Deteksi Ekpsresi mRNA dan Protein

DETEKSI EKSPRESI mRNA DAN PROTEIN
Oleh : Dr. Daniel Joko Wahyono, M.Biomed

Pendahuluan
Salah satu fungsi dasar yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik

adalah fungsi fenotipik. Artinya,

DNA harus mampu mengatur

pertumbuhan dan

diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fenotipe
organisme sangat ditentukan oleh hasil interaksi protein-protein di dalam sel. Setiap protein

tersusun dari sejurnlah asam amino dengan urutan tertentu, dan setiap asam amino
pembentukannya disandi (dikode) oleh urutan basa nitrogen

Rangkaian proses

ini, mulai dari DNA hingga terbentuknya

sebagai dogma sentral genetika

/4

I

di dalam molekul

DNA.

asam amino, dikenal

molekuler (Susanto, 2012).

___*__+

t

DNA

replikasi

RNA
transkripsi

--}

asam amlno

translasi

Gambar 1. Diagrarn dogma sentral genetika molekuler

Pada Gambar 1 menunjukkan perubahan urutan basa

di dalam molekul DNA menjadi

ututan basa molekul RNA dinamakan transkripsi, sedangkan peneq'emahan urutan basa
RNA menjadi urutan asatn amino suatu protein dinamakan translasi. Jadi, proses tanskripsi

dan translasi dapat dilihat sebagai tahap-tahap ekspresi urutan basa DNA. Namun, tidak

DNA akan diekspresikan menjadi urutan asam amino. Urutan basa DNA
yang pada akhimya menyandi urutan asam amino disebut sebagai gen. Dengan demikian,
selnua urutan basa

kirnia gen adalah urutan basa nitrogen tertentu pada molekul DNA yang dapat
dieskpresikan melalui tahaptahap transkripsi dan translasi rnenjadi urutan asam amino
teftentu. Secara umum mekanisme transkripsi pada prokariot dan eukariot hampir salna.
Hanya saja, pada prokariot produk langsung transkripsi atau transkrip prirnernya adalah
mRNA (akan dijelaskan di bawah), sedangkan pada eukariot transkrip primernya harus
secara

bio.unsoed.ac.id

rnengalami prosesing RNA terlebih dahulu sebelum menjadi mRNA. Prosesing

RNA ini

mencakup dua peristiwa, yaitu modiflkasi kedua ujung transkrip primer dan pembuangan

urutan basa pada transkrip primer yang tidak akan ditranslasi (disebut intron). Ujung 5'

dimodifikasi dengan penambahan guanosin dalam ikatan 5'-5' yang tidak umum hingga
terbentuk suatu gugus terminal yang dinamakancap, sedangkan ujung 3' dimodifikasi
dengan urutan poliadenosin (poli A) sepanjang lebih kurang 200 basa. Sementara itu,
panjang intron yang harus dibuang dapat mencapar 50Yo hingga 90% dai, panjang transkrip
primer, tetapi segmen yang mengandung ujung 5' (gugus cap) tidak pernah dibuang.

Setelah intron dibuang, segmen-segmen sisanya (disebutekson) segera digabungkan
menjadi mRNA. Pembuangan intron dan penggabungan ekson menjadi molekul mRNA
dinamakan penyatuan RNA atau KNA splicing. Translasi, atau pada hakekatnya sintesis

protein, berlangsung

di dalam ribosom, suatu struktur organel yang ban.vak

terdapat di

dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu
selama inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosorn sering

dinyatakan atas dasar laju pengendapannlra selama sentrifugasi sebagai satuan yang
disebut satuan Svedberg (S). Pada kebanyakan prokariot ribosom mempunyai ukuran 70S,
sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S (Susanto,2012).

Teknik Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
Teknik RT-PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi transkrip gen yang terdiri
dari tiga tahap yaitu isolasi RNA total, sintesis cDNA, dan arnplifikasi daerah transkip gen
target. Tahap peftama adalah isolasi RNA sampel klinis berasal dari jaringan tubuh, misal

darah, spesimen biopsi jaringan, dan kultur sel/jaringan. Isolasi RNA merupakan proses

untuk mendapatkan mRNA yang terkandung dalam sel melalui beberapa langkah sebagai
berikut : perlama, melisiskan sel dan nukleus; kedua, pemisahan DNA/RNA dan protein
dengan metoda presipitasi protein; ketiga, pemisahan RNA dan DNA dengan ensim DNase;

keempat, penyimpanan RNA dalam ddH2O bebas enzim nuklease. Larutan RNA yang
diperoleh dapat langsung digunakan untuk analisis Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
atau disitnpan dalam jangka waktu lama pada suhu -80 "C. Tahap kedua adalah sintesis

cDNA

bio.unsoed.ac.id

(komplemen DNA) merupakan proses untuk mengubah RNA khususnya mRNA

(messenger RNA) gen target menjadi cDNA dengan enzim reverse transcriptase dan Oligo

(dT)rr

primer

Larutan cDNA disimpan pada suhu 2-8 C bila akan segera digunakan

disimpan selama l-2 jam atau dilakukan penyimpanan dalam jangka waktu larna pada suhu

gen target menggunakan
-15 s/d -25 C. Tahap ketiga adalah amplifikasi daerah transkrip
menghasilkan amplikon
primer oligonukleotida yang spesifik. Amplifikasi dua tahap PCR

secara biokimia
oDNA yang merupakan ekspresi transkrip gen target dan divisualisasi
teknik RT-PCR dalam mendeteksi
dengan elektroforesis pada gel agarose. Aplikasi klinis
penderita KNF
gen target adalah ekspresi mRNA BRLF1 EBV pada
ekspresi transkrip

pada jaringan tumor KNF sebesar 4
menunjukkan bahwa positivitas ekspresi BRLF1 EBV
dan 3 dari 8 sampel
7 sampel biopsi tumor KNF (57,1 persen) (Feng et a1.,2000)

dai

biopsi tumor KNF (37,5 persen) (Martelrenotr et al',1995)'

{.s{.

t.s1

yr.lt,
*a*'

ffie

'"

tr"

ilr

6u.7*gii:1

iffi

i

'..' .:,:i'

s'i
"'."*',&.4,ftr.:r

,

i:-'i :

*

n*,,&,,

s

ri

ifxeS:e
-,r,,,
tt- 1
.

.':,ir ..:

/1|;:

*"-..$':lt+

+dfiF

*

'

W.kl.iNZ

i i41=

**u,t,.mj'

'*#

ri

iqi!-qr

"*'

l,'!-:''#

'*"'-

I "sj;::i:il:r

::::;:;H

#,4i,'i:
tr

Gambar 2.

ffi

}iil']"*"$::

l

ffiE+

l:tl::r#k*

BRLFl,
Autoradiogra.f RT-PCR yang menunjukkan ekspresi mRNA BZLFI,
jaringan
biopsi
(a)
priV
dan
aari sampel klinis darah
BALF2 dan BCLF1
(b).

ekspresi
Gambar 2. memperlihatkan penggunaaan teknik RT-PCR untuk identifikasi
BCLFI EBV dari sampel klinis darah dan
genBZLFl, BRLF1

,BALFZ,

mRNA (trankrip)

pertama 36 siklus
biopsi jaringan. Amplifikasi dilakukan dalam dua tahap PCR yaitu tahap
pcR dan tahap kedua dengan 20 siklus PCR. Amplikon fragmen CDNA diseparasi pada gel

membran nilon. Selanjutnya amplikon fragmen cDNA
dengan radioaktif'
dihibridisasi dengan pelacak oligonuleotida spesifik yang telah dilabel
pada fihn sinar X' Gen
Visualisasi arnplikon fragmen cDNA dengan teknik autoradiografi
dalarn RT-PCR" Kontrol
house keepirtg Histone 3.3. digunakan sebagai internal kontrol

agarose dan ditransfer

ke

bio.unsoed.ac.id

(Feng et al'' 2000)'
positif sampel menggunakan RNA yang berasal dari galur sel 895-8

Beberapa hal yang penting untuk diperhatikan dalam prosedur RT-PCR adalah
RNAse yang
sebagai berikut (Steven et a1.,2005) : pertama, RNA sangat rentan terhadap

banyak terdapat

di sekitar kita, sehingga

sangat dianjurkan menggunakan alat-alat yang

bebas dari RNAse seperti tabung Eppendorf dan

tip

mikropipet; kedua, peralatan

pada
laboratorium berbahan gelas sebaiknya di bungkus dengan aluminum dan disterilisasi
larutan yang
suhu > 180 "C selama 2 iarn untuk degradasi RNAse; ketiga, reagen dan

digunakan sebaiknya bebas RNAse atau diberi perlakuan dengan diethyl pyrocarbonat
(DEpC) 0,1 o/o v/v yang telah disterilisasi; keempat, .oleh karena Tris-HCl bersifat sangat

reaktif dengan DEpC, maka sebaiknya bahan kimia ini tidak boleh diperlakukan dengan
DEPC; kelima, pacla saat melakukan isolasi RNA sangat dianjurkan menggunakan samng
sebelum
tangan karet (glove). Tutup tabung eppendorfjangan dibuka terlalu lama; keenam,

bekerja meja laboratorium sebaiknya dibersihkan dengan larutan natirum hipoklorit
o
(pemutih pakaian/soklin), etanol 70 , atau 0,1 % SDS; ketujuh, RNA dianjurkan disirnpan
pada suhu -80

"C

untuk penyimpanan waktu lama; kedelapan, pada saat melakukan isolasi

RNA sebaiknya selama bekerja diperlakukan di atas es (suhu
isopropanol stok sebaiknya disimpan pacla suhu -80

"C

4 'C);

kesembilan,

untuk penyimpanan waktu lama;

kesepuluh, seluruh reagen Reverse Transcriptase sebaiknya disimpan pada suhu -20 'C.
pada saat melakukan sintesis cDNA sebiaknya bekerja di atas es (suhu 4 "C); kesebelas,

DNA dapat disimpan pada suhu -20 "C untuk penyimpanan waktu lama atau sebelum
digunakan untuk PCR dan reagen PCR sebaiknya disimpan pada suhu -20 "C; kedua belas,
preparasi untuk membuat campuran PCR (PCR rui-r) sebaiknya dilakukan di atas es (suhu 4
oC selama l-2 han,
"C); ketiga belas, produk PCR (amplikon) dapat disimpan pada suhu 4
oC untuk penyirnpanan rn'aktu lama
namun produk PCR dianjurkan disirnpan pada suhu -20
guna menghindari degradasi oleh aktivitas 5'-eksonuklease dari enzim Zcg polymerase"

Teknik multiprime RT-PCR

bio.unsoed.ac.id

Teknik mtLltiprime RT-PCR adalah teknik RT-PCR yang sensitif untuk mendeteksi
ekspresi 6RNA gen laten pada biopsi jaringan tumor kultur sel dan darah. Teknik
nttiltiprinte RT-PCR digunakan untuk mendeteksi secara simultan ekspresi mRNA EBV
yaitu EBNAI, EBNA2, LMP1, LMP2A, LMP2B, BZLFI, BARTs, dan U1A snRNP

sebagai gen hottsekeeping gene untrtk kontrol internal kuantitas RNA. Selanjutnya,
hibridisasi amplikon fragmen cDNA dengan pelacak olioneukleotida spesifik yang telah
dilabel dengan radioaktif dilakukan untuk meningkatkan spesifitas. Visualisasi amplikon

fragmen cDNA yang menunjukkan ekspresi transkrip gen laten dilakukan dengan
autoradigrafi pada

film sinar X (Steven et al., 2005). Teknik ini lebih sensitif untuk

mendeteksi mRNA yang mengalami proses pembuangan intron (spliced mRNA) dalam

jumlah kecil dan memerlukan lebih sedikit jumlah sampel klinis. Teknik ini lebih efisien
digunakan untuk biopsi jaringan limfoma dengan jumlah sedikit dan menghasilkan kualitas

kontrol yang lebih baik. Pada sampel klinis kuantitas RNA perlu diukur terlebih dahulu
sebelum dianalis RT-PCR dengan teknik gel elektroforesis RNA untuk mendeteksi 18S/28S

RNA (Brinket a\.,1997; Brink et a1.,1998; Middeldorp et a1.,2003). Teknik multipritne
RT-PCR ini merupakan teknik yang ideal untuk melihat profil ekspresi transkrip gen laten

EBV khususnya pada ekspresi gen laten I, II, dan III pada biopsi jaringan, kultur sel, dan
darah (Steven et a|.,2005).

;4