Aktivitas Antibakteri Ekstrak Tempe Terhadap Bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental
(experimental research). Penelitian eksperimental dimaksudkan untuk mengetahui
pengaruh atau hubungan antara variabel bebas dengan variabel terikat. Dalam
penelitian ini yang termasuk variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak etanol,
etilasetat, n-heksana tempe dengan konsentrasi 500, 400, dan 300 mg/ml, sedang
variabel terikat adalah diameter daerah hambat dalam satuan milimeter (mm).
3.1
Desain Penelitian
Penelitian yang dilakukan meliputi pengambilan dan pengolahan bahan
penelitian (tempe), pembuatan ekstrak etanol, ekstrak n-heksana, ekstrak etilasetat
tempe dan uji antibakteri terhadap bakteri patogen biakan murni yang disimpan di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USU Medan dengan metode difusi
agar menggunakan kertas cakram, bakteri yang digunakan adalah bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 29737).
3.2
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi
USU, Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU dan Laboratorium Analisa
Kimia Bahan Pangan Fakultas Pertanian USU. Waktu penelitian dilakukan dari
bulan Agustus 2011 sampai dengan Oktober 2011.
35
3.3
Alat dan Bahan
3.3.1 Alat-Alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas,
autoklaf (Fisons), blender (National), bola karet, eksikator, Freeze dryer
(Modulio) pada lampiran 16, inkubator (Fiber Scientific), jangka sorong, jarum
ose, kompor gas (Sharp), Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF 1200L), lemari
pendingin (Toshiba), neraca kasar (Sun), neraca listrik (Vibra AJ), oven listrik
(Fisher scientific), penangas air (Yenaco), pencadang kertas, petri dish, pinset,
pipet mikro (Eppendorf), rotary evaporator (Buchi 461) pada lampiran 15,
spektrofotometer visibel (Dynamica), dish blank (oxoid).
3.3.2 Bahan-Bahan yang Digunakan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah tempe. Bahan kimia
yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis yaitu air
suling dari laboratorium Analitik Kualitatif Farmasi USU, dimetilsulfoksida,
etanol, etilasetat, n-heksana, kertas cakram berisi amoksisilin 30 µg/ml (Oxoid).
3.4
Penyiapan Bahan Penelitian
3.4.1 Pengambilan Bahan
Pengambilan bahan penelitian dilakukan secara purposif, yaitu tanpa
membandingkan dengan bahan serupa dari tempat lain. Bahan penelitian yang
digunakan ialah tempe yang diambil dari Pasar Tradisional Pringgan, Medan,
Sumatera Utara pada bulan Agustus 2011, pada lampiran 1.
3.4.2 Pengolahan Bahan Penelitian
Sebanyak 1 kg tempe dibersihkan dengan cara mencucinya dengan air
bersih, ditiriskan, lalu diiris tipis, dimemarkan dengan menggunakan lumpang dan
36
alu porselen, kemudian ditimbang beratnya. Tempe disimpan dalam wadah
tertutup baik, terlindung dari cahaya matahari dan terhindar dari panas.
3.5
Pembuatan Ekstrak Tempe
Pembuatan ekstrak etanol tempe, ekstrak etilasetat tempe dan ekstrak n-
heksan tempe masing-masing dilakukan sebanyak 300 g tempe yang dimemarkan
dengan lumpang dan stamfer. Kemudian masing-masing dimaserasi di dalam
wadah kaca berwarna gelap dengan pelarut etanol 96%, n-heksana dan etilasetat
sampai seluruh tempe terendam, ditutup dan disimpan pada suhu kamar selama 5
hari dan terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk. Kemudian disaring
sehingga didapat maserat. Maserat didiamkan selama 2 hari, lalu cairan
dienaptuangkan kemudian dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada
temperatur tidak lebih dari 50°C sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian
dikeringkan dengan freeze dryer (Ditjen POM, 1979).
3.6
Pengujian Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol, ekstrak n-heksana dan
ekstrak etilasetat tempe dengan metode difusi agar menggunakan pencadang
kertas. Bakteri yang digunakan ialah bakteri Gram positif (Bacillus subtilis ATCC
6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 29737).
3.6.1 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol, Etilasetat, dan n-Heksana
Tempe
Masing-masing ekstrak etanol, n-heksana dan etilasetat tempe ditimbang
sebanyak 5 g kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida sampai larut dan
dicukupkan dengan etanol pada labu tentukur 10 ml sehingga diperoleh
konsentrasi 500 mg/ml selanjutnya dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400
mg/ml dan 300 mg/ml.
37
3.6.2 Sterilisasi Alat
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus
disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven
pada suhu 170oC selama 1-2 jam dan alat-alat jenis lainnya disterilkan di autoklaf
pada suhu 121oC selama 15 menit, jarum ose dibakar dengan lampu spiritus.
3.6.3 Pembuatan Media
3.6.3.1 Media Nutrient Agar (NA)
Komposisi:
Ekstrak daging
3g
Pepton
5g
Agar
15 g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Sebanyak 23 g media NA yang sudah jadi dilarutkan dalam air suling steril
kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan
sampai semua bahan larut. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit (Difco Laboratories, 1977).
3.6.3.2 Media Nutrient Broth (NB)
Komposisi:
Enzim sari gelatin
5g
Ekstrak daging
3g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Media nutrient broth yang sudah jadi ditimbang sebanyak 8 gram lalu dilarutkan
dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan
hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut. Kemudian
38
disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Difco Laboratories,
1977).
3.6.3.3 Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Komposisi:
Ekstrak daging
3g
Asam bacto-casamino5 g
Pati
1,5 g
Bacto agar
17 g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Sebanyak 38 g media MHA yang sudah jadi dilarutkan ke dalam air suling steril
sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan
pemanasan sampai semua bahan larut, disterilkan dalam autoklaf pada temperatur
121°C selama 10 menit (Difco Laboratories, 1977).
3.6.3.4 Pembuatan Agar Miring
Sebanyak 3 ml media NA steril dimasukkan kedalam tabung reaksi steril,
didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring
kira-kira 45°. Kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5°C (Ditjen
POM, 1995).
3.6.4 Peremajaan Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu
ditanam pada media NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi
dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam (Ditjen POM, 1995).
39
3.6.5 Pembuatan Inokulum
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu
disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan Nutrient Broth.
Kemudian diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai
diperoleh transmitan 25% (konsentrasi bakteri 1x106 cfu/ml) (Ditjen POM, 1995).
3.6.6 Pengujian Antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan terhadap ekstrak etanol, ekstrak nheksana, ekstrak etilasetat dengan metode difusi agar menggunakan kertas
cakram.
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml MHA
di cawan petri steril, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media
yang telah padat diletakkan kertas cakram (oxoid) yang sudah berisi masingmasing ekstrak berbagai konsentrasi, dan untuk pembanding kontrol positif
dipakai kertas cakram yang sudah berisi antibiotik amoksisilin 30 µg/ml (Oxoid).
Kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam.
Selanjutnya masing-masing petri diukur diameter daerah bening di sekitar kertas
cakram menggunakan jangka sorong. Pengujian masing-masing dilakukan
sebanyak 3 kali (Ditjen POM, 1995).
3.7
Karakterisasi Tempe
3.7.1 Kadar Air
Analisis kadar air ditentukan dengan menggunakan oven. Bahan ditimbang
sebanyak 5 g dalam cawan aluminium yang telah diketahui beratnya. Kemudian
dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 105oC selama 4 jam lalu didinginkan
dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang. Selanjutnya dipanaskan kembali
40
dalam oven selama 30 menit lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Perlakuan ini dilakukan sampai didapat berat yang konstan (AOAC, 1984).
Pengurangan berat merupakan banyaknya air yang diuapkan dari bahan dengan
perhitungan:
Berat Awal – Berat Akhir
Kadar Air = ——————————— x 100%
Berat Awal
3.7.2 Penentuan Total Asam
Bahan ditimbang sebanyak 10 g dan ditambahkan air sebanyak 90 g,
kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No. 42, diambil ekstraknya
sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam beaker glass. ke dalam cairan diletakkan pH
meter, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai pH 8,1 (AOAC, 1984).
ml NaOH x N NaOH
Total Asam = —————————— x FP
Berat Bahan
3.7.3 Kadar Protein
Penentuann kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl, bahan
diambil sebanyak 0,2 g dan dimasukkan ke dalam tabung kjeldahl lalu ditambah
katalisator campuran K 2 SO 4 : CuSO 4 sebanyak 2 gram dan ditambahkan H 2 SO 4
pekat sebanyak 2,5 ml, didestruksi sampai berwarna jernih dan didinginkan.
Setelah dingin, ditambahkan 10 ml akuades, dan dipindahkan ke dalam
erlenmeyer 500 ml, ditambahkan 10 ml NaOH 40% atau lebih sampai alkalis dan
segera didestilasi. Hasil sulingan ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml
H 2 SO 4 0,026 N dengan penambahan indikator (campuran 2 bagian metilen red
dan 1 bagian metilen blue). Hasil sulingan dititrasi dengan larutan NaOH 0,026 N
41
sampai terjadi perubahan warna, dilakukan perlakuan yang sama untuk blanko
(tanpa bahan) (Sudarmadji, 1989). Kadar protein dihitung dengan rumus:
(ml titrasi blanko - ml titrasi contoh) x N NaOH x 0,014 x fk
Kadar Protein = ————————————————————————— x 100%
Berat Contoh
Dimana fk = Faktor konversi = 6,25
3.7.4 Kadar Lemak
Penentuan kadar lemak dilakukan dengan metode soxhlet. Dengan alat
ekstraksi soxhlet diambil labu lemak yang ukurannya sesuai, dikeringkan dalam
oven dan didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Bahan ditimbang 5 gram
dalam bentuk tepung langsung dalam selongsong kertas saring. Dalam alat
ekstraksi soxhlet diletakkan kertas saring yang berisi bahan tersebut, kemudian
dipasang alat kondensor diatasnya dan labu lemak dibawahnya. Pelarut heksan
dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya, sesuai dengan ukuran soxhlet yang
digunakan. Refluks dilakukan selama minimum 5 jam sampai pelarut yang turun
kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Pelarut didestilasi yang ada dalam
lemak dan ditampung pelarutnya, kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi
dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC. Hasil ektraksi dikeringkan sampai berat
konstan dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang labu beserta
lemaknya tersebut (Apriyantono, dkk., 1989).
Berat Lemak (g)
% Kadar Lemak = ——————— x 100%
Berat Sampel (g)
3.7.5 Kadar Serat Kasar
Bahan kering ditimbang 5 g dan ekstraksi lemaknya dengan menggunakan
soxhlet. Bahan dipindahkan ke dalam erlenmeyer 600 ml. H 2 SO 4 mendidih
ditambahkan sebanyak 200 ml (1,25 gram H 2 SO 4 pekat dalam 100 ml akuades =
42
0,255 H 2 SO 4 ) dan ditutup dengan pendingin balik, didihkan selama 30 menit
dengan kadang kala digoyang-goyangkan. Suspense disaring melalui kertas saring
dan residu yang tertinggal dalam erlenmeyer dicuci dengan akuades mendidih.
Residu di cuci dalam kertas saring sampai air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji
dengan kertas lakmus). Secara kualitatif residu dipindahkan kembali dari kertas
saring ke dalam erlenmeyer dengan spatula, dan sisanya dicuci dengan larutan
NaOH mendidih (1,25 gram NaOH dalam 100 ml akuades = 0,313 N NaOH)
sebanyak 200 ml sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer. Residu
didihkan dengan pendingin balik sambil kadang kala digoyang-digoyangkan
selama 30 menit. Sambil dicuci dengan larutan K 2 SO 4 10% disaring dengan
kertas saring yang diketahui beratnya. Residu dicuci lagi dengan akuades
mendidih dan kemudian dengan lebih kurang 15 ml alkohol 95%, kemudian
dikeringkan dengan kertas saring dengan isinya pada suhu 110oC sampai berat
konstan (1-2 jam), dinginkan dalam desikator dan ditimbang. Berat residu
merupakan berat serat kasar (Sudarmadji, dkk., 1989).
Berat Serat Kasar (g)
% Serat Kasar = ————————— x 100%
Berat Sampel (g)
3.7.6 Kadar Abu Total
Penentuan kadar abu dilakukan dengan menggunakan muffle. Bahan
ditimbang sebanyak 5 gram kemudian dikeringkan dalam oven dahulu selama 5
jam dengan suhu 105oC lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit.
Kemudian bahan yang sudah kering dimasukkan ke dalam muffle dengan suhu
300oC selama 1 jam dan dinaikkan suhu menjadi 500oC selama 3 jam lalu
43
didinginkan dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang beratnya
(Sudarmadji, dkk., 1989). Kadar abu dihitung dengan rumus:
Berat Setelah Dikeringkan (g)
Kadar Abu = ————————————— x 100%
Berat Sebelum Dikeringkan (g)
3.7.7 Kadar Karbohidrat
Kandungan karbohidrat kasar dapat dikira dengan jalan menjumlahkan
semua kandungan (%) air, abu, protein, lemak dan serabut kasar, yang mana
jumlah ini adalah sama dengan 100 - % karbohidrat, atau % karbohidrat = 100 - %
(air + abu + protein + lemak + serabut kasar) (Nitisewono, 1988).
3.7.8 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama
10 menit, disaring panas melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml
air. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu
didiamkan sebentar. Kemudian diambil lapisan metanol, diuapkan pada suhu
40oC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Filtratnya digunakan
untuk flavonoid dengan cara berikut:
a.
Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2
ml etanol 96% lalu ditambahkan serbuk 0,5 gram serbuk seng dan 2
ml asam kloroda 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian
ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit
terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
b.
Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisa
dilarutkan dalam 2 ml etanol 96%, ditambah 0,1 gram serbuk
magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat, jika terjadi warna kuning
44
jingga
sampai
merah
ungu
menunjukkan
adanya
flavonoid
(Farnsworth, 1966).
3.8
Analisis Data
Analisis data menggunakan software program komputer SPSS versi 14.
Data diameter hambat dari masing-masing bahan uji dianalisis dengan
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk melihat apakah data terdistribusi
normal atau tidak normal. Selanjutnya uji dilanjutkan dengan menggunakan uji
Homogeneity of Varian untuk mengetahui apakah varian dari data homogen atau
tidak homogen.
Data yang diperoleh terdistribusi tidak normal, oleh sebab itu dianalisis
menggunakan uji Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji beda rata-rata
Mann-Whitney.
45
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Ekstraksi
Hasil ekstraksi yang diperoleh dari tempe yang telah dikeringkan sebanyak
300 g dimaserasi dengan pelarut etanol 96%, etilasetat dan n-heksana masingmasing diperoleh 19,375 g, 15,360 g dan 13,100 g ekstrak setelah di freeze dryer.
Penggunaan pelarut etanol bertujuan agar senyawa kimia yang terkandung di
dalamnya dapat tersari sempurna, pelarut n-heksana digunakan untuk menarik
senyawa kimia non polar dan etilasetat digunakan agar senyawa kimia yang
bersifat semipolar dan agak polar tersari di dalamnya.
4.2
Komposisi Kandungan Tempe
Komposisi kandungan tempe dapat dilihat pada Tabel 4.1 di bawah ini.
Tabel 4.1. Komposisi kandungan tempe
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Karakterisasi
Kadar Air
Total Asam
Kadar Protein
Kadar Lemak
Kadar Serat Kasar
Kadar Abu Total
Kadar karbohidrat
Hasil
54,10%
0,5 grek
21,15%
8,10%
1,36%
1,35%
13,94%
Hasil pemeriksaan komposisi tempe yang didapat bila dibandingkan
dengan komposisi standar zat gizi pangan Indonesia Depkes RI tidak jauh berbeda
persentasenya. Hasil pemeriksaan Flavonoid pada tempe dinyatakan positif.
46
4.3
Uji Antibakteri Ekstrak Etanol, Etilasetat dan n-Heksana Tempe
terhadap Bacillus Subtilis
Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanol, etilasetat dan n-Heksana tempe
pada Tabel 4.2 terhadap bakteri Gram positif B. subtilis memberikan daya hambat
pada konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400 mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%),
sedang pada ekstrak n-heksana tempe tidak memberikan daya hambat (Gambar
4.1).
Tabel 4.2 Diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-Heksana terhadap
Bacillus subtilis.
Perlakuan
EEAT 500 mg/ml
EEAT 400 mg/ml
EEAT 300 mg/ml
EET 500 mg/ml
EET 400 mg/ml
EET 300 mg/ml
En-HT 500 mg/ml
En-HT 400 mg/ml
En-HT 300 mg/ml
Kontrol (-)
Amoksisillin 0,030 mg/ml
Keterangan: SD = Standar Defiasi
Diameter Hambat (mm) ± SD
14,13 ± 0.21
12,10 ± 0,30
11,43 ± 0,15
9,93 ± 0,15
8,83 ± 0,15
8,27 ± 0,15
6
6
6
6
12,03 ± 0,06
47
Gambar 4.1. Daya hambat antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap bakteri Bacillus subtilis.
Keterangan:
- EEAT : Ekstrak Etil Asetat Tempe
- EET
: Ekstrak Etanol Tempe
- En-HT : Ekstrak n-Heksan Tempe
Analisis statistik dilakukan untuk melihat normalitas dan homogenitas data
diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap
pertumbuhan Bacillus subtilis. Uji normalitas diameter hambat digunakan uji tes
Kolmogorov-Smirnov dengan menggunakan program SPSS 14 (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap Bacillus subtilis terdistribusi (P < 0,05). Kemudian untuk melihat
homogenitas diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe
terhadap Bacillus subtilis digunakan uji homogeneity analysis of varian
48
(Lampiran 2) yang menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol
dan n-heksana tempe terhadap Bacillus subtilis homogen dengan nilai signifikansi
0,083. Oleh karena itu dilanjutkan dengan analisis varian yang dilanjutkan dengan
uji beda rata-rata lanjutan Duncan pada Lampiran 2 yang menunjukkan adanya
perbedaan dengan melihat perbedaan antara satu dengan lain.
Terlihat pada Gambar 4.1 bahwa daya hambat ekstrak etilasetat tempe
lebih besar daripada ekstrak etanol tempe pada konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400
mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%) untuk bakteri Gram positif (B. subtilis),
sedang untuk blanko memakai dimetilsulfoksida (DMSO) tidak memberikan daya
hambat pada bakteri Gram positif (B. subtilis). Hasil penelitian sebelumnya yang
telah dilaporkan (Bintari, et al., 2008) diketahui bahwa selama fermentasi tempe
dengan bantuan Rhizopus sp. dihasilkan zat antibakteri yang berupa glikoprotein.
Hal tersebut membuktikan bahwa pertumbuhan bakteri Gram positif Micrococcus
luteus yang merupakan salah satu kontaminan pada tempe menjadi terhambat.
Ekstraksi dilakukan dengan maserasi menggunakan pelarut etanol akan
menarik senyawa-senyawa polar, semipolar dan nonpolar, sedang ekstraksi
dengan maserasi menggunakan pelarut etilasetat akan menarik senyawa-senyawa
yang bersifat semipolar dan polar saja. Senyawa yang bersifat lebih polar (semi
polar dan polar) dalam ekstrak etilasetat terdapat dalam jumlah lebih besar
daripada ekstrak etanol sehingga ekstrak etilasetat lebih mempengaruhi bakteri
Gram positif (B. subtilis) yang dinding selnya terdiri dari lapisan tebal yang lebih
banyak sehingga sifat kepolaran B. subtilis lebih besar (Pratiwi 2008; Waluyo,
2005). Menurut Pratiwi (2008), salah satu mekanisme antibiotik ialah merusak
struktur dinding sel pada membran plasma sehingga dapat menghambat
49
kemampuan membran plasma sel bakteri sebagai penghalang (barrier) osmosis
dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran.
Antibiotik yang bersifat merusak membran plasma umum terdapat pada antibiotik
golongan polipeptida yang bekerja dengan mengubah permeabilitas membran
plasma sel bakteri.
4.4
Uji Antibakteri Ekstrak Etanol, Etilasetat dan n-Heksana Tempe
Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus
Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanol, etilasetat dan n-heksana tempe
terhadap bakteri S. aureus pada Tabel 4.3 menunjukkan daya hambat pada
konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400 mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%), sedang
pada ekstrak n-heksana tempe tidak memberikan daya hambat (Gambar 4.2).
Tabel 4.3 Diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-Heksana terhadap
Staphylococcus aureus.
Perlakuan
EEAT 500 mg/ml
EEAT 400 mg/ml
EEAT 300 mg/ml
EET 500 mg/ml
EET 400 mg/ml
EET 300 mg/ml
En-HT 500 mg/ml
En-HT 400 mg/ml
En-HT 300 mg/ml
Kontrol (-)
Amoksisilin 0,030 mg/ml
Keterangan: SD = Standar Defiasi
Diameter Hambat (mm) ± SD
15,50 ± 0,44
14,87 ± 0,21
13,27 ± 0,25
10,87 ± 0,35
9,30 ± 0,20
8,27 ± 0,25
6
6
6
6
11,45 ± 0,09
Analisis statistik dilakukan untuk melihat normalitas dan homogenitas data
diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap
pertumbuhan S. aureus. Uji normalitas diameter hambat digunakan uji tes
Kolmogorov-Smirnov dengan menggunakan program SPSS 14 (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
50
tempe terhadap S. aureus adalah normal dengan nilai signifikansi 0,304 (P <
0,05), selanjutnya untuk melihat homogenitas diameter hambat ekstrak etilasetat,
etanol dan n-heksana tempe terhadap S. aureus digunakan uji homogeneity
analysis of varian (Lampiran 2) yang menunjukkan bahwa diameter hambat
ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap Staphylococcus aureus
tidak homogen, dengan demikian tidak memenuhi kriterian parametrik, oleh sebab
itu digunakan uji Kruskal-Wallis (Lampiran 3) yang menunjukkan nilai
signifikansi sebesar 0,001 (P < 0,05, taraf kepercayaan 95%), berarti terdapat
perbedaan antar kelompok bahan uji sedangkan untuk melihat perbedaan antar
kelompok dapat digunakan uji Mann-Withney (Lampiran 3).
Gambar 4.2. Daya hambat antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Adanya sifat kepolaran yang hampir sama dari golongan senyawa kimia
yang terkandung di dalam ekstrak etilasetat terhadap sifat lapisan membran luar
51
bakteri Gram positif (S. aureus) menyebabkan ekstrak etilasetat lebih mudah
masuk kedalam membran dinding sel bakteri Gram positif, seperti yang terlihat
pada Gambar 4.3 di mana terlihat bahwa efek antibakteri ekstrak etilasetat lebih
besar daripada ekstrak etanol, sedang untuk ekstrak n-heksana tidak menunjukkan
efek antibakteri. Senyawa glikoprotein (Bintari, et al., 2008), golongan protein
(amina) yang telah diisolasi media yang diinokulasikan biakan R. oligosporus
(Saraswaty, et al., 2002) dan senyawa flavonoid (isoflavon) merupakan beberapa
senyawa golongan antimikroba yang telah diteliti.
Gambar 4.3. Daya hambat gabungan antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan nheksana tempe terhadap bakteri Bacillus subtilis dan
Staphylococcus aureus.
Hasil pengujian ekstrak n-heksana yang diperoleh (Gambar 4.1 dan 4.2)
terlihat ekstrak n-heksana tidak memiliki daya hambat terhadap bakteri Gram
52
positif (B. subtilis dan S. aureus). Hasil ini dipengaruhi kandungan golongan
senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak n-heksana yang berupa senyawa non
polar yang ditarik pelarut n-heksana dengan jumlah yang lebih besar daripada di
dalam ekstrak etanol terhadap sifat lapisan membran luar (outer wall layer)
bakteri Gram positif yang membran luarnya terdiri dari lapisan peptidoglikan
yang lebih banyak dan bersifat polar, karena perbedaan kepolaran antara senyawa
kimia yang ditarik pelarut n-heksana dengan dinding sel bakteri Gram positif (B.
subtilis dan S. aureus), maka senyawa kimia yang tertarik dalam pelarut nheksana tidak dapat mempengaruhi permeabilitas membran sel bakteri Gram
positif yang bersifat polar.
53
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan
1.
Ekstrak etanol dan etilasetat tempe bersifat antibakteri terhadap
bakteri Gram positif Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus pada
konsentrasi 500 mg/ml dan 400 mg/ml.
2.
Ekstrak etilasetat tempe 500 mg/ml memiliki diameter hambat paling
besar terhadap S. aureus sebesar 15,50 ± 0,44 mm (P > 0,05) dan B.
subtilis sebesar 14,13 ± 0,21 mm (P > 0,05). Sedangkan ekstrak nheksan tempe tidak memiliki diameter hambat yang ditunjukkan tidak
berbeda signifikan dibanding kontrol terhadap bakteri B. subtilis dan
S. aureus.
5.2
Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk meneliti struktur kandungan
senyawa aktif dari ekstrak etilasetat tempe yang bersifat sebagai antibakteri.
54
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental
(experimental research). Penelitian eksperimental dimaksudkan untuk mengetahui
pengaruh atau hubungan antara variabel bebas dengan variabel terikat. Dalam
penelitian ini yang termasuk variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak etanol,
etilasetat, n-heksana tempe dengan konsentrasi 500, 400, dan 300 mg/ml, sedang
variabel terikat adalah diameter daerah hambat dalam satuan milimeter (mm).
3.1
Desain Penelitian
Penelitian yang dilakukan meliputi pengambilan dan pengolahan bahan
penelitian (tempe), pembuatan ekstrak etanol, ekstrak n-heksana, ekstrak etilasetat
tempe dan uji antibakteri terhadap bakteri patogen biakan murni yang disimpan di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USU Medan dengan metode difusi
agar menggunakan kertas cakram, bakteri yang digunakan adalah bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 29737).
3.2
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi
USU, Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU dan Laboratorium Analisa
Kimia Bahan Pangan Fakultas Pertanian USU. Waktu penelitian dilakukan dari
bulan Agustus 2011 sampai dengan Oktober 2011.
35
3.3
Alat dan Bahan
3.3.1 Alat-Alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas,
autoklaf (Fisons), blender (National), bola karet, eksikator, Freeze dryer
(Modulio) pada lampiran 16, inkubator (Fiber Scientific), jangka sorong, jarum
ose, kompor gas (Sharp), Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF 1200L), lemari
pendingin (Toshiba), neraca kasar (Sun), neraca listrik (Vibra AJ), oven listrik
(Fisher scientific), penangas air (Yenaco), pencadang kertas, petri dish, pinset,
pipet mikro (Eppendorf), rotary evaporator (Buchi 461) pada lampiran 15,
spektrofotometer visibel (Dynamica), dish blank (oxoid).
3.3.2 Bahan-Bahan yang Digunakan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah tempe. Bahan kimia
yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis yaitu air
suling dari laboratorium Analitik Kualitatif Farmasi USU, dimetilsulfoksida,
etanol, etilasetat, n-heksana, kertas cakram berisi amoksisilin 30 µg/ml (Oxoid).
3.4
Penyiapan Bahan Penelitian
3.4.1 Pengambilan Bahan
Pengambilan bahan penelitian dilakukan secara purposif, yaitu tanpa
membandingkan dengan bahan serupa dari tempat lain. Bahan penelitian yang
digunakan ialah tempe yang diambil dari Pasar Tradisional Pringgan, Medan,
Sumatera Utara pada bulan Agustus 2011, pada lampiran 1.
3.4.2 Pengolahan Bahan Penelitian
Sebanyak 1 kg tempe dibersihkan dengan cara mencucinya dengan air
bersih, ditiriskan, lalu diiris tipis, dimemarkan dengan menggunakan lumpang dan
36
alu porselen, kemudian ditimbang beratnya. Tempe disimpan dalam wadah
tertutup baik, terlindung dari cahaya matahari dan terhindar dari panas.
3.5
Pembuatan Ekstrak Tempe
Pembuatan ekstrak etanol tempe, ekstrak etilasetat tempe dan ekstrak n-
heksan tempe masing-masing dilakukan sebanyak 300 g tempe yang dimemarkan
dengan lumpang dan stamfer. Kemudian masing-masing dimaserasi di dalam
wadah kaca berwarna gelap dengan pelarut etanol 96%, n-heksana dan etilasetat
sampai seluruh tempe terendam, ditutup dan disimpan pada suhu kamar selama 5
hari dan terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk. Kemudian disaring
sehingga didapat maserat. Maserat didiamkan selama 2 hari, lalu cairan
dienaptuangkan kemudian dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada
temperatur tidak lebih dari 50°C sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian
dikeringkan dengan freeze dryer (Ditjen POM, 1979).
3.6
Pengujian Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol, ekstrak n-heksana dan
ekstrak etilasetat tempe dengan metode difusi agar menggunakan pencadang
kertas. Bakteri yang digunakan ialah bakteri Gram positif (Bacillus subtilis ATCC
6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 29737).
3.6.1 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol, Etilasetat, dan n-Heksana
Tempe
Masing-masing ekstrak etanol, n-heksana dan etilasetat tempe ditimbang
sebanyak 5 g kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida sampai larut dan
dicukupkan dengan etanol pada labu tentukur 10 ml sehingga diperoleh
konsentrasi 500 mg/ml selanjutnya dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400
mg/ml dan 300 mg/ml.
37
3.6.2 Sterilisasi Alat
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus
disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven
pada suhu 170oC selama 1-2 jam dan alat-alat jenis lainnya disterilkan di autoklaf
pada suhu 121oC selama 15 menit, jarum ose dibakar dengan lampu spiritus.
3.6.3 Pembuatan Media
3.6.3.1 Media Nutrient Agar (NA)
Komposisi:
Ekstrak daging
3g
Pepton
5g
Agar
15 g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Sebanyak 23 g media NA yang sudah jadi dilarutkan dalam air suling steril
kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan
sampai semua bahan larut. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit (Difco Laboratories, 1977).
3.6.3.2 Media Nutrient Broth (NB)
Komposisi:
Enzim sari gelatin
5g
Ekstrak daging
3g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Media nutrient broth yang sudah jadi ditimbang sebanyak 8 gram lalu dilarutkan
dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan
hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut. Kemudian
38
disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Difco Laboratories,
1977).
3.6.3.3 Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Komposisi:
Ekstrak daging
3g
Asam bacto-casamino5 g
Pati
1,5 g
Bacto agar
17 g
Air suling sampai
1L
Cara pembuatan:
Sebanyak 38 g media MHA yang sudah jadi dilarutkan ke dalam air suling steril
sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan
pemanasan sampai semua bahan larut, disterilkan dalam autoklaf pada temperatur
121°C selama 10 menit (Difco Laboratories, 1977).
3.6.3.4 Pembuatan Agar Miring
Sebanyak 3 ml media NA steril dimasukkan kedalam tabung reaksi steril,
didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring
kira-kira 45°. Kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5°C (Ditjen
POM, 1995).
3.6.4 Peremajaan Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu
ditanam pada media NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi
dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam (Ditjen POM, 1995).
39
3.6.5 Pembuatan Inokulum
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu
disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan Nutrient Broth.
Kemudian diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai
diperoleh transmitan 25% (konsentrasi bakteri 1x106 cfu/ml) (Ditjen POM, 1995).
3.6.6 Pengujian Antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan terhadap ekstrak etanol, ekstrak nheksana, ekstrak etilasetat dengan metode difusi agar menggunakan kertas
cakram.
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml MHA
di cawan petri steril, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media
yang telah padat diletakkan kertas cakram (oxoid) yang sudah berisi masingmasing ekstrak berbagai konsentrasi, dan untuk pembanding kontrol positif
dipakai kertas cakram yang sudah berisi antibiotik amoksisilin 30 µg/ml (Oxoid).
Kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam.
Selanjutnya masing-masing petri diukur diameter daerah bening di sekitar kertas
cakram menggunakan jangka sorong. Pengujian masing-masing dilakukan
sebanyak 3 kali (Ditjen POM, 1995).
3.7
Karakterisasi Tempe
3.7.1 Kadar Air
Analisis kadar air ditentukan dengan menggunakan oven. Bahan ditimbang
sebanyak 5 g dalam cawan aluminium yang telah diketahui beratnya. Kemudian
dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 105oC selama 4 jam lalu didinginkan
dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang. Selanjutnya dipanaskan kembali
40
dalam oven selama 30 menit lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Perlakuan ini dilakukan sampai didapat berat yang konstan (AOAC, 1984).
Pengurangan berat merupakan banyaknya air yang diuapkan dari bahan dengan
perhitungan:
Berat Awal – Berat Akhir
Kadar Air = ——————————— x 100%
Berat Awal
3.7.2 Penentuan Total Asam
Bahan ditimbang sebanyak 10 g dan ditambahkan air sebanyak 90 g,
kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No. 42, diambil ekstraknya
sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam beaker glass. ke dalam cairan diletakkan pH
meter, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai pH 8,1 (AOAC, 1984).
ml NaOH x N NaOH
Total Asam = —————————— x FP
Berat Bahan
3.7.3 Kadar Protein
Penentuann kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl, bahan
diambil sebanyak 0,2 g dan dimasukkan ke dalam tabung kjeldahl lalu ditambah
katalisator campuran K 2 SO 4 : CuSO 4 sebanyak 2 gram dan ditambahkan H 2 SO 4
pekat sebanyak 2,5 ml, didestruksi sampai berwarna jernih dan didinginkan.
Setelah dingin, ditambahkan 10 ml akuades, dan dipindahkan ke dalam
erlenmeyer 500 ml, ditambahkan 10 ml NaOH 40% atau lebih sampai alkalis dan
segera didestilasi. Hasil sulingan ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml
H 2 SO 4 0,026 N dengan penambahan indikator (campuran 2 bagian metilen red
dan 1 bagian metilen blue). Hasil sulingan dititrasi dengan larutan NaOH 0,026 N
41
sampai terjadi perubahan warna, dilakukan perlakuan yang sama untuk blanko
(tanpa bahan) (Sudarmadji, 1989). Kadar protein dihitung dengan rumus:
(ml titrasi blanko - ml titrasi contoh) x N NaOH x 0,014 x fk
Kadar Protein = ————————————————————————— x 100%
Berat Contoh
Dimana fk = Faktor konversi = 6,25
3.7.4 Kadar Lemak
Penentuan kadar lemak dilakukan dengan metode soxhlet. Dengan alat
ekstraksi soxhlet diambil labu lemak yang ukurannya sesuai, dikeringkan dalam
oven dan didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Bahan ditimbang 5 gram
dalam bentuk tepung langsung dalam selongsong kertas saring. Dalam alat
ekstraksi soxhlet diletakkan kertas saring yang berisi bahan tersebut, kemudian
dipasang alat kondensor diatasnya dan labu lemak dibawahnya. Pelarut heksan
dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya, sesuai dengan ukuran soxhlet yang
digunakan. Refluks dilakukan selama minimum 5 jam sampai pelarut yang turun
kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Pelarut didestilasi yang ada dalam
lemak dan ditampung pelarutnya, kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi
dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC. Hasil ektraksi dikeringkan sampai berat
konstan dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang labu beserta
lemaknya tersebut (Apriyantono, dkk., 1989).
Berat Lemak (g)
% Kadar Lemak = ——————— x 100%
Berat Sampel (g)
3.7.5 Kadar Serat Kasar
Bahan kering ditimbang 5 g dan ekstraksi lemaknya dengan menggunakan
soxhlet. Bahan dipindahkan ke dalam erlenmeyer 600 ml. H 2 SO 4 mendidih
ditambahkan sebanyak 200 ml (1,25 gram H 2 SO 4 pekat dalam 100 ml akuades =
42
0,255 H 2 SO 4 ) dan ditutup dengan pendingin balik, didihkan selama 30 menit
dengan kadang kala digoyang-goyangkan. Suspense disaring melalui kertas saring
dan residu yang tertinggal dalam erlenmeyer dicuci dengan akuades mendidih.
Residu di cuci dalam kertas saring sampai air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji
dengan kertas lakmus). Secara kualitatif residu dipindahkan kembali dari kertas
saring ke dalam erlenmeyer dengan spatula, dan sisanya dicuci dengan larutan
NaOH mendidih (1,25 gram NaOH dalam 100 ml akuades = 0,313 N NaOH)
sebanyak 200 ml sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer. Residu
didihkan dengan pendingin balik sambil kadang kala digoyang-digoyangkan
selama 30 menit. Sambil dicuci dengan larutan K 2 SO 4 10% disaring dengan
kertas saring yang diketahui beratnya. Residu dicuci lagi dengan akuades
mendidih dan kemudian dengan lebih kurang 15 ml alkohol 95%, kemudian
dikeringkan dengan kertas saring dengan isinya pada suhu 110oC sampai berat
konstan (1-2 jam), dinginkan dalam desikator dan ditimbang. Berat residu
merupakan berat serat kasar (Sudarmadji, dkk., 1989).
Berat Serat Kasar (g)
% Serat Kasar = ————————— x 100%
Berat Sampel (g)
3.7.6 Kadar Abu Total
Penentuan kadar abu dilakukan dengan menggunakan muffle. Bahan
ditimbang sebanyak 5 gram kemudian dikeringkan dalam oven dahulu selama 5
jam dengan suhu 105oC lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit.
Kemudian bahan yang sudah kering dimasukkan ke dalam muffle dengan suhu
300oC selama 1 jam dan dinaikkan suhu menjadi 500oC selama 3 jam lalu
43
didinginkan dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang beratnya
(Sudarmadji, dkk., 1989). Kadar abu dihitung dengan rumus:
Berat Setelah Dikeringkan (g)
Kadar Abu = ————————————— x 100%
Berat Sebelum Dikeringkan (g)
3.7.7 Kadar Karbohidrat
Kandungan karbohidrat kasar dapat dikira dengan jalan menjumlahkan
semua kandungan (%) air, abu, protein, lemak dan serabut kasar, yang mana
jumlah ini adalah sama dengan 100 - % karbohidrat, atau % karbohidrat = 100 - %
(air + abu + protein + lemak + serabut kasar) (Nitisewono, 1988).
3.7.8 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama
10 menit, disaring panas melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml
air. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu
didiamkan sebentar. Kemudian diambil lapisan metanol, diuapkan pada suhu
40oC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Filtratnya digunakan
untuk flavonoid dengan cara berikut:
a.
Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2
ml etanol 96% lalu ditambahkan serbuk 0,5 gram serbuk seng dan 2
ml asam kloroda 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian
ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit
terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
b.
Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisa
dilarutkan dalam 2 ml etanol 96%, ditambah 0,1 gram serbuk
magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat, jika terjadi warna kuning
44
jingga
sampai
merah
ungu
menunjukkan
adanya
flavonoid
(Farnsworth, 1966).
3.8
Analisis Data
Analisis data menggunakan software program komputer SPSS versi 14.
Data diameter hambat dari masing-masing bahan uji dianalisis dengan
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk melihat apakah data terdistribusi
normal atau tidak normal. Selanjutnya uji dilanjutkan dengan menggunakan uji
Homogeneity of Varian untuk mengetahui apakah varian dari data homogen atau
tidak homogen.
Data yang diperoleh terdistribusi tidak normal, oleh sebab itu dianalisis
menggunakan uji Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji beda rata-rata
Mann-Whitney.
45
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Ekstraksi
Hasil ekstraksi yang diperoleh dari tempe yang telah dikeringkan sebanyak
300 g dimaserasi dengan pelarut etanol 96%, etilasetat dan n-heksana masingmasing diperoleh 19,375 g, 15,360 g dan 13,100 g ekstrak setelah di freeze dryer.
Penggunaan pelarut etanol bertujuan agar senyawa kimia yang terkandung di
dalamnya dapat tersari sempurna, pelarut n-heksana digunakan untuk menarik
senyawa kimia non polar dan etilasetat digunakan agar senyawa kimia yang
bersifat semipolar dan agak polar tersari di dalamnya.
4.2
Komposisi Kandungan Tempe
Komposisi kandungan tempe dapat dilihat pada Tabel 4.1 di bawah ini.
Tabel 4.1. Komposisi kandungan tempe
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Karakterisasi
Kadar Air
Total Asam
Kadar Protein
Kadar Lemak
Kadar Serat Kasar
Kadar Abu Total
Kadar karbohidrat
Hasil
54,10%
0,5 grek
21,15%
8,10%
1,36%
1,35%
13,94%
Hasil pemeriksaan komposisi tempe yang didapat bila dibandingkan
dengan komposisi standar zat gizi pangan Indonesia Depkes RI tidak jauh berbeda
persentasenya. Hasil pemeriksaan Flavonoid pada tempe dinyatakan positif.
46
4.3
Uji Antibakteri Ekstrak Etanol, Etilasetat dan n-Heksana Tempe
terhadap Bacillus Subtilis
Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanol, etilasetat dan n-Heksana tempe
pada Tabel 4.2 terhadap bakteri Gram positif B. subtilis memberikan daya hambat
pada konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400 mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%),
sedang pada ekstrak n-heksana tempe tidak memberikan daya hambat (Gambar
4.1).
Tabel 4.2 Diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-Heksana terhadap
Bacillus subtilis.
Perlakuan
EEAT 500 mg/ml
EEAT 400 mg/ml
EEAT 300 mg/ml
EET 500 mg/ml
EET 400 mg/ml
EET 300 mg/ml
En-HT 500 mg/ml
En-HT 400 mg/ml
En-HT 300 mg/ml
Kontrol (-)
Amoksisillin 0,030 mg/ml
Keterangan: SD = Standar Defiasi
Diameter Hambat (mm) ± SD
14,13 ± 0.21
12,10 ± 0,30
11,43 ± 0,15
9,93 ± 0,15
8,83 ± 0,15
8,27 ± 0,15
6
6
6
6
12,03 ± 0,06
47
Gambar 4.1. Daya hambat antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap bakteri Bacillus subtilis.
Keterangan:
- EEAT : Ekstrak Etil Asetat Tempe
- EET
: Ekstrak Etanol Tempe
- En-HT : Ekstrak n-Heksan Tempe
Analisis statistik dilakukan untuk melihat normalitas dan homogenitas data
diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap
pertumbuhan Bacillus subtilis. Uji normalitas diameter hambat digunakan uji tes
Kolmogorov-Smirnov dengan menggunakan program SPSS 14 (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap Bacillus subtilis terdistribusi (P < 0,05). Kemudian untuk melihat
homogenitas diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe
terhadap Bacillus subtilis digunakan uji homogeneity analysis of varian
48
(Lampiran 2) yang menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol
dan n-heksana tempe terhadap Bacillus subtilis homogen dengan nilai signifikansi
0,083. Oleh karena itu dilanjutkan dengan analisis varian yang dilanjutkan dengan
uji beda rata-rata lanjutan Duncan pada Lampiran 2 yang menunjukkan adanya
perbedaan dengan melihat perbedaan antara satu dengan lain.
Terlihat pada Gambar 4.1 bahwa daya hambat ekstrak etilasetat tempe
lebih besar daripada ekstrak etanol tempe pada konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400
mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%) untuk bakteri Gram positif (B. subtilis),
sedang untuk blanko memakai dimetilsulfoksida (DMSO) tidak memberikan daya
hambat pada bakteri Gram positif (B. subtilis). Hasil penelitian sebelumnya yang
telah dilaporkan (Bintari, et al., 2008) diketahui bahwa selama fermentasi tempe
dengan bantuan Rhizopus sp. dihasilkan zat antibakteri yang berupa glikoprotein.
Hal tersebut membuktikan bahwa pertumbuhan bakteri Gram positif Micrococcus
luteus yang merupakan salah satu kontaminan pada tempe menjadi terhambat.
Ekstraksi dilakukan dengan maserasi menggunakan pelarut etanol akan
menarik senyawa-senyawa polar, semipolar dan nonpolar, sedang ekstraksi
dengan maserasi menggunakan pelarut etilasetat akan menarik senyawa-senyawa
yang bersifat semipolar dan polar saja. Senyawa yang bersifat lebih polar (semi
polar dan polar) dalam ekstrak etilasetat terdapat dalam jumlah lebih besar
daripada ekstrak etanol sehingga ekstrak etilasetat lebih mempengaruhi bakteri
Gram positif (B. subtilis) yang dinding selnya terdiri dari lapisan tebal yang lebih
banyak sehingga sifat kepolaran B. subtilis lebih besar (Pratiwi 2008; Waluyo,
2005). Menurut Pratiwi (2008), salah satu mekanisme antibiotik ialah merusak
struktur dinding sel pada membran plasma sehingga dapat menghambat
49
kemampuan membran plasma sel bakteri sebagai penghalang (barrier) osmosis
dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran.
Antibiotik yang bersifat merusak membran plasma umum terdapat pada antibiotik
golongan polipeptida yang bekerja dengan mengubah permeabilitas membran
plasma sel bakteri.
4.4
Uji Antibakteri Ekstrak Etanol, Etilasetat dan n-Heksana Tempe
Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus
Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanol, etilasetat dan n-heksana tempe
terhadap bakteri S. aureus pada Tabel 4.3 menunjukkan daya hambat pada
konsentrasi 500 mg/ml (50%), 400 mg/ml (40%) dan 300 mg/ml (30%), sedang
pada ekstrak n-heksana tempe tidak memberikan daya hambat (Gambar 4.2).
Tabel 4.3 Diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-Heksana terhadap
Staphylococcus aureus.
Perlakuan
EEAT 500 mg/ml
EEAT 400 mg/ml
EEAT 300 mg/ml
EET 500 mg/ml
EET 400 mg/ml
EET 300 mg/ml
En-HT 500 mg/ml
En-HT 400 mg/ml
En-HT 300 mg/ml
Kontrol (-)
Amoksisilin 0,030 mg/ml
Keterangan: SD = Standar Defiasi
Diameter Hambat (mm) ± SD
15,50 ± 0,44
14,87 ± 0,21
13,27 ± 0,25
10,87 ± 0,35
9,30 ± 0,20
8,27 ± 0,25
6
6
6
6
11,45 ± 0,09
Analisis statistik dilakukan untuk melihat normalitas dan homogenitas data
diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap
pertumbuhan S. aureus. Uji normalitas diameter hambat digunakan uji tes
Kolmogorov-Smirnov dengan menggunakan program SPSS 14 (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa diameter hambat ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
50
tempe terhadap S. aureus adalah normal dengan nilai signifikansi 0,304 (P <
0,05), selanjutnya untuk melihat homogenitas diameter hambat ekstrak etilasetat,
etanol dan n-heksana tempe terhadap S. aureus digunakan uji homogeneity
analysis of varian (Lampiran 2) yang menunjukkan bahwa diameter hambat
ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana tempe terhadap Staphylococcus aureus
tidak homogen, dengan demikian tidak memenuhi kriterian parametrik, oleh sebab
itu digunakan uji Kruskal-Wallis (Lampiran 3) yang menunjukkan nilai
signifikansi sebesar 0,001 (P < 0,05, taraf kepercayaan 95%), berarti terdapat
perbedaan antar kelompok bahan uji sedangkan untuk melihat perbedaan antar
kelompok dapat digunakan uji Mann-Withney (Lampiran 3).
Gambar 4.2. Daya hambat antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan n-heksana
tempe terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Adanya sifat kepolaran yang hampir sama dari golongan senyawa kimia
yang terkandung di dalam ekstrak etilasetat terhadap sifat lapisan membran luar
51
bakteri Gram positif (S. aureus) menyebabkan ekstrak etilasetat lebih mudah
masuk kedalam membran dinding sel bakteri Gram positif, seperti yang terlihat
pada Gambar 4.3 di mana terlihat bahwa efek antibakteri ekstrak etilasetat lebih
besar daripada ekstrak etanol, sedang untuk ekstrak n-heksana tidak menunjukkan
efek antibakteri. Senyawa glikoprotein (Bintari, et al., 2008), golongan protein
(amina) yang telah diisolasi media yang diinokulasikan biakan R. oligosporus
(Saraswaty, et al., 2002) dan senyawa flavonoid (isoflavon) merupakan beberapa
senyawa golongan antimikroba yang telah diteliti.
Gambar 4.3. Daya hambat gabungan antibakteri ekstrak etilasetat, etanol dan nheksana tempe terhadap bakteri Bacillus subtilis dan
Staphylococcus aureus.
Hasil pengujian ekstrak n-heksana yang diperoleh (Gambar 4.1 dan 4.2)
terlihat ekstrak n-heksana tidak memiliki daya hambat terhadap bakteri Gram
52
positif (B. subtilis dan S. aureus). Hasil ini dipengaruhi kandungan golongan
senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak n-heksana yang berupa senyawa non
polar yang ditarik pelarut n-heksana dengan jumlah yang lebih besar daripada di
dalam ekstrak etanol terhadap sifat lapisan membran luar (outer wall layer)
bakteri Gram positif yang membran luarnya terdiri dari lapisan peptidoglikan
yang lebih banyak dan bersifat polar, karena perbedaan kepolaran antara senyawa
kimia yang ditarik pelarut n-heksana dengan dinding sel bakteri Gram positif (B.
subtilis dan S. aureus), maka senyawa kimia yang tertarik dalam pelarut nheksana tidak dapat mempengaruhi permeabilitas membran sel bakteri Gram
positif yang bersifat polar.
53
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan
1.
Ekstrak etanol dan etilasetat tempe bersifat antibakteri terhadap
bakteri Gram positif Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus pada
konsentrasi 500 mg/ml dan 400 mg/ml.
2.
Ekstrak etilasetat tempe 500 mg/ml memiliki diameter hambat paling
besar terhadap S. aureus sebesar 15,50 ± 0,44 mm (P > 0,05) dan B.
subtilis sebesar 14,13 ± 0,21 mm (P > 0,05). Sedangkan ekstrak nheksan tempe tidak memiliki diameter hambat yang ditunjukkan tidak
berbeda signifikan dibanding kontrol terhadap bakteri B. subtilis dan
S. aureus.
5.2
Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk meneliti struktur kandungan
senyawa aktif dari ekstrak etilasetat tempe yang bersifat sebagai antibakteri.
54