BAHAN DAN METODE Transformasi dan Kokultivasi

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016,321-330

Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra

REGENERASI DAN PERBANYAKAN RUM PUT LAUT

  Kappaphycus alvarezii

HASIL TRANSFORM ASI GEN SUPEROKSIDA DISM UTASE ( M aSOD )

_{*)# **) ***) *)}

Emma Suryati , Hidayah Triana , Utut W idyastuti , dan Andi Tenriulo

_{*) **)}

Balai Pene litian dan Pe ngemb angan Bu didaya Air Payau

_***)

Fakult as Perikanan dan Kelautan, Universita Muslim In done sia

  

Pu sat Pene litian Sumbe rdaya Hayati dan Biot ekno logi dan Departem en Biolo gi, Fakultas Mate matika d an Ilmu

Pen getahuan Alam, Institut Pert anian Bo gor

ABSTRAK

Transformasi gen (MaSOD) p ad a rum put laut m en ggun akan

superoxide dismut ase Kappaphycus alvarezii

Agrobact erium t umefacient telah dilakukan secara in vit ro . Transformasi gen M aSOD ke dalam genom rumput

laut diharapkan dapat mengurangi cekaman oksidat if terutama yang disebabkan oleh perubahan suhu,

salinitas, d an cemaran logam di perairan. Pene lit ian ini be rtu juan un tuk regene rasi ru mpu t laut hasil

introduksi gen M aSOD dan non-t ransge nik pada labu kultu r. Regenerasi dan p erbanyakan rumput laut

hasil transformasi gen M aSOD dilakukan di laboratorium pada labu kultur yang diletakkan dalam “ cult ure

chamber ” yang dilengkapi dengan aerasi menggunakan media kultur yang diperkaya dengan pupuk PES,

Grund, Conwy, dan SSW sebagai kontrol, salinitas 20, 25, 30, 35, dan 40 g/L, pH 4, 5, 6, 7, dan 8. Intensitas

ca h aya a n t a ra 500 -2.000 lu x d e n gan fo t o p e rio d e t e ran g d an ge lap 8:1 6; 12 :12 ; d an 16:8. Un t u k

me rangsan g pe rtu mbuh an eksp lan dilaku kan peme lih araan d engan p enam bah an h orm on t umb uh IAA

dan BAP dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Penelitian dilakukan secara bertahap. Evaluasi transgenik

dilakukan menggunakan teknik PCR. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa sintasan yang paling tinggi

diperoleh menggunakan media PES (94%), salinitas 30 g/L (90%), pH 7 (96%), intensitas cahaya pada 1.500

lux (80%), fotoperiode 12:12 (84%), komposisi ZPT dengan campuran IAA dan BAP dengan perbandingan

2:1. Hasil analisis PCR memperlihatkan K. alvarezii transgenik putatif mengandung transgen M aSOD sebanyak

78% dari hasil transformasi.

  Kappaphycus alvarezii M aSOD KATA KUNCI: regenerasi; ; gen ; cekaman lingkungan ABSTRACT: Regeneration and multiplication of seaweed

  Kappaphycus alvarezii transformed Superoxide dismutase (M aSOD) gene. By: Emma Suryati, Hidayah Triana, Utut W idyastuti, and Andi Tenriulo

  

Superoxide dismut ase t ransformat ion (M aSOD) gene of seaweed Kappaphycus alvarezii mediated by Agrobacterium

tumefacient has been successfully done in vit ro. M aSOD genes int roduced int o t he seaweed genome is expect ed t o

reduce oxidat ive st ress caused by environment al condit ions such as changes in t emperat ure, salinit y and met al

cont aminat ion of the wat er. This study aimed t o regenerat e bot h t he M aSOD t ransformed seaweed and non-transgenic

in a cult ure flask. Regenerat ion and mult iplicat ion of t hose seaweed were conduct ed in a laborat ory flask cult ures

placed in a “ cult ure chamber ” which was aerat ed and enriched wit h fert ilizers PES, Grund, Conwy, and SSW as a

cont rol, salinit y 20, 25, 30, 35, and 40 g/L, pH: 4, 5, 6, 7, and 8. t he light int ensit y bet ween 500-2000 lux, wit h light

and dark phot operiod 8:16; 12:12; and 16:8. To st imulat e t he growt h of explant s t he addit ion of growt h hormone

  

IAA and BAP wit h rat ios of 1:1, 1:2 and 2:1 were performed. This st udy was a mult iple-st ep of process, by which

t ransgenic explant s was identified by PCR met hod. The result s showed t hat t he highest survival rat e was obt ained using

media PES (94%), salinit y 30 g / L (90%), pH= 7 (96%), t he int ensit y of light at 1500 lux (80%), phot operiod= 12: 12

(84%), and rat io of IAA and BAP 2: 1. The result s of PCR analysis showed t he put at ive K. alvarezii transgenic M aSOD

was 78% of explant s.

  KEYW ORDS: regeneration; _# Kappaphycus alvarezii; M aSOD genes; environmental stress Ko r esp o n d e nsi: Balai Pe n elit ian d an Pe ng e m b an gan Bu d id aya Air Payau . Jl. Makm u r Dg . Sit akka No . 12 9 , Mar o s 9 0 51 2 ,

  Su lawesi Se lat an , In d o n e sia. Te l. + (0 4 1 1 ) 3 7 1 5 4 4 emmasur yati @ yahoo.com

  E-m ail: Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534

  Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Regenerasi dan perbanyakan rumput laut Kappaphycus alvarezi ..... (Emma Suryat i) PENDAHULUAN

  ., 2015). Penelit ian ini bert ujuan unt uk melakukan regenerasi rumput laut hasil t ransfo rmasi gen

  M aSOD

  ) pada rumput laut

  K. alvarezii

  t elah berhasil dilakukan melalui mediasi menggunakan bakt eri

  Agrobact erium t umefaciens

  , sert a dapat t erint egrasi pada plant et dan anakan rumput laut

  K. alvarezii

  (Triana

  et al ., 2016).

  Namun regenerasi rumput laut hasil t ransfo rmasi ini belum berhasil t umbuh dengan baik di labo rat o rium, m a u p u n a k lim a t is a s i p a d a la b u k u lt u r d a n b a k re sirku lasi.

  Ke mat ian e ksplan hasil t ransfo rm asi gen sering t erjadi pada pada t ahap aklimat isasi pada labu kult ur maupun pada bak resirkulasi. Beberapa paramet er yang berpengaruh terhadap sintasan rumput laut ant ara lain salnit as, p H, p en et rasi cahaya, rasio ge lap t e rang, pupuk, serta kombinasi zat pemacu t umbuh (ZPT) yang diperlukan dalam pert umbuhan rumput laut (Sur yat i

  et al

  M aSOD

  et al ., 2015).

  pad a ru mput lau t K. alvaezii d an rump ut laut no n- t ransgenik pada media kult ur yang diperkaya dengan pupuk dan ko mpo sisi ZPT yang berbeda.

  BAHAN DAN M ETODE Transform asi dan Kokultivasi

  Rumput laut yang digunakan unt uk t ransfo rmasi gen M aSOD merupakan rumput laut hasil seleksi yang dipero leh dari Kabupat en Takalar, Sulawesi Selat an. Riset dilakukan di Labo rat o rium Balai Penelit ian dan Pengembangan Budidaya Air Payau, Maro s.

  Tr a n s fo r m a s i g e n M a SOD p a d a r u m p u t la u t

  K. alvar ezi i

  d ila ku k an m e n gik u t i m e t o d e Ch e n e y (2 0 0 0 ). Me t o d e t r an s fo r m a si d ila ku k a n d e n g a n m e d ia si Agr o b a ct e riu m LB 4 4 0 4 yan g m e m b a wa vekt o r e ksp re si pGWB5 (Han n um , 2 01 2). Tahapan t ransfo rmasi adalah: penginfeksian, ko -kult ivasi, dan r

  ecover y

  . Tr a n s fo r m a s i m e n g g u n a k a n e k s p la n

  K. alvarezii

  0,5 cm; dilukai menggunakan jarum st eril, kemudian direndam dalam media infeksi yang berisi

  A. t umefaciens

  LB-4 4 04 d an 10 0 µ M aset o sirin go n se lam a 3 0 m e n it d e n gan p e n ggo yan gan . Eksp lan dikerin gkan den gan t isu st e ril dan dipindah kan ke m e d ia k o -k u lt iva s i (m e d ia PES d a n 1 0 0 µ M aset o siringo n) selama t iga hari di ruang gelap. Eksplan hasil ko -kult ivasi dicuci dengan cefo t axim 200 mg/L, dibilas dengan air laut st eril sebanyak t iga kali. Eksplan dikeringkan di at as t isu st eril, kemudian dipindahkan ke media

  recovery

  Transfo rmasi gen supero ksida dismut ase (

  ., 2015; Sur yat i

  Rum p ut lau t

  Ag r obact er i u m t u m ef i ci encen s

  K. alvarezii

  me rup akan salah sat u komo dit as unggulan penghasil karaginan yang banyak dimanfaat kan dalam indust ri kert as, t ekst il, fo t o grafi, past a, d an pen galengan ikan. Bu did aya

  K. alvar ezii

  m am p u me n jad i ku n ci pe m b e rd ayaan m asyarakat pesisir, peningkat an usaha budidaya di t ingkat pet ani m e m acu p e n in gk at an se d iaa n b e n ih u n ggu l b aik kualit as maupun kuant it asnya. Selain it u, permint aan pasar dunia masih sangat t inggi (Co llen , 1995; FAO, 2010).

  Kendala yang sering dihadapi pembudidaya dalam ran gka p e n in gkat a n p ro d u ksi a d alah t e rb a t asn ya ket ersediaan bibit yang berkualit as t inggi, lemahnya ket ahanan t erhadap penyakit

  ice-ice

  , sert a kurangnya k e t ah an an t e rh ad ap ce ka m a n lin gk u n g an b io t ik maup un abio t ik yang serin g t e rjangkit pada lah an bu didaya. Ke t ersediaan bib it yang be rku alit as baik sa n ga t d ip e n g ar u h i o le h m u sim , s alin it as , su h u , int ensit as cahaya, sert a ko ndisi lingkungan perairan yang digunakan unt uk membudidayakan rumput laut (Yuliant o & Mira, 2009; Mambo ya, 2007).

  Dalam rangka meningkat kan dan mempert ahankan pro duksi rumput laut nasional perlu dilakukan upaya- upaya unt uk mengat asi permasalahan pada budidaya, an t ara lain me nuru nnya mu t u genet ik rumpu t laut yan g diseb ab kan ad anya se ran gan p en yakit , se rt a perubahan mut u lingkungan yang ekst rem (Largo

  et al

  ., 1 99 7; Vairap pan, 2 006 ). Upaya yang d ilakukan ant ara lain melalui po la t anam, t eknik budidaya, dan penyediaan bibit yang baik ant ara lain kult ur jaringan, s e rt a p e n d e k a t a n t e kn o lo gi b io m o le k u le r yait u rekayasa genet ik melalui t ransfo rmasi gen po t ensial ya n g d a p a t m e n in g k a t k a n k e t a h a n a n , s e r t a m em pe rbaiki ge n dari ru m pu t lau t (Ch e ne y

  et al

  ., 2 0 0 0 ). Be b e r a p a p e n e lit i t e la h m e n g g u n a k a n

  s e b a g a i p e r a n t a r a t ransfo rmasi, sepert i yan g dilakukan o leh Cheng

  et al

  et al

  . (2011).

  Perbaikan mut u genet ik pada rumput laut t elah dirint is sejak tahun 2010 melalui kerja sama penelit ian ant ara Balai Penelit ian dan Pengembangan Budidaya Air Payau (BPPBAP), Maro s dengan Pusat Ant ar Uni- versit as, Inst it ut Pert anian Bo go r (PAU-IPB). Info rmasi yang dipero leh ant ara lain lain int ro duksi gen GFP di b awah re gu lasi p ro m o t e r se h in gga m e n gh asilkan t r a n s g e n ik r u m p u t la u t s a m p a i t a h a p fila m e n (Rajam u d d in et al ., 2 0 1 4 ), k lo n in g g e n p e n ya n d i karaginan, merakit vekt o r ekspresi, sert a int ro duksi gen karaginan rumput laut

  K. alvarezii

  (Rajamuddin

  et al

  . , 2 0 1 6 ), s e r t a t r a n s fo r m a s i g e n la in u n t u k m e n in g k a t k a n k e t a h a n a n t e r h a d a p c e k a m a n lingkungan ant ara lain gen

  PaCS

  (Daud

  et al

  ., 2013; Sur yat i et al ., 2 014), gen liso zim (Handayani et al ., 2014), gen met halo t hio nin t ype-II (

  M amt 2

  ) (Fajriah

  (PES t anpa aset o siringo n) selama t ujuh hari, kemudian dikult ur pada media seleksi yang t erdiri at as air laut st eril dengan PES dan hygro mycin

  reverse (10 pmol/µL); 2 µL 1x bufer PCR; 2 µL dNTPmix; 0,2 µL Tag Po lym e r as e d a n

  hasil t ransformasi gen

  dit ambah dengan ddH ₂ O hingga vo lume t o t al reaksi

  menjadi 20 µL. Analisis dilakukan dengan kondisi PCR:

  pra PCR 95°C, lima menit ; denat urasi 94°C, 30 det ik; penempelan primer 60°C, 30 det ik; pemanjangan 72°C, 30 det ik; dan reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus; dan diakhiri dengan pasca PCR 20°C selama 10 menit . Hasil PCR d ie lekt ro fo resis men ggunakan 1 % gel agaro sa pada 100 vo lt selama 28 menit . Gel divisualisasi di at as UV t ransluminat o r set elah diwarnai dengan gel red .

  HASIL DAN BAHASAN

  Re g e n e r a s i r u m p u t la u t

  K. a l va r ezi i

  h a s il t r an s fo r m a si g e n

  M aSOD

  d a n r u m p u t la u t n o n - t ransgenik pada media kult ur air laut st eril, dan air lau t st eril yan g d ip e rkaya de ngan p up u k

  provasoli enr i ch seaw a t er

  (PES), Gr u n d d a n Co n w y memperlihat kan sint asan berbeda (Gambar 1). Pada rumput laut

  K. alvarezii

  M aSOD

  dan

  memperlihat kan sint asan paling t inggi (94%), yait u pada media yang diperkaya dengan pupuk PES, n am u n t id ak b e r b e d a n yat a d e n g an m e d ia yan g diperkaya dengan pupuk Grund (80%), berbeda nyat a dengan SSW (30%), dan media yang diperkaya dengan Co nwy (25%) (P< 0,05). Pada rumput laut

  K. alvarezii

  no n-t ransgenik sint asan yang paling t inggi pada me- dia yang diperkaya dengan pupuk Grund (86%) namun t idak berbeda dengan media yang diperkaya dengan pupuk PES (75%), berbeda nyat a dengan SSW (20%) dan pupuk Co nwy (35%) (Gambar 1). Dari hasil yang d ip e r o le h m e m p e r lih a t k a n a d a n ya p e r b e d a a n kebut uhan nut rien dari eksplan rumput laut

  K. alvarezii

  hasil t ransfo rmasi gen

  M aSOD

  dan rumput laut no n- t ransgenik, pada t ransfo rmasi sebelumnya ant ara lain pada t ransfo rmasi gen

  MaMt

  , dan

  lisozim

  sint asan yang paling o pt imal dan cenderung lebih baik pada media PES (Sur yat i et al ., 2014). Hal ini kemungkinan t erjadi karena adanya pro ses adaptasi selama di labo rat o rium menggunakan media PES selama pro ses t ransfo rmasi gen pada rumput laut

  K. alvarezii

  mulai pada t ahap mediasi hingga pada pro ses reco veri sehingga eksplan t eradapt asi pada ko ndisi yang sama. Selain it u, juga disebabkan dari kebut uhan nut rien pada rumput laut dapat dipenuhi o leh nut rien yang berada pada media yang diperkaya dengan PES dan Grund, karena eksplan yang digunakan memang diadaptasi pada media dengan pupuk yang sama sehingga dapat tumbuh dengan baik.

• R2 (5’-CATCTCCAACGGTGACATTG- 3') (Hannum, 2012). Campuran reaksi yang digunakan

  Foward

  Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016,321-330

  ), yait u: 1) kult ur cair pada bo t o l kult ur vo lume 200 mL yang dilet akkan p a d a

  1 0 m g/L se lam a 1 4 h ari. Se t e lah se le ksi, e ksp lan dipindahkan ke media pemulihan selama 14 hari (Triana

  et al ., 2016).

  Regenerasi dan Perbanyakan Rum put Laut Hasil Transgenik

  Eksplan hasil t ransfo rmasi gen

  M aSOD

  dan eksplan t a n p a t r a n s fo r m a s i n o n -t r a n s g e n ik (k o n t r o l) dit umbuhkan pada media PES hingga menjadi tanaman muda (planlet ) mengacu pada met o de Sulist iani

  et al .

  (2012); Reddy

  et al

  . (2003); dan Wu

  et al

  . (2006). Eksplan d ik u lt u r p ad a d u a t a h ap an re ge n e rasi (ke d u a n ya dilakukan secara asept ik dan

  in vit ro

  sh ak er

  primer

  g o ya n g s e la m a p e m e lih a r a a n , menggunakan media kult ur PES. Set iap bo t o l diisi 20 eksplan, selama pemeliharaan dilakukan pergant ian m e d ia set iap sat u m in ggu . Ke m u d ian d ilan ju t kan dengan aklimat isasi pada bo t o l kult ur dengan vo lume sat u lit er yang dilet akkan pada ‘

  cult ure chamber ’

  dan diberi aerasi dengan jumlah eksplan masing-masing 100 eksplan/bo t o l. Selanjut nya aklimat isasi dilakukan p a d a b a k re s ir k u la s i d e n g a n vo lu m e 5 0 L ya n g dilengkapi dengan aerasi jumlah plant et hingga 300 eksplan pada set iap bak.

  Da la m r a n g k a o p t im a s i m e d ia p e m e lih a r a a n dilakukan melalui seleksi pupuk antara lain pupuk PES, Gru n d, Co n wy, d an SSW se b agai ko n t ro l, de n gan salinit as 20, 25, 30, 35, dan 40 g/L. Selanjut nya kisaran pH yang digunakan yait u 4, 5, 6, 7, dan 8. Int ensit as c a h a ya b e r k is a r a n t a r a 5 0 0 -2 . 0 0 0 lu x d e n g a n

  phot opheriod t erang dan gelap 8:16; 12:12; dan 16:8.

  Unt uk merangsang pert umbuhan eksplan dilakukan pemeliharaan dengan penambahan ho rmo n t umbuh

  IAA dan BAP dengan beberapa perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Penelit ian dilakukan menggunakan rancangan acak dengan lima ulangan unt uk ke-6 paramet er yang s e c a r a b e r t a h a p u n t u k m e n g u r a n g i b ia s p a d a pengamat an masing-masing paramet er. Pengamat an dilakukan selama delapan minggu dengan interval sat u minggu meliput i sint asan dan laju pert umbuhan. Dat a yan g d ip e ro le h d ian alisis m e n ggu n a kan so ft ware st at ist ik versi 3.0 pada P= 0,05.

  Ident ifikasi Eksplan Transgenik

  Sebanyak 0,1 g t unas put at if yang t umbuh set elah p e m e lih araan p ad a b ak re sirku lasi, diiso lasi DNA menggunakan met o de Wat t ier

  et al

  . (2000). DNA hasil isolasi selanjut nya dianalisis PCR dengan menggunakan prim er M mSOD -F1 (5'-ATG GTGAAGGCTGTGGTTGT- 3‘) dan

  M mSOD

  adalah 100 ng DNA genom; 0,5 µL masing-masing

  Salinit as merupakan fakto r pembatas pada sintasan rumput laut pada umumnya, khususnya pada eksplan rumput laut hasil t ransfo rmasi. To leransi kemampuan hidup rumput laut K. alvarezii berkisar pada salinit as 20-40 g/L, namun sint asan eksplan t ransgenik yang t ertinggi dipero leh pada salinitas 30 g/L, berbeda nyat a Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Regenerasi dan perbanyakan rumput laut Kappaphycus alvarezi ..... (Emma Suryat i)

  dengan salinit as 20 dan 40 g/L, namun t idak berbeda nyat a dengan 25 dan 35 g/L, sedangkan pada eksplan no n-t ransgenik t ert inggi pada 30 g/L t idak berbeda dengan 35 g/L, berbeda dengan 20, 25, dan 40 g/L (Gambar 2).

  40

  Gambar 2. Sint asan eksplan rumput laut

  Kappaphycus alvarezii

  yang diint ro duksi gen

  M aSOD

  dan rumput laut no n-t ransgenik yang dipelihara pada salinit as yang berbeda (Ket erangan: T= t ransgenik; NT= no n-t ransgenik)

  

Figure 2. Survival rat e of seaweed Kappaphycus alvarezii explant int roduced wit h M aSOD gene and

non-t ransgenic seaweed cult ivat ed in various salinit y condit ions (Not e: T= t ransgenic; NT= non-t ransgenic)

  ab ab a ab b b b a ab b

  10

  20

  30

  50

  S u rv iv a l ra te (% )

  60

  70

  80

  90 100

  20

  25

  30

  35

  40 S

  in ta sa n

  S u rv iv a l ra te (% )

  Pupuk ( Fert ilizer ) T NT

  S in ta sa n

  Hal ini sangat erat dengan fisio lo gi penyerapan dan sirkulasi nu t rie n p ada ru m pu t laut seh ingga p ad a sa lin it a s ya n g le b ih re n d ah m au p u n t in gg i ak an mengakibat kan kemat ian pada rumput laut . Penyakit

  provasoli enrich seawat er

  ice-ice serin g kali t e rjadi karena adanya p erub ah an

  salinit as yang drast is biasanya pada musim pancaro ba atau peralihan musim penghujan ke musim kering atau s e b a lik n ya , d i s a m p in g p e n g a r u h d a r i k o n d is i lingkungan baik fisika, kimia, maupun secara bio lo gi. Gambar 1. Sint asan eksplan rumput laut

  Kappaphycus alvarezii

  yang diint ro duksi dengan gen

  M aSOD

  (T), dan

  K. alvarezii

  no n-t ransgenik (NT) pada media yang diperkaya dengan pupuk berbeda (Ket erangan: SSW (

  st eril sea wat er

  ); PES (

  ); Grund, dan Co nwy)

  SSW PES Grund Conwy

  

Figure 1. Survival rat e of seaweed K. alvarezii explant introduced with M aSOD gene and non-t ransgenic

seaweed complement ed wit h various fert ilizers (not e: T= Transgenic; NT= non-t ransgenic) (Not e: SSW (st eril sea wat er), PES (provasoli enrich seawat er); Grund, and Conwy)

  b a ab b b ab a b

  10

  20

  30

  40

  50

  60

  70

  80

  90 100

  Salinit as ( Salinit y ) (g/L) T NT Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016,321-330

  Pada salinit as 30 g/L memperlihat kan sint asan paling t inggi baik pada rumput laut t ransgenik maupun no n- t r a s g e n ik , h a l in i b e r h u b u n g a n d e n g a n p r o s e s keset imbangan senyawa kimia di dalam air laut , yang e r a t h u b u n g a n n ya d e n g a n s is t e m o s m o s a d a n p e n ye rap an n u t rie n t e rse b u t m e lalu i d in d in g se l rumput laut (Ro mimo ht art o & Juwana, 2002). pH pada media kult ur merupakan salah sat u fakt o r penent u keberhasilan pada pemeliharaan rumput laut

  60

  M aSOD

  dan rumput laut non-t ransgenik yang dipelihara pada media kult ur dengan pH yang berbeda (Ket erangan: T= t ransgenik; NT= no n-t ransgenik)

  

Figure 3. Sur vival rat e of seaweed K. alvarezii explant int roduced wit h M aSOD gene and non-

t ransgenic seaweed cult ivat ed in various pH condit ions (Not e: T= t ransgenic; NT= non- t ransgenic)

  b ab ab a a b b a a ab

  20

  40

  80 100 120

  

K. alvarezii

  4

  5

  6

  7

  8 S

  in a ta sa n

  S u rv iv a l ra te (% )

  yang diint ro duksi dengan gen

  Gambar 3. Sint asan eksplan rumput laut

  K. alvarezii baik di labo rat o rium maupun di lapangan,

  et al ., 2015).

  karena penyerapan nutrien dari media t ergant ung dari derajat keasaman dari lingkungan yang ada dan akan t e r ja d i k e s e im b a n g a n d a la m p e n ye r a p a n . Ha s il pengamat an pH pada media pemeliharaan

  K. alvarezii di labo rat o rium diperlihat kan pada Gambar 3.

  Pada rumput laut

  K. alvarezii

  yang hidu p di laut kisaran pH yang dapat dit erima bisa mencapai pH: 9, n a m u n p a d a p e m e lih a r a a n r u m p u t la u t h a s il t ra n s fo r m a si ge n

  M aSOD

  d a n n o n -t ra n sg e n ik d i lab o rat o riu m m e m p e rlihat kan re sp o n s yan g agak berbeda, memperlihat kan sint asan yang paling t inggi pada pH dengan kisaran 6-8 (Gambar 3). Pada rumput laut t ransgenik sint asan yang paling t inggi pada pH 6 (96%) dan 8 (85%) t idak berbeda dengan pH 5 (50%) dan 6 (65%), t api berbeda nyat a dengan pH 4 (15%). Sedangkan pada rumput laut no n-t ransgenik sint asan p aling t in ggi pad a p H 6 -7 (85 %-90 %) n am u n t idak b e r b e d a d e n g a n p H 8 (5 5 %). Pe r b e d a a n in i ke mu ngkinan karena adan ya pro se s adapt asi pada k o n d is i m e d ia k u lt u r s e la m a p e m e lih a r a a n d i la b o rat o r iu m , s e r t a ko n d isi ru m p u t lau t se t e lah t ran sfo rm asi gen M aSOD yan g me nyebabkan leb ih t o leran t erhadap perubahan pH pada media. Hal ini berbeda dengan pH o pt imum pada rumput laut hasil t ransfo rm asi ge n karaginan yang me nun jukkan pH o pt imum pada pH= 6 dengan sint asan mencapai 85% (Sur yat i

  Int en sit as cahaya d ip erlu kan un t u k fo t o sint esa pada t umbuhan termasuk pada rumput laut

  masih mampu bert ahan hidup pada kisaran int ensit as t ersebut, sedangkan pada rumput laut no n-t ransgenik lebih mudah t erjadi kemat ian pada eksplan. Sangat berbeda dengan ko nd isi budidaya di laut pen et rasi cahaya bisa mencapai 3.000 lux namun peningkat an suhu di laut kemungkinan lebih ko nst an, sert a ada penet rasi dari lingkungan sekitar sehingga rumput laut yang dibudidayakan masih dapat bert ahan hidup pada ko ndisi se pert i it u.

  K. alvarezii .

  Pa d a r u m p u t lau t h asil t ran s fo r m asi ge n

  M aSOD

  ko ndisi sintasan yang paling tinggi pada 1.500 lux (80%) t id ak b e rb e da n yat a d en gan 1 .0 0 0 lu x (50 %), t ap i berbeda nyat a dengan 500 lux (35%) dan 2.000 lux (25%). De m ikian ju ga p ad a ru m p u t la u t n o n -t ran sge n ik memperlihatkan sint asan paling t inggi pada intensit as 1 .5 0 0 lu x (7 6 %), n a m u n b e r b e d a n ya t a d e n g a n int ensit as 500 lux, 1.000 lux, dan 2.000 lux (Gambar 4 ). Te rlih at p ad a ru m p u t lau t t ran sge n ik

  M aSOD

  , memperlihat kan pert umbuhan bibit yang cukup bagus dibandingkan dengan rumput no n-t ransgenik kisaran int ensit as cahaya pada rumput laut t ransgenik lebih luas dibandingkan dengan rumput laut no n-transgenik. Sehingga rumput laut hasil t ransfo rmasi gen

  M aSOD

  pH T NT Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Regenerasi dan perbanyakan rumput laut Kappaphycus alvarezi ..... (Emma Suryat i)

  Pe net rasi cah aya pada bud idaya ru mpu t laut K.

  

Figure 4. Survival rat e of seaw eed K. alvarezii explant int r oduced wit h M aSOD gene and non-

t ransgenic seaweed cult ivat ed wit h various light int ensit y condit ions (Not e: T = t ransgenic; NT = non-t ransgenic)

  S u rv iv a l ra te (% )

  S in ta sa n

  90 500 1000 1500 2000

  80

  70

  60

  50

  40

  30

  20

  10

  b ab a b b b a b

  dan rumput laut no n-t ransgenik yang dipelihara dengan penet rasi cahaya yang berbeda (Ket erangan: T = t ransgenik; NT = no n-t ransgenik)

  alvarezii

  M aSOD

  yang diint ro duksi dengan gen

  

K. alvarezii

  rum put lau t , cah aya akan d ise rap m elalui m o le kul klo ro fil dan ke m u d ian d iku m p u lk an p a d a p u sat -p u sat re ak si. Gambar 4. Sint asan eksplan rumput laut

  t halus

  Da la m p r o s e s fo t o s in t e s is , r e a k s i t e r a n g merupakan pro ses yang pada akhirnya menghasilkan ATP juga NADPH2. Dalam rekasi ini diperlukan mo lekul air. Pro ses reaksi t erang dimulai dengan menangkap fo t o n ya n g d ilaku kan o le h p ig m e n klo ro fil ya n g be rpe ran sebagai ant e na. Pada

  yang paling t inggi pada rasio t erang gelap L:D= 1 2:12 (84 %) sama dengan dengan perlakuan L:D= 16:8 (80%), berbeda dengan perlakuan L:D= 8:12 (20%), demikian juga pada rumput lau t n o n -t ra n sg e n ik sin t a sa n p alin g t in gg i p ad a perlakuan L:D= 12:12 (80 %), namun t idak be rbeda nyat a dengan perlakuan L:D= 16:8 (50%), dan berbeda nyat a dengan perlakuan L:D= 8:16 (40%) (Gambar 5).

  M aSOD

  Pro s e s fo t o s in t e sis p a d a r u m p u t la u t , se lain tergantung pada intensitas cahaya juga t ergantung pada lam an ya pe m aparan , se rt a rasio t e ran g d an ge lap cahaya yang digunakan. Sint asan eksplan rumput laut hasil t ransfo rmasi gen

  et al ., 2002).

  6H ₂ O + 6CO ₂ + cahaya  C ₆ H ₁₂ O ₆ (gluko sa) + 6O ₂ Tum bu han yan g me laku kan p ro se s fo t o sin t e sis memerlukan bantuan cahaya mat ahari. Mereka mampu menyerap cahaya t ersebut sebab mereka memiliki zat hijau daun at au klo ro fil. Cahaya mat ahari selanjut nya akan melewat i lapisan epidermis yang t anpa warna kemudian melaju menuju meso fil. Pro ses fo t o sint esis ini terdiri at as dua rangkaian reaksi yakni reaksi terang dan juga reaksi gelap. Dinamakan reaksi t erang sebab p r o s e s n ya m e m b u t u h k a n ca h aya . Da la m p r o s e s fo t o sint esis, reaksi t erang meru pakan p ro se s yang pada akhirnya menghasilkan ATP juga NADPH2. Dalam reaksi ini diperlukan mo lekul air. Fo t o sint esis dimulai pada saat cahaya mulai mengio nisasi mo lekul klo ro fil d an k e m u d ia n t e r ja d i p e le p a sa n e le kt r o n . Pad a t u mb uhan sen diri, reaksi b io kim ia in i akan t erjadi siklu s calvin d i man a karb o n d io ksid a akan d iikat dengan tujuan membentuk ribose dan lebih lanjut akan menjadi glu ko sa. Reaksi ini t id ak bergant ung pada ada at au t idaknya cahaya mat ahari. Pro ses fo t osint esis p ad a ru m p u t lau t d ap at b e rlan gsu n g d e n gan laju maksimal jika unsur-unsur pendukungnya t erpenuhi yakni ant ara lain: cahaya, konsentrasi karbo ndio ksida, suhu, kadar air (Ro mimo ht art o

  Adapun persamaan reaksi yang t erjadi dalam proses fo t o sint esis adalah sebagai berikut :

  di lab o rat o riu m sangat d ipe rlukan d alam rangka membant u pro ses fo t o sint esis pada rumput laut yang dipelihara. Pro ses fo to sint esis pada terdapat pada t umbuhan hijau t ermasuk rumput laut bersifat aut o t ro f yakni bisa menyusun makanannya sen diri. Melalui t halus rumput laut menyerap mo lekul karbo n dio ksida juga air dalam rangka menghasilkan gula dan juga o ksigen. Kedua senyawa t ersebut kemudian akan d igu n akan s e b agai p e n yo ko n g p e rt u m b u h an n n ya (Ro mimo ht art o & Juwana, 2002).

  Int ensit as cahaya ( Light int encit y ) T NT Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016,321-330

  Fo t o s in t e s is d im u la i p a d a s a a t ca h a ya m u la i mengio nisasi mo lekul klo ro fil dan kemudian t erjadi pelepasan elektro n. Sementara it u, apa yang dimaksud dengan reaksi gelap adalah pro ses di mana ATP dan juga NADPH yang dihasilkan dalam pro ses sebelumnya kemudian menghasilkan sejumlah pro ses at au reaksi bio kimia. Reaksi bio kimia ini merupakan siklus calvin di mana karbo n dio ksida akan diikat dengan t ujuan m em b e nt u k ribo se d an leb ih lanju t akan me n jad i gluko sa, n amu n reaksi in i t id ak b e rgan t un g pad a cahaya mat ahari (Ro mim o ht art o

  20

  Gambar 5. Sint asan e ksp lan rum p u t laut

  Kappaphycus alvar ezii

  yan g d iin t ro d u ks i d e n g an ge n

  M aSOD

  d an ru m p u t la u t n o n - t ran sgen ik d e n gan p erb an d in gan t e ran g d an ge lap yan g berbeda (Ket erangan: T= t ransgenik; NT= no n-t ransgenik)

  

Figure 5. Sur vival rat e of seaw eed Kappaphycus alvarezii explant int ro-

duced wit h M aSOD gene and non-t ransgenic seaweed wit h vari- ous dark to light rat ios (Not e: T= t ransgenic; NT= non-transgenic)

  b a a b a ab

  10

  30

  M m SOD -R2

  40

  50

  60

  70

  80

  90 8:16 12:12 16:08

  S in ta sa n

  S u rv iv a l ra te (% )

  memperlihat kan adanya pit a pada 456 pb pada sampel P, merupakan sampel po sit if yang diiso lasi dari plas- mid, kemudian dari sampel 1, 2, 3, dan 4 merupakan

  d a n

  et al

  M aSOD

  ., 2002 ). Pada rumput laut hasil t ransfo rmasi gen M aSOD sint asannya lebih baik pada rasio 16:8, dibandingkan pada rasio 8:16 hal ini erat hubungnnya dengan pro ses t ransfer elekt ro n pada pro t o sint esis, di mana pada gen M aSOD memiliki ko -enzim yang mampu melakukan t ransfer elekt ro n lebih baik dibandingkan dengan rumput laut no n-t ran sgenik.

  Pengaruh ZPT pada pemeliharaan rumput laut K.

  alvarezii

  d iin t ro d u ksi d e n gan ge n

  M aSOD

  yan g d i la b o r a t o r iu m m e m b e r ik an r e s p o n s yan g p o sit if t erhadap pert umbuhan dan sintasan eksplan ZPT yang digunakan antara lain dari golo ngan auxin dan sito kinin yait u IAA dan BAP yang di campur dalam beberapa perbandingan yait u ko mbinasi IAA dan BAP dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1 (Gambar 6).

  Unt uk memacu pert umbu han t unas pada kult ur jaringan rumput laut K. alvarezii dilakukan pada media PES yang diperkaya dengan penambahan ZPT ant ara lain dari golongan auksin dan sitokinin yait u kombinasi

  IAA d en gan BAP d ap at m e ningkat kan ke mamp uan u n t u k b e r t u m b u h d a n b e re g e n e r a s i (Su r ya t i & Mulyaningrum, 2009). Hasil analisis memperlihat kan sintasan rumput laut K. alvarezii yang diint ro duksi gen

  yang paling baik yait u pada media PES yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 1 :1 , b e rb e d a n yat a d e n gan ko n t ro l, n am u n t id ak berbeda dengan perbandingan 1:1, dan 2:1, demikian juga kontrol tidak berbeda nyata dengan perbandingan 1 :2 d an 2 :1 (Gam b a r 6 ). Hal in i b e rb e d a d e n gan p e r b an yakan ru m p u t lau t h as il t ran s fo rm asi ge n karagin an yan g o p t im al p e rt u m b u h an n ya d e n gan p e n am b ah an ZPT d e n gan cam p u ran IAA d an BAP dengan perbandingan 2:1 (Sur yat i et al ., 2015).

  M m SOD -F1

  Pad a aklim at isasi ru m pu t lau t

  K. alvarezii

  yan g diint ro duksi dengan gen

  M aSOD

  dilakukan pada labu kult ur yang dilet akkan pada kult ur

  chamber

  , kemudian d ila n ju t kan p ad a b ak re sirku lasi yan g d ile n g kap i de ngan ae rasi unt uk me macu pe nye rapan n ut rie n, sert a pert umbuhan anakan rumput laut .

  Ident ifikasi Eksplan Transgenik M aSOD

  Hasil analisis PCR unt uk ko nfirmasi rumput laut t r a n s g e n ik d is a jik a n p a d a Ga m b a r 8 . PCR m e n ggu n aka n p r im e r

  Perbandingan gelap t erang ( Dark t o light rat io ) T NT

  Regenerasi dan perbanyakan rumput laut Kappaphycus alvarezi ..... (Emma Suryat i)

  45 IAA:BAP= 1:2

  40 IAA:BAP= 1:1

  y) a

  35 IAA:BAP= 2:1

  /d %

  30

   (

  No n ZPT= Cont rol

  R G

  25 D

  / )

  20

  ri a /h

  15

  % (

  10 H

  P L

  5 I

  II III

  IV V

  VI VII

  VIII Mingggu ke - ( Week t o )

  K.alvarezii

  Gambar 6. Laju Pert umbuhan harian (LHP) eksplan rumput laut hasil t ransfo rmasi gen M aSOD pada media yang diperkaya ZPT dengan ko mbinasi IAA dan BAP yang berbeda, sert a ko nt ro l= t anpa penambahan ZPT.

  

Figure 6. Daily growt h rat e of seaweed K.alvarezii explant t ransformat ion wit h M aSOD gene in

enriched media wit h combinat ion of IAA and BAP are different rat io and not PGR as cont rol

  Gambar 7. Aklimat isasi anakan rumput laut K. alvarezii yang diint ro duksi dengan gen M aSOD dan rumput laut no n-t ransgenik pada bak resirkulasi yang dilengkapi dengan aerasi

  

Figure 7. Acclimat izat ion of seaweed K. alvarezii int roduced wit h M aSOD gene and non-t ransgenic

seaweed in recirculat ion basin complement ed wit h aerat ion

  sampel rumput laut t ransgenik yang membawa gen BAP d e n gan pe rb an d ingan 1 :1. Hasil an alisis PCR

  

M aSOD sebanyak 78% dari hasil t ransfo rmasi . Hal ini m e m p e r lih a t k a n K. a l var ez i i t r a n s g e n ik p u t a t if

M aSOD

  juga dilakukan pada analisis PCR yang dilakukan o leh mengandung t ransgen sebanyak 78% dari hasil

  et al Triana . (2016) memperlihat kan adanya pit a pada t ransfo rmasi.

  4 56 b p pad a samp el ru mp ut laut t ransgen ik yan g

  UCAPAN TERIM A KASIH M aSOD membawa gen .

  Penelit ian ini dibiayai o leh APBN dari DIPA Lo ka

  Penelit ian dan Pengembangan Budidaya Rumput Laut

  M aSOD

  Pada regenerasi rumput laut t ransgenik , (LPPBRL) Go ro nt alo , Tahu n Anggaran 2015 . Ucapan memperlihat kan media kultur yang paling baik adalah t erima kasih disampaikan kepada kepala LPPBRL, sert a m en ggun akan me d ia PES de n gan salin it as 30 g/L, p e n e lit i BPPBAP Ma r o s ya n g t e la h m e m b a n t u pH= 7, penet rasi cahaya 1.500 lux, rasio gelap terang= kelancaran pelaksanaan penelit ian ini. 12:12, dan ko mpo sisi ZPT adalah campuran IAA dan

  Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34

• mediated t rans- fo r m a t io n o f lys o z ym e g e n e in s e a w e e d

  Ka pp a p h ycu s a l va r ezi i [Do t y].

  J. Phycol

  ., 33, 554-557. Mamboya, F.A. (2007). Heavy met al co nt aminat io n and t oxicit y: st udies o f macro algae fro m t he Tanzania

  Co ast . St o ckho lm Universit y Librar y. St o ckho lm, U. S. ,: p . 1 – 4 8 . ISBN 9 1 -7 1 5 5 -3 7 4 -6 . h t t p :// ww w.d iva-p o r t a l.o rg /sm as h /ge t /d iva 2 :1 9 7 1 1 2 / FULLTEXT01.pdf. Rajam u d din , M.A.L., Alimu d d in, Widyast u t i, U., &

  Faizal, I. (2014). Evaluat io n o f different pro mo t - e rs d riving t he GFP rep o rt e r ge n e in se awee d

  Kappaphycus alvarezii .

  Indonesian J. Biot echnology

  , 19(2), 129-135. Rajam u d din , M.A.L., Alimu d d in, Widyast u t i, U., &

  Harris, E. (20 16 ). Tran sfo rm at io n o f kap pa (ê)- carrageenase gene fro m Pseudoalt eromonas in sea- w e e d

  Pa k. J. Biot echnol ., 13(3), 157-163.

  and

  Gambar 8. Hasil elekt ro fo resis pro duk PCR dengan DNA geno m dari rumput laut K. alvarezii hasil t ransfo rmasi dengan gen

  M aSOD

  dan no n-t ransfo rman. PCR dilakukan dengan primer

  M mSODF-M mSODR2

  , NT= no n-t ransgenik, M= marker 1 kb DNA; P adalah ko nt ro l po sit if (plasmid pGWB5-

  M mCU/Zn-SOD

  ); 1-4= rumput laut t ransgenik

  

Figure 8. Elect r ophor esis r esult of PCR pr oduct w it h DNA genome f r om seaw eed K. alvarez ii

t ransformed wit h M aSOD gene and non-t ransformant . PCR was conduct ed wit h primary M mSODF-M mSODR2, NT= non-t ransgenic, M = marker 1 kb DNA; P is posit ive cont rol (plasmid pGWB5-M mCU/Zn-SOD); 1-4= t ransgenic seaweed

  NTM P 1 2 3 4

   Glacilaria spp. (Rho dophyt a).

  Kappaphycus alvarezii

  Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016,321-330

  W id ya s t u t i, U. (2 0 1 5 ). In t r o d u k s i g e n m e t allo t h io n e in t ip e II ke d alam ru m p u t lau t

  DAFTAR ACUAN

  Cheney, D.P. (2000). Agro bact erium-mediat ed genet ic t ransfo rmat io n o f mult icellular marine algae, re- sult ant st rains and t heir pro duct s. int ernat io nal classes. No rt heast ern Universit y (Hunt ingt o n Av- e n u e Bo s t o n ) US. h t t p ://ip . c o m /p a t fa m /e n / 22440221. [t anggal akses 20 Sept ember 2012]. Cheng, R., Ruijuan, M.A., Ke, L., Hui, R., Xiangzhi, L., Zh ao ka i, W., Sh a n ju n , Y., & Yo n g, M. (2 0 1 1 ).

  Agrobact erium t umefaciens

  mediated t ransformation o f m arin e m icro alg ae Schizochyt r ium . M i cr es ., 25421, 1-8. Co llen , J.U. (199 5). Farm ing and physio lo gy o f t he red alage eucheuma go wing co mmercial impo r- t ance in East Africa. Ambio ., 24, 7-8. Daud, R.F., Widyast ut i, U., Suharso no , Sur yat i, E., &

  Parenrengi, A. (2013). Intro duksi gen sit rat sintase k e d a la m r u m p u t la u t

  Ka pp ap hyus a l var ez i i

  me nggu nakan Agr obact erium t umefaciens. J. Ris.

  Akuakult ur , 8(2), 201-208.

  Fo o d and Agricult ure Organizat io n o f t he Unit ed Na- t io ns [FAO]. (2010). The St at e o f wo rld fisheries and aquacult ure . sales and market ing gro up o fûce o f kno wledge exchange. Research and Ext ensio n Fo o d and Agricult ure Organizat io n o f t he Unit ed Nat io n s Viale d e lle Term e di Caracalla 0 0 15 3 , Ro me. It aly, 218 pp. Fajriah, U., Sur yat i, E., Parenrengi, A., Suharso no , &

  Kappaphyus alvarezii menggunakan Agrobact erium t umefaciens. J. Ris. Akuakult ur,

  (1997). Direct enumerat io n o f t o t al bact eria fro m m a cr o a lg a e b y e p iflu o r e s e ce n ce m icr o s co p y asap llie d t o t h e flash y re d algae

  9(3), 377-385.

  Handayani, T., Alimuddin, Widyast ut i, U., Sur yat i, E.., & Parenren gi A. (2014). Binar y vect o r co nst ruc- t io n and

  Agrobact erium t umefaciens

  Kappaphycus alvarezii . Bio t ro pia, 21(2), 80-90.

  Hannu m, S. (2 01 2).

  Isolasi, pengklonan, dan analisis ekspr esi g en penyandi Copper /Zi n c Su per ox i de D i sm u t a se (CuZn -SOD ) d a r i

  M el a st om a malabathricum L

  . Disert asi. Seko lah Pascasarjana. Inst it ut Pert anian Bo go r. Bo go r, 106 hlm.

  Largo , D.B., Faukami, K., Adachi, M., & Nhisijima, T.

  256 bp

• mediat ed

  Wat t ie r, R.A., Pro dö h l, P.A., & Maggs, C.A. (2 00 0).