Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ekstrak metanolik daun Apu-Apu (Pistia stratiotes L.) - USD Repository
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
EKSTRAK METANOLIK DAUN APU-APU (Pistia stratiotes L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi Oleh:
Nessya Trivianni NIM : 108114132
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
EKSTRAK METANOLIK DAUN APU-APU (Pistia stratiotes L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi Oleh:
Nessya Trivianni NIM : 108114132
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
Persetujuan Pembimbing
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
EKSTRAK METANOLIK DAUN APU-APU (Pistia stratiotes L.)
Skripsi yang diajukan oleh: Nessya Trivianni
NIM : 108114132 telah disetujui oleh : Pembimbing Utama (Yohanes Dwiatmaka, M.Si) tanggal 14 April 2014
Pengesahan Skripsi Berjudul
PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
EKSTRAK METANOLIK DAUN APU-APU (Pistia stratiotes L.)
Oleh : Nessya Trivianni
NIM : 108114132 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : ...........................
Mengetahui Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Dekan
(Ipang Djunarko, M.Sc., Apt.) Panitia Penguji : Tanda tangan 1.
................................. Yohanes Dwiatmaka, M.Si.
2.
................................. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt.
3.
................................. Jeffry Julianus, M.Si.
God knows every struggle that we face. God also knows for
sure that we able to conquer our struggle. Try, pray,
surrender, and believe that God will win us in every struggle.
Tuhan tahu setiap pergumulan yang kita hadapi. Tuhan juga tahu
dengan pasti bahwa kita mampu untuk menghadapi pergumulan
tersebut. Berusaha, berdoa, berserah, dan percayalah bahwa Tuhan
akan memenangkan kita di setiap pergumulan.(Nessya Trivianni) ...dan kemenangan ini kupersembahkan untuk Tuhan Yesus Kristus, papa Lie Lay Hwa dan mama Ho Siu Hwa, ciecie Wenni Aryani, koko Septian Adi Prasetya, keluarga besar, sahabat, teman, dan almamaterku tercinta
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 14 April 2014 Penulis Nessya Trivianni
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Nessya Trivianni Nomor mahasiswa : 108114132
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
EKSTRAK METANOLIK DAUN APU-APU (Pistia stratiotes L.)
”beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 14 April 2014 Yang menyatakan
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, kasih, dan penyertaan-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas
Antioksidan dengan Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Ekstrak
Metanolik Daun Apu-Apu (Pistia stratiotes L.)” dengan baik. Skripsi ini
disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi, penulis mendapatkan banyak bantuan, bimbingan, saran, kritik, dan dukungan dari banyak pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sekaligus Dosen Pembimbing Akademik penulis atas bimbingan dan nasehat yang diberikan selama ini.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas kesabaran dalam memberikan bimbingan, saran, kritik, dan dukungan hingga terselesaikannya skripsi ini dengan baik.
4. Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi atas saran dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam menguji skripsi ini.
5. Bapak Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi atas saran dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam menguji skripsi ini.
6. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
7. Mas Wagiran dan Mas Sigit, selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi- Fitokimia dan Laboratorium Biologi Dasar Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan yang telah banyak diberikan kepada penulis saat proses penelitian.
8. Eunike Yosefina Kurniawan, sahabat sekaligus teman seperjuangan dalam penelitian, atas keceriaan, semangat, dan diskusi selama ini.
9. Desi Irwanta Kate, sebagai teman seperjuangan dalam penelitian, atas semangat, ketegasan, dan diskusi selama proses penelitian.
10. Edward Dwiputra Prajitno, Eliza Telamiana Riyani Purbo, Chrisilia Cahyani, dan Baktiman Ande, para sahabat yang selalu memberikan keceriaan, semangat, dukungan, saran, dan kritik yang membangun bagi penulis.
11. Teman-teman FST B angkatan 2010 atas kebersamaan, kekompakan dan keceriaan selama ini.
12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, atas doa dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis bersedia menerima saran dan kritik dalam menyempurnakan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya di bidang farmasi.
Yogyakarta, 14 April 2014 Penulis
Nessya Trivianni
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN PERSEMBAHAN ..............................................................................iv
B. Tujuan Penelitian ....................................................................................... 4
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa.................................................................................................
32 Tabel II. Pembuatan kurva baku asam galat...................................................
34 Tabel III. Kandungan fenolik total ekstrak metanolik daun apu-apu.............
35 Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH....
37 Tabel V. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH .............................................................................................
41 Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun apu-apu dengan metode DPPH......................................................
42 Tabel VII. Hasil IC
50 rutin dan ekstrak metanolik daun apu-apu...................
43 Tabel VIII. Tingkatan kekuatan antioksidan dengan metode DPPH.............
44
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Struktur DPPH..............................................................................
10 Gambar 2. Perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning ketika tereduksi oleh senyawa antioksidan.............................................
11 Gambar 3. Hasil uji pendahuluan kandungan fenolik.....................................
29 Gambar 4. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan.................................. 30 Gambar 5. Grafik penentuan OT asam galat...................................................
31 Gambar 6. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanolik daun apu-apu..................................................
35 Gambar 7. Grafik penentuan OT rutin............................................................
38 Gambar 8. Grafik penentuan OT ekstrak metanolik daun apu-apu................
38 Gambar 9. Struktur rutin.................................................................................
40 Gambar 10. Grafik konsentrasi rutin vs. %IC................................................. 42 Gambar 11. Grafik konsentrasi ekstrak metanolik daun apu-apu vs. %IC.....
43
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman......................................
50 Lampiran 2. Gambar tanaman apu-apu...........................................................
51 Lampiran 3. Perhitungan rendemen................................................................
52 Lampiran 4. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total.... 53 Lampiran 5. Scanning kontrol asam galat....................................................... 53 Lampiran 6. Optimasi penetapan kandungan fenolik total.............................
54 Lampiran 7. Penetapan kandungan fenolik total............................................. 59 Lampiran 8. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan.........
66 Lampiran 9. Data konsentrasi bahan untuk pengujian aktivitas antioksidan..
67 Lampiran 10. Scanning larutan.......................................................................
74
76 Lampiran 11. Penentuan λ maksimum dan operating time (OT) untuk pengujian aktivitas antioksidan...............................................
Lampiran 12. Pengujian aktivitas antioksidan................................................
85 Lampiran 13. Perhitungan IC 50 rutin dan ekstrak metanolik daun apu-apu...
89 Lampiran 14. Hasil uji statistik dengan menggunakan program R 3.0.2........
91
INTISARI
Daun apu-apu (Pistia stratiotes L.) memiliki kandungan senyawa fenolik.Senyawa fenolik dapat berperan sebagai antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kandungan fenolik total dan menguji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ekstrak metanolik daun apu-apu.
Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan baku standar berupa asam galat dengan prinsip senyawa fenolik teroksidasi dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi, sehingga larutan berwarna biru. Warna yang ditimbulkan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer visibel. Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH yang prinsipnya penurunan intensitas absorbansi DPPH yang sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dalam IC 50 (Inhibition Concentration 50).
Penelitian menunjukkan bahwa kandungan fenolik total ekstrak metanolik daun apu-apu sebesar (0,5078 ± 0,0168) mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik. Aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun apu-apu tergolong lemah dengan nilai IC
50 sebesar (350,8152 ± 2,8591 ) μg/mL.
Kata kunci : Pistia stratiotes L., aktivitas antioksidan, DPPH, kandungan fenolik
total, IC
50
ABSTRACT
Apu-apu leaves (Pistia stratiotes L.) contain phenolic compound that can act as antioxidant. Antioxidant is a compound that can inhibit the reaction of free radical within the body. The aims of this study are to determine total phenolic content and antioxidant activity with DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) method in apu-apu leaves methanolic extract.
Total phenolic content determined by Folin-Ciocalteu method with gallic acid as standard compound, which the principle of this method is phenolic compound oxidized and Folin-Ciocalteu reagent reducted, which result a blue solution and the absorbance measured with spectrophotometer visible. Antioxidant activity determined by DPPH radical scavenging method, which the principle is the DPPH absorbance intensity decreasing proportional with the increasing of antioxidant compound concentration. Antioxidant activity expressed as IC
50 (Inhibition Concentration 50).
Research showed that total phenolic content of apu-apu leaves methanolic extract is (0,5078 ± 0,0168) miligrams gallic acid equivalent per gram of methanolic extract. Antioxidant activity of apu-apu leaves methanolic extract relatively weak with the IC
50 value (350,8152 ± 2,8591)
μg/mL.
Keywords : Pistia stratiotes L., antioxidant activity, DPPH, total phenolic
content, IC
50
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Reaksi oksidasi yang berlebihan di dalam tubuh menyebabkan timbulnya
berbagai penyakit, misalnya kanker, penuaan dini, artritis, dan sebagainya. Reaksi oksidasi mencetuskan terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif, yang dapat merusak fungsi dan struktur sel. Akan tetapi, reaktivitas radikal bebas tersebut dapat dihambat oleh sistem antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh.
Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan salah satu bentuk radikal bebas yang
memiliki elektron tidak berpasangan. Senyawa radikal bebas terbentuk secara terus-menerus di dalam tubuh, baik melalui proses metabolisme sel normal, peradangan, kekurangan gizi, serta akibat respons terhadap pengaruh eksternal, seperti polusi lingkungan, sinar ultraviolet, asap rokok, dan sebagainya. Radikal bebas memiliki reaktivitas yang sangat tinggi, tidak stabil, dan umurnya sangat singkat. Karena memiliki reaktivitas yang sangat tinggi, senyawa radikal bebas akan sesegera mungkin menyerang komponen seluler yang ada di sekitarnya, baik berupa lipid, lipoprotein, protein, karbohidrat, RNA, maupun DNA. Reaktivitas ini mengakibatkan kerusakan fungsi dan struktur dari sel (Marx, 1985; Winarsi, 2007).
Antioksidan merupakan senyawa pendonor elektron yang mampu menginaktivasi reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya radikal.
Senyawa antioksidan dapat menghambat reaksi oksidasi dengan meredam atau menetralkan radikal bebas, sehingga kerusakan sel bisa terhambat. Senyawa antioksidan dapat diperoleh dari senyawa-senyawa metabolit sekunder tanaman yang dalam strukturnya memiliki cincin aromatis fenol atau senyawa fenolik. Cincin aromatis fenol tersebut yang akan berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan (Shahidi, 1997; Winarsi, 2007).
Senyawa antioksidan sintetis seperti butylated hydroxytoluene (BHT),
butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ), dan propyl
gallate (PG), telah banyak digunakan secara luas selama beberapa dekade.
Namun, senyawa antioksidan sintetis ini kemungkinan memiliki efek toksik dan karsinogenik. Selama beberapa tahun terakhir, banyak penelitian yang mengeksplorasi senyawa antioksidan dari alam yang baru, aman, dan juga efektif. Banyak penelitian yang menunjukkan bahwa senyawa antioksidan dalam tanaman efektif dalam menghambat terbentuknya radikal bebas (Zou, Lu, and Wei, 2004; Azlim et al., 2010).
Apu-apu merupakan tanaman air yang biasa ditemukan di sawah, sungai, maupun danau. Daun dari tanaman ini telah digunakan sebagian masyarakat untuk mengobati berbagai penyakit, seperti batuk rejan, demam, dan luka. Daun apu-apu memiliki kandungan senyawa fenolik. Senyawa fenolik berpotensi sebagai antioksidan. Penggunaan ekstrak metanolik didasarkan pada senyawa fenolik yang lebih larut dalam pelarut polar, seperti metanol, etanol, aseton, dan lain-lain (Markham, 1988; Adi, 2007; Dalimartha, 2007; Pengelly, 2006).
Penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanolik daun apu-apu dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode Folin-Ciocalteu ini umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan fenolik total yang setara dengan massa ekivalen asam galat (Aqil, Ahmad, and Mehmood, 2006). Pengujian aktivitas antioksidan pada penelitian ini menggunakan metode DPPH (1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl ), suatu metode spektrofotometri visibel yang cepat,
efektif, dan sensitif dalam memperkirakan aktivitas antiradikal. Metode DPPH ini banyak digunakan dalam penelitian fitokimia untuk menguji aktivitas peredaman radikal bebas ekstrak. Parameter aktivitas antioksidan yang dihitung, yaitu IC
50
atau konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% aktivitas antioksidan (Windono, Budiono, Ivone, Valentina, dan Saputro, 2004).
1. Permasalahan a.
Berapa kandungan fenolik total ekstrak metanolik daun apu-apu? b.
Berapa nilai IC
50
ekstrak metanolik daun apu-apu? 2.
Keaslian penelitian
Sejauh penelusuran peneliti, penelitian yang serupa pernah dilakukan oleh Jha, Ganesh, and Sharma (2010). Penelitian tersebut menggunakan daun apu-apu yang dipanen dari Lower Lake, Bhopal (M.P), India dan melalui proses pengeringan. Metode ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi. Pada penelitian tersebut aktivitas antioksidan diuji dengan berbagai metode, yaitu
reductive ability , nitric oxide radical assay, dan superoxide scavenging activity .
Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan tersebut terletak pada penggunaan daun apu-apu yang masih segar, metode fenolik total. Dalam penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan, yaitu maserasi dan metode pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode
DPPH , serta menggunakan metode Folin-Ciocalteu untuk menetapkan kandungan fenolik total.
3. Manfaat penelitian a.
Manfaat teoritis Hasil penelitian diharapkan dapat memperkaya pengetahuan tentang aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun apu-apu dengan menggunakan metode DPPH.
b.
Manfaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan daun apu-apu, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan alami.
B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun apu-apu terhadap radikal DPPH.
2. Tujuan khusus a.
Untuk mengetahui kadar fenolik total dalam ekstrak metanolik daun apu- apu.
b. ekstrak metanolik daun apu-apu terhadap
50 Untuk mengetahui nilai IC radikal DPPH.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Apu - Apu 1. Nama lain dan sistematika apu-apu Tanaman apu-apu dikenal juga dengan nama : kiambang, kapu-kapu,
empieng ara, sarme-sarme, gajambang, sirambon, ki apu, kayu apu, apon-apon, kajeng apu, payapeh, apung-apung, capo-capo, poda-poda, water cabbage,
duck weed , tropical duck weed, jalkumbhi (Suhono, 2010).
Sistematika tanaman apu-apu menurut USDA (2014) adalah sebagai berikut : Kingdom : Plantae Sub kingdom : Tracheobionta Super divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Sub kelas : Arecidae Ordo : Arales Famili : Araceae Genus : Pistia L.
Spesies : Pistia stratiotes L.
2. Gambaran umum apu-apu
Tanaman apu-apu merupakan herba tahunan yang banyak terdapat di seluruh dunia. Di Indonesia, apu-apu dapat ditemukan mengapung di perairan.
Tanaman ini dapat tumbuh di perairan di dataran rendah, rawa sampai di danau di daerah pegunungan. Tanaman air ini tingginya 5-30 cm, berupa kumpulan daun membulat yang mengapung di air. Batangnya hampir tidak terlihat karena kecil dan dijejali oleh beberapa daun yang melingkar letaknya. Daun apu-apu berbentuk lonjong dengan ujung daun membulat. Daunnya berwarna hijau muda atau hijau tua, tebal, serta berambut banyak. Permukaan daun akan terasa seperti beludru ketika disentuh. Satu tanaman memiliki 3-7 lembar daun. Akar apu-apu mengambang dalam air dengan jumlah yang banyak dan tebal. Akar memiliki stolon dengan panjang mencapai 40 cm yang mengeluarkan tunas-tunas, sehingga tanaman hidup berumpun. Bunga terdapat dalam tongkol yang berseludang berwarna putih dengan ukuran 1-1,5 cm. Bunga jantan berada di bagian atas dan bunga betina di bagian bawah tongkol. Tangkai bunga sangat pendek, berbulu, keluar dari ketiak daun. Buah berupa buah buni berwarna merah berukuran kecil. Buah memiliki biji fertil yang dapat ditanam menjadi individu baru (Suhono, 2010).
Tanaman apu-apu di beberapa daerah merupakan gulma perairan, sehingga keberadaannya sangat mengganggu. Dalam waktu yang singkat, tanaman ini dapat memenuhi permukaan kolam. Cepatnya pertumbuhan ini disebabkan oleh adanya stolon yang memiliki beberapa tunas, sehingga akan muncul tanaman baru (Suhono, 2010).
3. Kegunaan dan khasiat apu-apu
Di Indonesia, daun apu-apu dimanfaatkan untuk memijahkan ikan, sebagai tanaman hias di akuarium, pakan babi, bebek, itik, ayam, ikan gurami, serta ikan mas. Remasan daun digunakan untuk tapal bila terkena air panas. Rebusan daun atau akarnya dapat digunakan sebagai obat pencahar. Daun muda dapat direbus untuk lalap (Suhono, 2010).
Herba apu-apu rasanya pedas dan terasa sejuk, berkhasiat antireumatik, anti radang, diaforetik, dan diuretik. Herba apu-apu dapat digunakan untuk mengobati flu, demam, batuk rejan, memar, reumatik, edema, disuria, kencing nanah, gatal-gatal, disentri, serta penyakit kulit seperti bisul dan eksim. Kandungan kimia yang terdapat dalam tanaman apu-apu ini antara lain flavonoid, tanin, dan polifenol. (Dalimartha, 2007).
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik adalah kelompok terbesar metabolit sekunder pada tanaman. Senyawa fenolik termasuk dalam alkohol aromatik sebab gugus hidroksilnya selalu melekat pada cincin benzen. Seyawa fenolik secara umum memiliki potensi sebagai bakterisidal, antiseptik, antioksidan, dan sebagainya (Pengelly, 2006). Senyawa fenolik merupakan kelompok mayoritas senyawa yang dapat bertindak sebagai antioksidan. Alasan inilah yang mendukung untuk melakukan analisis kandungan fenolik total dalam suatu ekstrak tanaman (Veeru, Kishkar, and Meennakashi, 2009).
Reaksi yang terjadi pada senyawa fenolik bisa melalui gugus aromatisnya. Senyawa fenolik dapat mengkompleks protein, sehingga dapat menghambat beberapa enzim. Sifat ini menguntungkan pada proses ekstraksi karena reaksi enzimatik tidak diharapkan selama proses ekstraksi terjadi (Simpson, 1985).
C. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut. Sedangkan, ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran partikel tertentu menggunakan cairan penyari yang sesuai. Metode ekstraksi yang paling sederhana, yaitu maserasi.
Pada maserasi penyarian simplisia dilakukan dengan menggunakan bermacam pelarut pada suhu kamar selama beberapa waktu (Agoes, 2009).
Pada saat proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel dengan yang berada di luar sel, maka larutan dengan konsentrasi tinggi didesak keluar.
Peristiwa tersebut terjadi berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986).
D. Radikal Bebas dan Antioksidan
Radikal bebas adalah spesies kimia yang memiliki elektron tak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil. Untuk mendapatkan kestabilannya, spesies tersebut bersifat reaktif mencari pasangan elektronnya di sekitarnya, terbentuk melalui homolisis ikatan kimia yang biasanya dipacu oleh cahaya. Satu spesies radikal bebas dapat memacu pembentukan radikal bebas yang lain melalui berbagai reaksi pengambilan dan adisi. Reaksi radikal bebas kebanyakan merupakan reaksi rantai yang setiap tahapnya memberikan hasil yang mengakibatkan terbentuknya radikal bebas yang memperpanjang runtunan reaksi (Ardhie, 2011; Joedodibroto dan Hadiwidjoyo, 1988).
Antioksidan merupakan senyawa yang memiliki kemampuan untuk meredam radikal bebas. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, serta DNA, dan dapat menginisiasi timbulnya penyakit degeneratif. Senyawa antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid meredam radikal bebas peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, and Miller, 2007).
E. Metode Folin-Ciocalteu
Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang berisi campuran natrium tungstat, natrium molibdat, lithium sulfat, asam klorida, asam fosfat, bromin, dan air suling. Senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu membentuk larutan berwarna yang dapat diukur serapannya dengan spektrofotometer. Prinsip metode Folin - Ciocalteu ini, yaitu terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru dari senyawa fenolik sampel dengan reagen dalam suasana basa yang dapat diukur pada panjang gelombang 760 nm (Blainski, Lopes, and Mello, 2013).
Ion fenolat dari senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten melalui reduksi asam fosfomolibdat - fosfotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Warna biru yang terbentuk kepekatannya setara dengan konsentrasi ion fenolat yang ada, artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik, maka semakin banyak ion fenolat yang mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat menjadi senyawa kompleks molibdenum-tungsten, sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Apsari dan Susanti, 2011; Waterhouse, 2002).
F. Metode DPPH
Metode yang cepat, sederhana, dan ekonomis untuk mengukur aktivitas antioksidan yakni dengan menggunakan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Metode DPPH banyak digunakan untuk menguji kemampuan suatu senyawa dalam bertindak sebagai peredam radikal bebas atau sebagai donor elektron, serta untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dalam suatu sampel (Prakash et al, 2007).
Gambar 1. Struktur DPPH (Sanchez, Garcia, and Cors, 2010) Elektron tak berpasangan pada radikal bebas DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning sebanding dengan penurunan serapan molar radikal
DPPH pada panjang gelombang 517 nm. Hal tersebut terjadi ketika elektron tak
berpasangan pada radikal bebas DPPH berpasangan dengan elektron dari antioksidan untuk membentuk DPPH-H tereduksi (Prakash et al, 2007).
Gambar 2. Perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning ketika tereduksi oleh senyawa antioksidan (Perez and Aguilar, 2013)
G. Landasan Teori
Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memicu terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki elektron tak berpasangan, sehingga tidak stabil. Untuk mencapai sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, DNA, dan dapat memicu penyakit degeneratif. Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat tercegah.
Apu-apu merupakan tanaman air yang mudah ditemukan dan berkhasiat sebagai antireumatik, anti radang, diaforetik, dan diuretik. Masyarakat biasanya menggunakan apu-apu untuk mengobati flu, demam, batuk rejan, memar, reumatik, edema, disuria, kencing nanah, gatal-gatal, disentri, bisul, dan eksim.
Apu-apu telah diketahui memiliki kandungan senyawa fenolik, sehingga dapat berpotensi sebagai antioksidan.
Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat dianalisis dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Prinsipnya, yaitu reduksi reagen campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat dengan adanya senyawa fenolik akan menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru yang serapannya kuat pada panjang gelombang 760 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut sebanding dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel.
Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk menguji suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Elektron tak berpasangan DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning ketika terdapat senyawa antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH.
H. Hipotesis 1.
Ekstrak metanolik daun apu-apu memiliki kandungan senyawa fenolik yang dinyatakan dengan mg ekivalen asam galat.
2. Ekstrak metanolik daun apu-apu memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH yang dinyatakan sebagai IC
50 .
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap pola searah. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas : konsentrasi ekstrak metanolik daun apu-apu.
b.
Variabel tergantung : aktivitas antioksidan (%IC).
c.
Variabel pengacau terkendali : waktu pemanenan, tempat tumbuh.
d.
Variabel pengacau tak terkendali : umur daun yang dipanen.
2. Definisi operasional a.
Daun apu-apu adalah daun dari tanaman apu-apu yang dipanen dari kolam di Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta, dengan bentuk daun yang lonjong dan membulat di bagian ujungnya, memiliki permukaan seperti beludru, berwarna hijau, dengan panjang ± 6 cm dan lebar ± 4 cm.
b.
Ekstrak metanolik daun apu-apu adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil maserasi daun apu-apu segar dengan metanol. c.
Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan ekstrak metanolik daun apu-apu dalam meredam radikal
DPPH .
d.
50 ) adalah nilai konsentrasi ekstrak
Inhibition concentration 50 (IC metanolik daun apu-apu yang dapat meredam 50% radikal DPPH.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain : daun apu-apu yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta; bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades (Farmasi Sanata Dharma); bahan kimia kualitas pro analitik E.Merck berupa metanol; bahan kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA berupa rutin, DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, dan asam galat; serta bahan kimia kualitas teknis CV. General Labora berupa metanol dan alumunium
foil .
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain : blender (Maspion),
shaker (Innova TM 2100), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis
(Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), waterbath (labo-tech, Heraeus), vacuum rotary evaporator (BUCHI Rotavapor R-3), corong Buchner, pompa vakum (GAST manufacturing inc. DOA-P604-BN), mikropipet 10-1000 µl, 1-10 mL (Acura 825, Socorex), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany dan Iwaki).
E. Tata Cara Penelitian 1.
Determinasi tanaman
Determinasi tanaman apu-apu yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta, dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan USDA (2014).
2. Pengumpulan bahan Pengumpulan daun apu-apu dilakukan pada bulan Januari 2014.
Pemanenan dari kolam Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta dilakukan sebelum tanaman berbunga dan saat pagi hari. Daun yang dipanen adalah daun dewasa berwarna hijau dengan panjang ± 6 cm dan lebar ± 4 cm.
3. Preparasi daun apu-apu
Daun apu-apu segar sebanyak 600 g dibersihkan dari pengotor- pengotor, dicuci dengan air mengalir, dan diangin-anginkan. Daun apu-apu kemudian dihaluskan menggunakan blender dengan ditambahkan sedikit cairan penyari metanol. Daun yang sudah halus dituang ke dalam bejana maserasi, ditambah metanol hingga terendam sempurna, dan dilakukan maserasi selama 24 jam pada suhu ruangan. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner dan pompa vakum, kemudian ampasnya diremaserasi selama
24 jam, dan dilakukan penyaringan kembali. Filtrat yang diperoleh sebanyak 2,1 L kemudian diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator,
◦
waterbath , dan oven dengan suhu 50C, sehingga diperoleh ekstrak metanolik kental dengan bobot tetap yang akan digunakan untuk analisis lebih lanjut.
Ekstrak metanolik kental dengan bobot tetap berupa ekstrak kental berwarna hijau tua kecoklatan dengan aroma khas daun.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji a.
Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dalam metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b.
Pembuatan larutan stok rutin Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL.
c.
Pembuatan larutan pembanding Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL kemudian diencerkan dengan metanol p.a hingga 25,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 5, 10, 15, 20, dan 25 µg/mL.
d.
Pembuatan larutan uji i.
Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sebanyak 25,0 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak
1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100, 200, 300, 400, dan 500 µg/mL. ii.
Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total Sebanyak 100 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 10000 µg/mL.
e.
Pembuatan larutan asam galat Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam campuran akuades dengan metanol p.a (1:1). Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL kemudian ditambah dengan akuades : metanol p.a (1:1) hingga 10,0 mL dan diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan a.
Uji fenolik Sebanyak 0,5 mL larutan uji dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Campuran didiamkan selama 10 menit kemudian ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan tersebut diamati.
b.
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi dan masing-masing ditambah dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan larutan uji 500,0 µg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a dan divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, warna pada larutan tersebut diamati.
6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a.
Penentuan operating time (OT) Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 30 menit.
b.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan didiamkan selama OT. Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum pada panjang gelombang 600-800 nm.
7. Penetapan kandungan fenolik total a.
Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) dan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M. Larutan didiamkan selama OT. Serapan dibaca pada panjang gelombang serapan maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium karbonat 1 M. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b.
Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diberi perlakuan seperti pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik). Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a.
Penentuan operating time (OT) Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan 1 mL larutan DPPH, 1 mL larutan pembanding rutin 5, 15, dan 25 µg/mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada larutan uji dengan konsentrasi 100, 300, dan 500 µg/mL.
b.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan
0,5; 1,0; dan 1,5 mL larutan DPPH, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukkan dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT teoritis 30 menit. Dilakukan
scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
9. Uji aktivitas antioksidan a.
Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b.
Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Dilakukan pembacaan serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
c.