti
dengan 1 tablet/hari: 75 mg (dikombinasikan dengan aspirin 75-325 mg, 1
Universitas Sumatera Utara
tablet/hari). Pasien dengan alergi terhadap aspirin, dosis muatan: 300 mg/6 jam;
dosis penjagaan: 50-100 mg/hari (Ndadari, 2007).
2.1.6 Sediaan
Dalam perdagangan, clopidogrel tersedia dalam bentuk tablet salut film
(oral) 75 mg/tablet (Ndadari, 2007).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet
2.2.1 Teori Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang
untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm,
daerah infra merah dekat 780-3000 nm dan daerah infra merah 2,5-4,0 µm atau
4000-250 cm-1 (Ditjen POM, 1995).
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik
aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi atau atom yang
mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut
sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif (Satiadarma, 2004).
Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dan daerah
tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari π→π*, yang menyerap pada λmax
kecil dari 200 nm (tidak terkonjugasi), misalnya pada >C=C< dan -C≡C-.
Universitas Sumatera Utara
Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π
pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konjugasi,
perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Gugus fungsi seperti –OH, -NH2, dan –Cl yang mepunyai elektronelektron valensi bukan ikatan disebut ausokhrom yang tidak menyerap radiasi
pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada
daerah ultraviolet jauh. Bila suatu ausokhrom terikat pada suatu khromofor, maka
pita serapan khromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang (efek
batokromik) dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokromik adalah suatu
pergeseran pita serapan ke panjang gelombang lebih pendek, yang seringkali
terjadi bila muatan positif dimasukkan ke dalam molekul dan bila pelarut berubah
dari non polar ke pelarut polar (Dachriyanus, 2004).
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi
(panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang
dibolehkan (allowed transistion) untuk suatu molekul dengan struktur kimia yag
berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan
demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat
untuk analisa kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang
gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi
Universitas Sumatera Utara
sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisa kuantitatif
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri
ultraviolet:
a. Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisa kuantitatif adalah
panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh
panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan dengan membuat kurva
hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku
pada konsentrasi tertentu.
b. Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara
absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva
kalibrasi berupa garis lurus.
c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,6.
Anjuran ini berdasarkan anggapan pada kisaran nilai absorbansi tersebut
kesalahan
fotometrik
yang
terjadi
adalah
paling
minimal
(Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.2
Hukum Lambert-Beer
Menurut Hukum Lambert, serapan berbading lurus terhadap ketebalan sel
yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus
terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dalam persamaan:
A= a.b.c g/liter atau A= ε.b.C mol/liter
Dimana: A = serapan (tanpa dimensi)
a = absortivitas (g-1 cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
c = konsentrasi (g.l-1)
ε = absortivitas molar (M-1 cm-1)
Jadi, dengan Hukum lambert-Beer; konsentrasi dapat dihitung dari
ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini memberikan serapan larutan 1 %
(b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A = A11.b.C
Dimana: A11 = absorptivitas spesifik (ml g-1 cm-1)
2.2.3
b
= ketebalan sel (cm)
C
= konsentrasi senyawa terlarut (g/100 ml larutan)
Penggunan Spektrofotometri Ultraviolet
Pada umumnya spektrofotometri ultraviolet dalam analisis senyawa
organik digunakan untuk:
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan
ausokhrom dari suatu senyawa organik.
Universitas Sumatera Utara
2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang serapan
maksimum sutau senyawa.
3. Mampu
menganalisis
senyawa
organik
secara
kuantitatif
dengan
menggunakan Hukum Lambert-Beer (Dachriyanus, 2004).
Analisis Kualitatif
Kegunaan spektrofotmetri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat
terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat
mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena
itu
identifikasi
senyawa
yang
tidak
diketahui
tidak
memungkinkan
(Satiadarma, 2002).
Penggunaannya terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan
parameter panjang gelombang puncak absorpsi maksimum, λmax, nilai
absoprtivitas (a), nilai absorptivitas molar (ε), atau nilai ekstingsi (A1 %, 1cm), yang
spesifik untuk suatu senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut dan pH
tertentu (Satiadarma, 2002).
Analisis Kuantitatif
Penggunaan utama spetrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar
analisis kuantitatif. Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai gugus
khromofor dan mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak, penggunaannya
Universitas Sumatera Utara
cukup luas. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10 sampai 20 mcg/ml,
tetapi untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada
konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi
ultraviolet-sinar tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri
ultaviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya
menjadi khromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi khromofor
(Satiadarma, 2002).
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri dapat dilakukan dengan
metode:
1. Metode Regresi
Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan
persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi
standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5
rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan linier,
kemudian di plot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi.
Konsentrasi
suatu
sampel
dapat
dihitung
berdasarkan
kurva
tersebut
(Holme dan Peck, 1983).
2. Metode Pendekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan
serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel.
Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan C= As.Cb/Ab
dimana As= serapan sampel, Ab= serapan standar, Cb= konsentrasi standar, dan
C= konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983).
Universitas Sumatera Utara
2.2.4
Instrumen Spektrofotometer
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau serapan
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Alat ini terdiri dari spektrometer
yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi (Khopkar, 2003).
Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum, monokromator, sel
pengabsorpsi dan detektor.
1. Sumber
Sumber yang biasa digunakan adalah lampu wolfram, tetapi untuk daerah
ultraviolet digunakan lampu hidrogen atau lampu deutrium pada panjang
gelombang 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten
digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara 350-900 nm
(Khopkar, 2003).
2. Monokromator
Digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya
beupa prisma ataupun grating, untuk mengarahkan sinar monokromatis yang
diinginkan dari hasil penguraian (Khopkar, 2003).
3. Sel Absorpsi (Kuvet)
Pada pengukuraan didaerah tampak, kuvet kaca dapat digunakan, tetapi
untuk pengukuran pada daerah ultraviolet kita harus menggunakan sel kuarsa
karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal kuvetnya
adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan.
Sel yang biasa digunakan adalah yang berbentuk persegi, tetapi bentuk silinder
Universitas Sumatera Utara
dapat juga digunakan. Kita harus menggunakan kuvet yang tertutup untuk pelarut
organik (Khopkar, 2003).
4. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang (Khopkar, 2003).
2.3 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi
metode adalah akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi,
linearitas dan rentang.
1. Kecermatan (Akurasi)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil
analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan
ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi dan metode penambahan bahan
baku (Harmita, 2004).
2. Keseksamaan (Presisi)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara
hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika
prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari
campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau
Universitas Sumatera Utara
simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai
keterulangan atau ketertiruan dari prosedur analisis (Harmita, 2004).
3. Selektifitas (Spesifisitas)
Selektifitas (Spesifisitas) adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat
tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektifitas seringkali dapat dinyatakan
sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap
sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis
sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).
4. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Limit (batas) deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan
blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi
merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama
(Harmita, 2004).
5. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon
yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah
pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima
(Harmita, 2004).
Universitas Sumatera Utara