Hubungan Viabilitas Sel Ekspresi Protein
126
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
Hubungan Viabilitas Sel, Ekspresi Protein P53 dan Ki-67
pada Kultur Fibroblas Gingiva Manusia yang Dipajan Lipopolisakarida
Bakteri Gram-Negatif
(The Correlation between Cell Viability, Expression of p53 Protein and Ki-67
on Cultured Human Gingival Fibroblasts Exposed to Bacterial
Lipopolysaccharide)
Banun Kusumawardani
Staf Pengajar Bagian Periodontologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
ABSTRACT
Bacterial lipopolysaccharide (LPS) are potent inflammatory agents and play a major role in inflammatory
periodontal disease, but LPS also have direct cytotoxic effects on cells of the periodontium.is implicated in
etiology of inflammatory periodontal disease. The purpose of this study was to investigate the correlation
between cell viability with expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki67 on cultured human gingival fibroblasts exposed to LPS. Cultured human gingival fibroblasts were exposed to
LPS in concentration of 50 and 200 μg/ml and untreated medium for a period of 24, 48, 72, and 96 hours. Cells
were harvested and prepared for immunohistochemically methods.The correlation between cell viability with
expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki-67 were significant. The
growth of gingival fibroblasts is partially inhibited by LPS, but the left viable cells continue to proliferate and
eventually attains a cell density equivalent to unexposed cells. Up-regulation of p53 protein during the initially
logarithmic phase of growth may be a consequence of on going DNA damage. Ki-67 is consistently absent in
quiescent cells and in confluent monolayer culture.
Keywords: bacterial lipopolysaccharide, gingival fibroblasts, cell viability, p53 protein, Ki-67.
PENDAHULUAN
Periodontopatogen yang diduga sebagai
penyebab
penyakit
periodontal
adalah
mikroorganisme gram-negatif (Loesche et al.,
1985), dan yang sangat berhubungan dengan
penyakit periodontal destruktif adalah spesies
Bacteroides dan spirochete (Slot, 1979; Lopez,
2000). Spesies bakteri gram-negatif ini
mempunyai lipopolisakarida (LPS), yang
merupakan suatu komponen struktural dari
selaput
luar
bakteri
gram-negatif.
Lipopolisakarida dapat dideteksi pada plak gigi
(Duguid, 1985) dan permukaan akar gigi
(Olson et al., 1985).
Pajanan LPS dengan konsentrasi 100
sampai 1000 μg/ml dan waktu pajanan sampai
7 hari pada kultur sel fibroblas tikus dapat
menurunkan pertumbuhan dan viabilitas sel
(Olson et al., 1985), tetapi Takata et al., (1997)
mendapatkan sel junctional epithelium tikus
dapat memulai siklus sel untuk berproliferasi
setelah dipapar LPS dengan konsentrasi 5
mg/ml selama 1 hari.
Elemen selular yang banyak ditemukan dari
jaringan ikat gingiva adalah fibroblas (Itoiz dan
Carranza, 1996). Fibroblas secara normal
hanya menunjukkan pertumbuhan yang
minimal pada jaringan ikat dewasa, namun
pada
kondisi
patologis
dan
selama
penyembuhan luka, fibroblas teraktivasi untuk
meningkatkan level proliferasi dan sintesis
(Ross, 1968 sit Ko et al., 1981). Fibroblas
memulai sintesis DNA setelah 15 sampai 18
jam dan mencapai maksimal pada 22 sampai 24
jam, selanjutnya akan menurun (Ko et al., 1977
sit Ko et al., 1981).
Pada penelitian ini, viabilitas sel diobservasi
untuk mengetahui pengaruh pajanan LPS pada
kultur sel fibroblas gingiva manusia. Viabilitas
sel adalah jumlah sel yang sehat dalam suatu
sampel, tanpa membedakan apakah sel-sel
membelah secara aktif atau quiescent (Wyllie
et al., 2000).
Pajanan bahan yang bersifat sitotoksik
dapat mengakibatkan kerusakan sel. Untuk
mencegah akibat yang tidak diinginkan, sel
mempunyai
metode
untuk
mendeteksi
kerusakan DNA dan tindakan bunuh diri (King,
2000). Kerusakan DNA tersebut dapat
dideteksi oleh protein p53. Setelah protein p53
menghentikan siklus sel maka kerusakan
diperbaiki atau dapat memicu apoptosis dan
kematian sel. Protein p53 berinteraksi dengan
sejumlah besar protein sel dan berintegrasi
dengan banyak sinyal yang mengontrol hidup
dan mati sel (Vogelstein et al., 2000).
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
Protein p53 menstimulasi perbaikan DNA.
Jika perbaikan DNA berhasil, maka proliferasi
sel akan dilanjutkan untuk memelihara massa
sel (King, 2000). Proliferasi sel dapat
diestimasi dengan KI-67, karena ekspresi Ki-67
dapat diobservasi pada inti sel yang
berproliferasi dan terletak pada siklus sel fase
G1, S, G2, dan M (Gerdes et al., 1984).
Ekspresi protein p53 dan Ki-67 belum
diteliti pada sel fibroblas gingiva manusia yang
dipajan LPS. Penelitian tentang aksi LPS
tersebut merupakan hal-hal pokok untuk
klarifikasi
mekanisme
aktivitas
LPS.
Determinasi aktivitas proliferasi sel fibroblas
gingiva setelah pajanan LPS dapat bermanfaat
untuk mengetahui aktivitas biologis LPS pada
jaringan periodontal. Penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan data tentang 1) hubungan
viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
2) hubungan ekspresi protein p53 dengan Ki-67
pada kultur sel fibroblas gingiva manusia yang
telah dipajan LPS konsentrasi 50 dan 200
μg/ml dengan waktu pajanan 24, 48, 72 dan 96
jam
METODE
Prosedur Kultur Primer Sel Fibroblas
Gingiva Manusia
Jaringan gingiva diambil dari gingiva bebas
pada gigi P1 untuk perawatan ortodontik yang
sudah diekstraksi. Pasien sehat, tanpa gejala
klinis inflamasi atau hiperplasi gingiva, dan
tanpa riwayat penyakit sistemik, dan tidak
merokok.
Jaringan gingiva diletakkan ke dalam petri
dish, dicuci tiga kali dengan PBS yang
mengandung penicillin dan streptomycin untuk
menghindari
kemungkinan
kontaminasi
bakteri. Jaringan gingiva dipotong-potong
berukuran sekitar 1 mm3, kemudian diberi 5
ml media kultur dan diinkubasi ke dalam
inkubator CO2 5%, 37 oC selama 3 hari.
Eksplan jaringan gingiva dipindahkan dari petri
dish. Media kultur diganti hingga pertumbuhan
sel mencapai konfluensi yang memungkinkan
untuk dipasase (subkultur). Kultur sel
dimonitor dengan inverted microscope.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode
dye exclution test
Suspensi sel fibroblas yang mengandung
sekitar 2 x 104sel/200μl dipindahkan ke dalam
96 multiwell plate (MP), kemudian diberi
media kultur. Setelah diinkubasi selama 48
jam, media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi
127
200 μl media kultur yang mengandung LPS
Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan
200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol
hanya diberi media kultur. Setiap konsentrasi
dibuat 5 replikasi. Setelah diinkubasi selama
24, 48, 72 dan 96 jam, sel fibroblas diberi
trypan blue. Semua sel dihitung, baik yang
hidup atau mati pada bilik hitung
hemositometer. Hasil penghitungan sel
dikonversikan menjadi persentase viabilitas sel.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode
Imunohistokimiawi
Suspensi sel fibroblas yang mengandung
sekitar 2 × 105 sel/ml dipindahkan ke dalam 24
multiwell plate (MP), kemudian diberi media
kultur. Setelah diinkubasi selama 48 jam,
media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi 1 ml
media kultur yang mengandung LPS
Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan
200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol
hanya diberi media kultur. Setelah diinkubasi
selama 24, 48, 72, dan 96 jam, sel-sel fibroblas
dipisahkan dengan trypsin dan dipindahkan ke
dalam mini tube, selanjutnya dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit. Suspensi sel
diteteskan pada slide poly-L-lisin dan
dikeringkan pada suhu kamar. Fiksasi dengan
methanol PA, kemudian aseton PA. Sediaan
kemudian
diaplikasi
dengan
hidrogen
peroksida 0,5% dalam methanol absolut selama
10 menit, untuk mengakhiri aktivitas
endogenous peroxidase. Aplikasi dalam normal
serum, kemudian diaplikasi antibodi primer
dengan dilusi 1:100 untuk p53 dan 1:50 untuk
Ki-67. Inkubasi selama semalam pada 4oC.
Inkubasi dalam biotinylated secondary
antibody,
kemudian
diinkubasi
dalam
streptavidine peroxidase. Setiap tahap dicuci
dengan PBS 2 x 5 menit. Aplikasi DAB dan
dicuci pada air mengalir selama 15 menit.
Counterstained dengan Harry’s hematoxylin.
Mounting dengan Canada balsam dan sediaan
ditutup dengan deckglass. Dilihat dibawah
mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
Semua sel dihitung, baik yang terekspresi atau
tidak pada 5 lapang pandang. Inti sel yang
terekspresi protein p53 dan Ki-67 berwarna
coklat. Hasil penghitungan sel dikonversikan
menjadi persentase ekspresi p53 dan Ki-67.
Analisis Data
Uji statistik Pearson Correlation digunakan
untuk mengetahui hubungan di antara hasilhasil pengamatan, yaitu viabilitas sel dengan
128
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
ekspresi protein p53, dan hubungan antara
ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67.
banyak sel fibroblas yang hidup akan membuat
ekspresi protein p53 semakin sedikit. Hasil uji
yang menunjukkan signifikansi hubungan
antara viabilitas sel fibroblas gingiva manusia
dengan ekspresi protein p53 dapat dilihat pada
Gambar 1 dan 2.
Terdapat hubungan positif yang kuat (p <
0,01) antara ekspresi protein p53 dengan Ki-67.
Semakin tinggi ekspresi protein p53 akan
membuat ekspresi Ki-67 semakin tinggi pula.
Hasil uji yang menunjukkan signifikansi
hubungan antara ekspresi protein p53 dengan
Ki-67 dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penghitungan sel dinyatakan dalam
bentuk persentase viabilitas sel, ekspresi
protein p53, dan ekspresi Ki-67. Rerata
persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53
dan Ki-67 untuk tiap kelompok sampel dapat
dilihat pada Tabel 1.
Terdapat hubungan negatif yang kuat (p <
0,01) antara viabilitas sel fibroblas gingiva
manusia dengan ekspresi protein p53. Semakin
Tabel 1. Rerata persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53 dan Ki-67
Konsentrasi
(μg/ml)
Kontrol
Waktu
(Jam)
24
48
72
96
Viabilitas Sel
(Rerata ± SD)
100 ± 0
100 ± 0
100 ± 0
100 ± 0
Ekspresi p53
(Rerata ± SD)
0±0
0±0
0±0
0±0
Ekspresi Ki67
(Rerata ± SD)
0±0
0±0
0±0
0±0
LPS 50
24
48
72
96
78,31 ± 2,45
86,15 ± 2,65
95,52 ± 1,24
99,17 ± 1,86
81,71 ± 8,56
32,15 ± 6,11
0±0
0±0
45,83 ± 30,62
14,33 ± 7,34
0±0
0±0
LPS 200
24
48
72
96
61,87 ± 1,29
73,79 ± 4,72
95,35 ± 1,54
99,26 ± 1,65
88,80 ± 6,61
21,13 ± 3,97
0±0
0±0
13,56 ± 12,26
8,12 ± 5,17
0±0
0±0
LPS-50
120
presentase
100
80
viabilitas
60
p53
40
Ki-67
20
0
24
48
72
96
waktu
Gambar 1. Hubungan antara viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
hubungan ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67 pada kultur
sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS 50 μg/ml
129
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
LPS-200
120
Presentase
100
80
viabilitas
60
p53
40
Ki-67
20
0
24
48
72
96
Waktu
Gambar 2. Hubungan antara viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
hubungan ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67 pada kultur
sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS 200 μg/ml
Pada Tabel 1, Gambar 1 dan 2
menunjukkan bahwa pajanan LPS konsentrasi
50 dan 200 μg/ml pada waktu pajanan 24 jam
menurunkan viabilitas sel, meningkatkan
ekspresi protein p53 dan meningkatkan
ekspresi Ki-67. Jika waktu inkubasi kultur sel
fibroblas gingiva manusia ditambah sampai 48,
72 dan 96 jam maka viabilitas sel akan
bertambah sampai mencapai viabilitas sel yang
mirip dengan kelompok kontrol, sedangkan
ekspresi protein p53 dan Ki-67 akan berkurang
sampai sama dengan kelompok kontrol.
Analisis siklus sel pada hari ke 3 dan 7
menunjukkan persentase sel pada fase S
menurun sampai 72%, persentase sel pada fase
G0 atau G1 meningkat sampai 37%, dan
persentase sel pada fase G2 atau M tetap
konstan selama kultur Marrioti dan Cochran,
1990). Oleh karena itu hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol
viabilitas sel tetap konstan, tidak ada ekspresi
protein p53 dan Ki-67 selama waktu pajanan
24, 48, 72 dan 96 jam.
Pada hari pertama inkubasi (24 jam) diduga
terjadi upregulation dari p53 wild type yang
merupakan konsekuensi dari kerusakan DNA,
sehingga protein p53 menginduksi penghentian
sementara siklus sel agar menyediakan waktu
yang cukup untuk perbaikan kerusakan. Jika
tidak mungkin terjadi perbaikan, p53
mempromotori apoptosis untuk mengeliminasi
sel fibroblas yang rusak karena pajanan LPS.
Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa
kultur sel fibroblas gingiva pada kelompok
perlakuan di awal inkubasi diduga telah
mengalami apoptosis dan perbaikan DNA.
Apoptosis sel fibroblas gingiva tersebut
merupakan suatu mekanisme sel untuk
mengatur pertumbuhan, diferensiasi, dan
turnover sel. Hal ini didukung oleh hasil
penelitian yang menunjukkan bahwa pada
waktu pajanan 72 dan 96 jam tidak ada
ekspresi p53, dan pada penghitungan jumlah
sel fibroblas gingiva yang hidup diperoleh hasil
bahwa pada akhir periode inkubasi, jumlah sel
fibroblas gingiva mencapai suatu densitas sel
seperti pada densitas sel yang tidak dipajan
LPS.
Terdapat hubungan negatif yang kuat antara
viabilitas sel fibroblas gingiva manusia dengan
ekspresi protein p53, yaitu semakin banyak sel
fibroblas yang hidup akan membuat ekspresi
protein p53 semakin sedikit. King (2000)
berpendapat bahwa pajanan bahan yang
bersifat sitotoksik dapat mengakibatkan
kerusakan sel. Untuk mencegah akibat yang
tidak diinginkan, sel mempunyai metode untuk
mendeteksi kerusakan DNA dan tindakan
bunuh diri. Kerusakan DNA tersebut dapat
dideteksi oleh protein p53. Setelah protein p53
menghentikan siklus sel maka kerusakan
diperbaiki atau dapat memicu apoptosis dan
kematian sel. Protein p53 berinteraksi dengan
sejumlah besar protein sel dan berintegrasi
dengan banyak sinyal yang mengontrol hidup
dan mati sel (Vogelstein dkk, 2000). Oleh
karena itu kerusakan DNA akibat pajanan LPS
dapat dideteksi oleh protein p53, sehingga sel
fibroblas gingiva yang hidup dapat melanjutkan
130
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
proliferasi dan kerusakan DNA tidak
diturunkan pada sel anak.
Protein p53 memegang peranan dalam
sintesis, perbaikan DNA dan apoptosis. Protein
p53 bereaksi sebagai faktor transkripsi untuk
beberapa gen, misalnya p53 menghambat
proliferasi dengan menginduksi p21 (cyclindependent kinase inhibitor), p53 menstimulasi
perbaikan DNA dan p53 mempromotori
apoptosis dengan meningkatkan bax dan
menurunkan bcl2 (King, 2000). Jadi kerusakan
DNA dapat diperbaiki dengan perubahan
koordinasi antara proliferasi, perbaikan DNA
dan apoptosis, sehingga dihasilkan sel-sel anak
yang normal pada saat mitosis.
Berdasarkan pernyataan Lazzaro dan
Cleveland (2000) maka persentase pengecatan
sel untuk ekspresi Ki-67 pada penelitian ini
menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol,
hasil penghitungan rerata persentase ekspresi
Ki-67 untuk semua waktu pajanan adalah 0%,
maka dianggap negatif. Rerata persentase
ekspresi Ki-67 terendah pada kelompok
perlakuan, yaitu 0% dihasilkan pada
konsentrasi LPS 50 dan 200 μg/ml dengan
waktu pajanan 72 dan 96 jam, hasil ini juga
dikategorikan negatif, sedangkan rerata
persentase ekspresi Ki-67 tertinggi pada
kelompok perlakuan, yaitu 45,83% dihasilkan
pada konsentrasi LPS 50 μg/ml dengan waktu
pajanan 24 jam, dapat dikategorikan sedang.
Pada
kelompok
perlakuan
lainnya
menunjukkan hasil ekspresi Ki-67 pada
kategori rendah, yaitu antara 1% - 15%.
Hasil tersebut di atas mengindikasikan
bahwa inti sel fibroblas gingiva yang bereaksi
positif terhadap Ki-67 mempunyai kemampuan
proliferasi yang terbatas. Hal ini mirip dengan
penelitian
Saygun
dkk
(2003)
yang
menunjukkan bahwa sel fibroblas dari lesi
hereditary gingival fibromatosis tidak ada yang
terekspresi Ki-67. Shirasuna dkk (1989)
melaporkan bahwa fibroblas gingiva dari
pasien dengan congenital gingival fibromatosis
menunjukkan sedikit proliferasi daripada
gingiva normal, tetapi jumlah biosintesis
kolagen dan glikosaminoglikan adalah cukup
besar.
Terdapat hubungan positif yang kuat antara
ekspresi protein p53 dengan Ki-67 yaitu
semakin tinggi ekspresi protein p53 akan
semakin tinggi pula ekspresi Ki-67, tetapi
penggunaan Ki-67 untuk memperkirakan
aktivitas proliferatif tidak dianjurkan pada
jaringan yang terekspresi p53 atau p21 secara
berlebihan (Meer dkk, 2003). Ki-67 secara
konsisten tidak ditemukan pada sel quiescent
dan tidak dapat dideteksi selama proses
perbaikan DNA (Schlüter dkk, 1995). Oleh
karena pada penelitian ini protein p53
terekspresi secara berlebihan dan protein p53
berperan dalam proses perbaikan DNA, maka
KI-67 lebih sedikit terekspresi daripada protein
p53.
Menurut Ko dkk (1981) bahwa pada siklus
sel fibroblas gingiva, sintesis protein terus
meningkat dan sintesis DNA mencapai level
maksimal setelah 24 jam. Pernyataan tersebut
mengindikasikan bahwa hasil penelitian ini,
pada hari pertama inkubasi (24 jam)
pertumbuhan sel fibroblas gingiva sebagian
dihambat oleh LPS, tetapi sel fibroblas gingiva
yang hidup akan terus berproliferasi dan
akhirnya mencapai densitas sel yang ekuivalen
dengan sel yang tidak dipajan LPS.
Pada jam ke 72 dan 96 tidak ditemukan
ekspresi protein p53 dan Ki-67 pada kultur sel
fibroblas gingiva setelah dipajan LPS. Pada
jam ke 72 dan 96 tersebut kultur sel fibroblas
gingiva sudah membentuk cell monolayer yang
konfluen (homogen dan merata) pada dasar
multiwell plate. Pada keadaan tersebut sel akan
menghentikan
proliferasi
dan
juga
pertumbuhannya (Albert dkk, 1994).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah
dilakukan pada kultur sel fibroblas gingiva
manusia, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Pertumbuhan sel fibroblas gingiva
sebagian dihambat oleh LPS, tetapi sel
fibroblas gingiva yang hidup akan
terus berproliferasi dan akhirnya
mencapai densitas sel yang ekuivalen
dengan sel yang tidak dipajan LPS.
2. Ekspresi protein p53 yang berlebihan
pada waktu pajanan LPS 24 jam
diprediksikan bahwa banyak sel
fibroblas gingiva yang mengalami
kerusakan DNA.
3. Ki-67 lebih sedikit terekspresi
daripada ekspresi protein p53, karena
Ki-67 tidak ditemukan pada sel
quiescent.
DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., Bray, D., Lewiis, J., Raff, M.,
Roberts, K., Watson, JD. 1994.
Molecular biology of the cell. 3rd ed.
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
Garland Publishing, Inc. New York &
London. 863-910.
Duguid, R. 1985. Inhibition of 3H-thymidine
uptake in human gingival fibroblasts
by extracts from human dental plaque,
oral bacteria of the Streptococcus and
Actinomyces species. Arch Oral Biol
;30;89-93.
Fine, D.H., Mendietta, C., Barnett, M.L.,
Furgang, D., Naini, A., Vincent, J.W.,
1992.
Endotoxin
levels
in
periodontally healthy and diseased
sites: correlation with levels of Gramnegative bacteria. J Periodontol
;63:897-901.
Gerdes, J., Lemke, M., Baisch, H., Wacker,
H.H., Schwab, U., Stein, H. 1984. Cell
cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear defined by
the monoclonal antibody Ki67. J
Immunol ;133:1710-1715.
Itoiz, ME., Carranza, FA. 1996. Periodontal
microbiology in Carranza, FA., and
Newman,
MG.
Clinical
Periodontology. 8th ed. WB Saunders
Company. Philadelphia. 12-29.
King, RJB. 2000. Cancer Biology. 2nd ed.
Pearson Education. England. 146-173.
Ko, SD., Narayanan, AS., Page, RC. 1981.
Influence of cell cycle on collagen
synthesis
by
human
gingival
fibroblasts. J Periodontol Res ;16:302308.
Lazzaro, B., Cleveland, D. 2000. P53 and
antigen Ki-67 expression in small oral
biopsy specimens of salivary gland
tumors. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod ;89:613617.
Loesche, W.J., Syed, S.A., Schmidt, E.,
Morrison, E.C. 1985. Bacterial
profiles of subgingival plaques in
periodontitis. J Periodontol ;56:447456.
Lopez, N.J. 2000. Occurrence of Actinobacillus
actinomycetemcomitans,
Porphyromonas
gingivalis,
and
Prevotella intermedia in progressive
adult periodontitis. J Periodontol
;71:948-954.
Marrioti,
A.,
Cochran,
DL.
1990.
Characterization of fibroblasts derived
from human periodontal ligament and
gingiva. J Periodontol;61:103-111.
131
Meer, S., Galpin, JS., Altini, M., Coleman, H.,
Ali, H. 2003. Proliferating cell nuclear
antigen and Ki-67 immunoreactivity
in ameloblastoma. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod;95:213-221.
Olson, R.H., Adams, D.F., Layman, D.L. 1985.
Inhibitory effects of periodontally
diseased root extracts on the growth of
human
gingival
fibroblasts.
J
Periodontol ;56:592-596.
Saygun, I., Özdemir, A., Günhan, Ö.,
Aydintuğ, YS., Karslioğlu, Y. 2003.
Hereditary gingival fibromatosis and
expression of Ki-67 antigen: a case
report. J Periodontol;74:873-878.
Schlüter, C., Duchrow, M., Wohlenberg, C.,
Becker, MHG., Key, G., Flad, HD.,
Gerdes, J. 1995. The cell proliferationassociated antigen of antibody Ki-67:
a very large, ubiquitous nuclear
protein with numerous repeated
elements, representing a new kind of
cell cycle-maintaining proteins. J Cell
Biol;123:513-522.
Shirasuna, K., Okura, M., Watanani, K.,
Hayashido, Y., Saka, M., Matsura, T.
1989. Abnormal celular property of
fibroblasts from an unidentified
syndrome with gingival hyperplasia as
the predominant feature. J Oral
Pathol; 7:381-385.
Simon, B.I., Goldman, H.M., Ruben, M.P.,
Baker, E. 1970. The role of endotoxin
in periodontal disease. II. Correlation
of the quantity of endotoxin human
gingival exydate with the clinical
degree of inflammation. J Periodontol
;41:81-86.
Slot, J., Bragd, L., Dahlen, G. 1986. The
occurrence
of
Actinobacillus
actinomycetescomitans, Bacteroides
gingivalis,
and
Bacteroides
intermedius in destructive periodontal
disease
in
adults.
J
Clin
Periodontol;13:570-576.
Takata, T., Miyauchi, M., Ogawa, I., Ito, H.,
Kobayashi, J., Nikai, H. 1997.
Reactive change in proliferative
activity of the junctional epithelium
after
topical
application
of
lipopolysaccharide. J Periodontol,
68:531-535.
132
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
Thompson, CB. 1995. Apoptosis in the
pathogenesis and treatment of disease.
Science ;267:1456-1462.
Tipton, DA., Braxton, SD., Dabbous, MK.
1995. Role of salivary components as
modulators of bleaching agent toxicity
to human gingival fibroblasts in vitro.
J Periodontol;66:766-774.
Vogelstein, B., Lane, D., Levine, AJ. 2000.
Surfing
the
p53
network.
Nature;408:307-310.
Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D.,
Kesey, J., Manzow, S. 2000. Guide to
cell proliferation and apoptosis
methods.
Roche
Diagnostics
Corporation.
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
Hubungan Viabilitas Sel, Ekspresi Protein P53 dan Ki-67
pada Kultur Fibroblas Gingiva Manusia yang Dipajan Lipopolisakarida
Bakteri Gram-Negatif
(The Correlation between Cell Viability, Expression of p53 Protein and Ki-67
on Cultured Human Gingival Fibroblasts Exposed to Bacterial
Lipopolysaccharide)
Banun Kusumawardani
Staf Pengajar Bagian Periodontologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
ABSTRACT
Bacterial lipopolysaccharide (LPS) are potent inflammatory agents and play a major role in inflammatory
periodontal disease, but LPS also have direct cytotoxic effects on cells of the periodontium.is implicated in
etiology of inflammatory periodontal disease. The purpose of this study was to investigate the correlation
between cell viability with expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki67 on cultured human gingival fibroblasts exposed to LPS. Cultured human gingival fibroblasts were exposed to
LPS in concentration of 50 and 200 μg/ml and untreated medium for a period of 24, 48, 72, and 96 hours. Cells
were harvested and prepared for immunohistochemically methods.The correlation between cell viability with
expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki-67 were significant. The
growth of gingival fibroblasts is partially inhibited by LPS, but the left viable cells continue to proliferate and
eventually attains a cell density equivalent to unexposed cells. Up-regulation of p53 protein during the initially
logarithmic phase of growth may be a consequence of on going DNA damage. Ki-67 is consistently absent in
quiescent cells and in confluent monolayer culture.
Keywords: bacterial lipopolysaccharide, gingival fibroblasts, cell viability, p53 protein, Ki-67.
PENDAHULUAN
Periodontopatogen yang diduga sebagai
penyebab
penyakit
periodontal
adalah
mikroorganisme gram-negatif (Loesche et al.,
1985), dan yang sangat berhubungan dengan
penyakit periodontal destruktif adalah spesies
Bacteroides dan spirochete (Slot, 1979; Lopez,
2000). Spesies bakteri gram-negatif ini
mempunyai lipopolisakarida (LPS), yang
merupakan suatu komponen struktural dari
selaput
luar
bakteri
gram-negatif.
Lipopolisakarida dapat dideteksi pada plak gigi
(Duguid, 1985) dan permukaan akar gigi
(Olson et al., 1985).
Pajanan LPS dengan konsentrasi 100
sampai 1000 μg/ml dan waktu pajanan sampai
7 hari pada kultur sel fibroblas tikus dapat
menurunkan pertumbuhan dan viabilitas sel
(Olson et al., 1985), tetapi Takata et al., (1997)
mendapatkan sel junctional epithelium tikus
dapat memulai siklus sel untuk berproliferasi
setelah dipapar LPS dengan konsentrasi 5
mg/ml selama 1 hari.
Elemen selular yang banyak ditemukan dari
jaringan ikat gingiva adalah fibroblas (Itoiz dan
Carranza, 1996). Fibroblas secara normal
hanya menunjukkan pertumbuhan yang
minimal pada jaringan ikat dewasa, namun
pada
kondisi
patologis
dan
selama
penyembuhan luka, fibroblas teraktivasi untuk
meningkatkan level proliferasi dan sintesis
(Ross, 1968 sit Ko et al., 1981). Fibroblas
memulai sintesis DNA setelah 15 sampai 18
jam dan mencapai maksimal pada 22 sampai 24
jam, selanjutnya akan menurun (Ko et al., 1977
sit Ko et al., 1981).
Pada penelitian ini, viabilitas sel diobservasi
untuk mengetahui pengaruh pajanan LPS pada
kultur sel fibroblas gingiva manusia. Viabilitas
sel adalah jumlah sel yang sehat dalam suatu
sampel, tanpa membedakan apakah sel-sel
membelah secara aktif atau quiescent (Wyllie
et al., 2000).
Pajanan bahan yang bersifat sitotoksik
dapat mengakibatkan kerusakan sel. Untuk
mencegah akibat yang tidak diinginkan, sel
mempunyai
metode
untuk
mendeteksi
kerusakan DNA dan tindakan bunuh diri (King,
2000). Kerusakan DNA tersebut dapat
dideteksi oleh protein p53. Setelah protein p53
menghentikan siklus sel maka kerusakan
diperbaiki atau dapat memicu apoptosis dan
kematian sel. Protein p53 berinteraksi dengan
sejumlah besar protein sel dan berintegrasi
dengan banyak sinyal yang mengontrol hidup
dan mati sel (Vogelstein et al., 2000).
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
Protein p53 menstimulasi perbaikan DNA.
Jika perbaikan DNA berhasil, maka proliferasi
sel akan dilanjutkan untuk memelihara massa
sel (King, 2000). Proliferasi sel dapat
diestimasi dengan KI-67, karena ekspresi Ki-67
dapat diobservasi pada inti sel yang
berproliferasi dan terletak pada siklus sel fase
G1, S, G2, dan M (Gerdes et al., 1984).
Ekspresi protein p53 dan Ki-67 belum
diteliti pada sel fibroblas gingiva manusia yang
dipajan LPS. Penelitian tentang aksi LPS
tersebut merupakan hal-hal pokok untuk
klarifikasi
mekanisme
aktivitas
LPS.
Determinasi aktivitas proliferasi sel fibroblas
gingiva setelah pajanan LPS dapat bermanfaat
untuk mengetahui aktivitas biologis LPS pada
jaringan periodontal. Penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan data tentang 1) hubungan
viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
2) hubungan ekspresi protein p53 dengan Ki-67
pada kultur sel fibroblas gingiva manusia yang
telah dipajan LPS konsentrasi 50 dan 200
μg/ml dengan waktu pajanan 24, 48, 72 dan 96
jam
METODE
Prosedur Kultur Primer Sel Fibroblas
Gingiva Manusia
Jaringan gingiva diambil dari gingiva bebas
pada gigi P1 untuk perawatan ortodontik yang
sudah diekstraksi. Pasien sehat, tanpa gejala
klinis inflamasi atau hiperplasi gingiva, dan
tanpa riwayat penyakit sistemik, dan tidak
merokok.
Jaringan gingiva diletakkan ke dalam petri
dish, dicuci tiga kali dengan PBS yang
mengandung penicillin dan streptomycin untuk
menghindari
kemungkinan
kontaminasi
bakteri. Jaringan gingiva dipotong-potong
berukuran sekitar 1 mm3, kemudian diberi 5
ml media kultur dan diinkubasi ke dalam
inkubator CO2 5%, 37 oC selama 3 hari.
Eksplan jaringan gingiva dipindahkan dari petri
dish. Media kultur diganti hingga pertumbuhan
sel mencapai konfluensi yang memungkinkan
untuk dipasase (subkultur). Kultur sel
dimonitor dengan inverted microscope.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode
dye exclution test
Suspensi sel fibroblas yang mengandung
sekitar 2 x 104sel/200μl dipindahkan ke dalam
96 multiwell plate (MP), kemudian diberi
media kultur. Setelah diinkubasi selama 48
jam, media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi
127
200 μl media kultur yang mengandung LPS
Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan
200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol
hanya diberi media kultur. Setiap konsentrasi
dibuat 5 replikasi. Setelah diinkubasi selama
24, 48, 72 dan 96 jam, sel fibroblas diberi
trypan blue. Semua sel dihitung, baik yang
hidup atau mati pada bilik hitung
hemositometer. Hasil penghitungan sel
dikonversikan menjadi persentase viabilitas sel.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode
Imunohistokimiawi
Suspensi sel fibroblas yang mengandung
sekitar 2 × 105 sel/ml dipindahkan ke dalam 24
multiwell plate (MP), kemudian diberi media
kultur. Setelah diinkubasi selama 48 jam,
media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi 1 ml
media kultur yang mengandung LPS
Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan
200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol
hanya diberi media kultur. Setelah diinkubasi
selama 24, 48, 72, dan 96 jam, sel-sel fibroblas
dipisahkan dengan trypsin dan dipindahkan ke
dalam mini tube, selanjutnya dilakukan
sentrifugasi selama 10 menit. Suspensi sel
diteteskan pada slide poly-L-lisin dan
dikeringkan pada suhu kamar. Fiksasi dengan
methanol PA, kemudian aseton PA. Sediaan
kemudian
diaplikasi
dengan
hidrogen
peroksida 0,5% dalam methanol absolut selama
10 menit, untuk mengakhiri aktivitas
endogenous peroxidase. Aplikasi dalam normal
serum, kemudian diaplikasi antibodi primer
dengan dilusi 1:100 untuk p53 dan 1:50 untuk
Ki-67. Inkubasi selama semalam pada 4oC.
Inkubasi dalam biotinylated secondary
antibody,
kemudian
diinkubasi
dalam
streptavidine peroxidase. Setiap tahap dicuci
dengan PBS 2 x 5 menit. Aplikasi DAB dan
dicuci pada air mengalir selama 15 menit.
Counterstained dengan Harry’s hematoxylin.
Mounting dengan Canada balsam dan sediaan
ditutup dengan deckglass. Dilihat dibawah
mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
Semua sel dihitung, baik yang terekspresi atau
tidak pada 5 lapang pandang. Inti sel yang
terekspresi protein p53 dan Ki-67 berwarna
coklat. Hasil penghitungan sel dikonversikan
menjadi persentase ekspresi p53 dan Ki-67.
Analisis Data
Uji statistik Pearson Correlation digunakan
untuk mengetahui hubungan di antara hasilhasil pengamatan, yaitu viabilitas sel dengan
128
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
ekspresi protein p53, dan hubungan antara
ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67.
banyak sel fibroblas yang hidup akan membuat
ekspresi protein p53 semakin sedikit. Hasil uji
yang menunjukkan signifikansi hubungan
antara viabilitas sel fibroblas gingiva manusia
dengan ekspresi protein p53 dapat dilihat pada
Gambar 1 dan 2.
Terdapat hubungan positif yang kuat (p <
0,01) antara ekspresi protein p53 dengan Ki-67.
Semakin tinggi ekspresi protein p53 akan
membuat ekspresi Ki-67 semakin tinggi pula.
Hasil uji yang menunjukkan signifikansi
hubungan antara ekspresi protein p53 dengan
Ki-67 dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penghitungan sel dinyatakan dalam
bentuk persentase viabilitas sel, ekspresi
protein p53, dan ekspresi Ki-67. Rerata
persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53
dan Ki-67 untuk tiap kelompok sampel dapat
dilihat pada Tabel 1.
Terdapat hubungan negatif yang kuat (p <
0,01) antara viabilitas sel fibroblas gingiva
manusia dengan ekspresi protein p53. Semakin
Tabel 1. Rerata persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53 dan Ki-67
Konsentrasi
(μg/ml)
Kontrol
Waktu
(Jam)
24
48
72
96
Viabilitas Sel
(Rerata ± SD)
100 ± 0
100 ± 0
100 ± 0
100 ± 0
Ekspresi p53
(Rerata ± SD)
0±0
0±0
0±0
0±0
Ekspresi Ki67
(Rerata ± SD)
0±0
0±0
0±0
0±0
LPS 50
24
48
72
96
78,31 ± 2,45
86,15 ± 2,65
95,52 ± 1,24
99,17 ± 1,86
81,71 ± 8,56
32,15 ± 6,11
0±0
0±0
45,83 ± 30,62
14,33 ± 7,34
0±0
0±0
LPS 200
24
48
72
96
61,87 ± 1,29
73,79 ± 4,72
95,35 ± 1,54
99,26 ± 1,65
88,80 ± 6,61
21,13 ± 3,97
0±0
0±0
13,56 ± 12,26
8,12 ± 5,17
0±0
0±0
LPS-50
120
presentase
100
80
viabilitas
60
p53
40
Ki-67
20
0
24
48
72
96
waktu
Gambar 1. Hubungan antara viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
hubungan ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67 pada kultur
sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS 50 μg/ml
129
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
LPS-200
120
Presentase
100
80
viabilitas
60
p53
40
Ki-67
20
0
24
48
72
96
Waktu
Gambar 2. Hubungan antara viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan
hubungan ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67 pada kultur
sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS 200 μg/ml
Pada Tabel 1, Gambar 1 dan 2
menunjukkan bahwa pajanan LPS konsentrasi
50 dan 200 μg/ml pada waktu pajanan 24 jam
menurunkan viabilitas sel, meningkatkan
ekspresi protein p53 dan meningkatkan
ekspresi Ki-67. Jika waktu inkubasi kultur sel
fibroblas gingiva manusia ditambah sampai 48,
72 dan 96 jam maka viabilitas sel akan
bertambah sampai mencapai viabilitas sel yang
mirip dengan kelompok kontrol, sedangkan
ekspresi protein p53 dan Ki-67 akan berkurang
sampai sama dengan kelompok kontrol.
Analisis siklus sel pada hari ke 3 dan 7
menunjukkan persentase sel pada fase S
menurun sampai 72%, persentase sel pada fase
G0 atau G1 meningkat sampai 37%, dan
persentase sel pada fase G2 atau M tetap
konstan selama kultur Marrioti dan Cochran,
1990). Oleh karena itu hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol
viabilitas sel tetap konstan, tidak ada ekspresi
protein p53 dan Ki-67 selama waktu pajanan
24, 48, 72 dan 96 jam.
Pada hari pertama inkubasi (24 jam) diduga
terjadi upregulation dari p53 wild type yang
merupakan konsekuensi dari kerusakan DNA,
sehingga protein p53 menginduksi penghentian
sementara siklus sel agar menyediakan waktu
yang cukup untuk perbaikan kerusakan. Jika
tidak mungkin terjadi perbaikan, p53
mempromotori apoptosis untuk mengeliminasi
sel fibroblas yang rusak karena pajanan LPS.
Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa
kultur sel fibroblas gingiva pada kelompok
perlakuan di awal inkubasi diduga telah
mengalami apoptosis dan perbaikan DNA.
Apoptosis sel fibroblas gingiva tersebut
merupakan suatu mekanisme sel untuk
mengatur pertumbuhan, diferensiasi, dan
turnover sel. Hal ini didukung oleh hasil
penelitian yang menunjukkan bahwa pada
waktu pajanan 72 dan 96 jam tidak ada
ekspresi p53, dan pada penghitungan jumlah
sel fibroblas gingiva yang hidup diperoleh hasil
bahwa pada akhir periode inkubasi, jumlah sel
fibroblas gingiva mencapai suatu densitas sel
seperti pada densitas sel yang tidak dipajan
LPS.
Terdapat hubungan negatif yang kuat antara
viabilitas sel fibroblas gingiva manusia dengan
ekspresi protein p53, yaitu semakin banyak sel
fibroblas yang hidup akan membuat ekspresi
protein p53 semakin sedikit. King (2000)
berpendapat bahwa pajanan bahan yang
bersifat sitotoksik dapat mengakibatkan
kerusakan sel. Untuk mencegah akibat yang
tidak diinginkan, sel mempunyai metode untuk
mendeteksi kerusakan DNA dan tindakan
bunuh diri. Kerusakan DNA tersebut dapat
dideteksi oleh protein p53. Setelah protein p53
menghentikan siklus sel maka kerusakan
diperbaiki atau dapat memicu apoptosis dan
kematian sel. Protein p53 berinteraksi dengan
sejumlah besar protein sel dan berintegrasi
dengan banyak sinyal yang mengontrol hidup
dan mati sel (Vogelstein dkk, 2000). Oleh
karena itu kerusakan DNA akibat pajanan LPS
dapat dideteksi oleh protein p53, sehingga sel
fibroblas gingiva yang hidup dapat melanjutkan
130
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
proliferasi dan kerusakan DNA tidak
diturunkan pada sel anak.
Protein p53 memegang peranan dalam
sintesis, perbaikan DNA dan apoptosis. Protein
p53 bereaksi sebagai faktor transkripsi untuk
beberapa gen, misalnya p53 menghambat
proliferasi dengan menginduksi p21 (cyclindependent kinase inhibitor), p53 menstimulasi
perbaikan DNA dan p53 mempromotori
apoptosis dengan meningkatkan bax dan
menurunkan bcl2 (King, 2000). Jadi kerusakan
DNA dapat diperbaiki dengan perubahan
koordinasi antara proliferasi, perbaikan DNA
dan apoptosis, sehingga dihasilkan sel-sel anak
yang normal pada saat mitosis.
Berdasarkan pernyataan Lazzaro dan
Cleveland (2000) maka persentase pengecatan
sel untuk ekspresi Ki-67 pada penelitian ini
menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol,
hasil penghitungan rerata persentase ekspresi
Ki-67 untuk semua waktu pajanan adalah 0%,
maka dianggap negatif. Rerata persentase
ekspresi Ki-67 terendah pada kelompok
perlakuan, yaitu 0% dihasilkan pada
konsentrasi LPS 50 dan 200 μg/ml dengan
waktu pajanan 72 dan 96 jam, hasil ini juga
dikategorikan negatif, sedangkan rerata
persentase ekspresi Ki-67 tertinggi pada
kelompok perlakuan, yaitu 45,83% dihasilkan
pada konsentrasi LPS 50 μg/ml dengan waktu
pajanan 24 jam, dapat dikategorikan sedang.
Pada
kelompok
perlakuan
lainnya
menunjukkan hasil ekspresi Ki-67 pada
kategori rendah, yaitu antara 1% - 15%.
Hasil tersebut di atas mengindikasikan
bahwa inti sel fibroblas gingiva yang bereaksi
positif terhadap Ki-67 mempunyai kemampuan
proliferasi yang terbatas. Hal ini mirip dengan
penelitian
Saygun
dkk
(2003)
yang
menunjukkan bahwa sel fibroblas dari lesi
hereditary gingival fibromatosis tidak ada yang
terekspresi Ki-67. Shirasuna dkk (1989)
melaporkan bahwa fibroblas gingiva dari
pasien dengan congenital gingival fibromatosis
menunjukkan sedikit proliferasi daripada
gingiva normal, tetapi jumlah biosintesis
kolagen dan glikosaminoglikan adalah cukup
besar.
Terdapat hubungan positif yang kuat antara
ekspresi protein p53 dengan Ki-67 yaitu
semakin tinggi ekspresi protein p53 akan
semakin tinggi pula ekspresi Ki-67, tetapi
penggunaan Ki-67 untuk memperkirakan
aktivitas proliferatif tidak dianjurkan pada
jaringan yang terekspresi p53 atau p21 secara
berlebihan (Meer dkk, 2003). Ki-67 secara
konsisten tidak ditemukan pada sel quiescent
dan tidak dapat dideteksi selama proses
perbaikan DNA (Schlüter dkk, 1995). Oleh
karena pada penelitian ini protein p53
terekspresi secara berlebihan dan protein p53
berperan dalam proses perbaikan DNA, maka
KI-67 lebih sedikit terekspresi daripada protein
p53.
Menurut Ko dkk (1981) bahwa pada siklus
sel fibroblas gingiva, sintesis protein terus
meningkat dan sintesis DNA mencapai level
maksimal setelah 24 jam. Pernyataan tersebut
mengindikasikan bahwa hasil penelitian ini,
pada hari pertama inkubasi (24 jam)
pertumbuhan sel fibroblas gingiva sebagian
dihambat oleh LPS, tetapi sel fibroblas gingiva
yang hidup akan terus berproliferasi dan
akhirnya mencapai densitas sel yang ekuivalen
dengan sel yang tidak dipajan LPS.
Pada jam ke 72 dan 96 tidak ditemukan
ekspresi protein p53 dan Ki-67 pada kultur sel
fibroblas gingiva setelah dipajan LPS. Pada
jam ke 72 dan 96 tersebut kultur sel fibroblas
gingiva sudah membentuk cell monolayer yang
konfluen (homogen dan merata) pada dasar
multiwell plate. Pada keadaan tersebut sel akan
menghentikan
proliferasi
dan
juga
pertumbuhannya (Albert dkk, 1994).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah
dilakukan pada kultur sel fibroblas gingiva
manusia, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Pertumbuhan sel fibroblas gingiva
sebagian dihambat oleh LPS, tetapi sel
fibroblas gingiva yang hidup akan
terus berproliferasi dan akhirnya
mencapai densitas sel yang ekuivalen
dengan sel yang tidak dipajan LPS.
2. Ekspresi protein p53 yang berlebihan
pada waktu pajanan LPS 24 jam
diprediksikan bahwa banyak sel
fibroblas gingiva yang mengalami
kerusakan DNA.
3. Ki-67 lebih sedikit terekspresi
daripada ekspresi protein p53, karena
Ki-67 tidak ditemukan pada sel
quiescent.
DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., Bray, D., Lewiis, J., Raff, M.,
Roberts, K., Watson, JD. 1994.
Molecular biology of the cell. 3rd ed.
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132
Garland Publishing, Inc. New York &
London. 863-910.
Duguid, R. 1985. Inhibition of 3H-thymidine
uptake in human gingival fibroblasts
by extracts from human dental plaque,
oral bacteria of the Streptococcus and
Actinomyces species. Arch Oral Biol
;30;89-93.
Fine, D.H., Mendietta, C., Barnett, M.L.,
Furgang, D., Naini, A., Vincent, J.W.,
1992.
Endotoxin
levels
in
periodontally healthy and diseased
sites: correlation with levels of Gramnegative bacteria. J Periodontol
;63:897-901.
Gerdes, J., Lemke, M., Baisch, H., Wacker,
H.H., Schwab, U., Stein, H. 1984. Cell
cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear defined by
the monoclonal antibody Ki67. J
Immunol ;133:1710-1715.
Itoiz, ME., Carranza, FA. 1996. Periodontal
microbiology in Carranza, FA., and
Newman,
MG.
Clinical
Periodontology. 8th ed. WB Saunders
Company. Philadelphia. 12-29.
King, RJB. 2000. Cancer Biology. 2nd ed.
Pearson Education. England. 146-173.
Ko, SD., Narayanan, AS., Page, RC. 1981.
Influence of cell cycle on collagen
synthesis
by
human
gingival
fibroblasts. J Periodontol Res ;16:302308.
Lazzaro, B., Cleveland, D. 2000. P53 and
antigen Ki-67 expression in small oral
biopsy specimens of salivary gland
tumors. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod ;89:613617.
Loesche, W.J., Syed, S.A., Schmidt, E.,
Morrison, E.C. 1985. Bacterial
profiles of subgingival plaques in
periodontitis. J Periodontol ;56:447456.
Lopez, N.J. 2000. Occurrence of Actinobacillus
actinomycetemcomitans,
Porphyromonas
gingivalis,
and
Prevotella intermedia in progressive
adult periodontitis. J Periodontol
;71:948-954.
Marrioti,
A.,
Cochran,
DL.
1990.
Characterization of fibroblasts derived
from human periodontal ligament and
gingiva. J Periodontol;61:103-111.
131
Meer, S., Galpin, JS., Altini, M., Coleman, H.,
Ali, H. 2003. Proliferating cell nuclear
antigen and Ki-67 immunoreactivity
in ameloblastoma. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod;95:213-221.
Olson, R.H., Adams, D.F., Layman, D.L. 1985.
Inhibitory effects of periodontally
diseased root extracts on the growth of
human
gingival
fibroblasts.
J
Periodontol ;56:592-596.
Saygun, I., Özdemir, A., Günhan, Ö.,
Aydintuğ, YS., Karslioğlu, Y. 2003.
Hereditary gingival fibromatosis and
expression of Ki-67 antigen: a case
report. J Periodontol;74:873-878.
Schlüter, C., Duchrow, M., Wohlenberg, C.,
Becker, MHG., Key, G., Flad, HD.,
Gerdes, J. 1995. The cell proliferationassociated antigen of antibody Ki-67:
a very large, ubiquitous nuclear
protein with numerous repeated
elements, representing a new kind of
cell cycle-maintaining proteins. J Cell
Biol;123:513-522.
Shirasuna, K., Okura, M., Watanani, K.,
Hayashido, Y., Saka, M., Matsura, T.
1989. Abnormal celular property of
fibroblasts from an unidentified
syndrome with gingival hyperplasia as
the predominant feature. J Oral
Pathol; 7:381-385.
Simon, B.I., Goldman, H.M., Ruben, M.P.,
Baker, E. 1970. The role of endotoxin
in periodontal disease. II. Correlation
of the quantity of endotoxin human
gingival exydate with the clinical
degree of inflammation. J Periodontol
;41:81-86.
Slot, J., Bragd, L., Dahlen, G. 1986. The
occurrence
of
Actinobacillus
actinomycetescomitans, Bacteroides
gingivalis,
and
Bacteroides
intermedius in destructive periodontal
disease
in
adults.
J
Clin
Periodontol;13:570-576.
Takata, T., Miyauchi, M., Ogawa, I., Ito, H.,
Kobayashi, J., Nikai, H. 1997.
Reactive change in proliferative
activity of the junctional epithelium
after
topical
application
of
lipopolysaccharide. J Periodontol,
68:531-535.
132
Hubungan Viabilitas Sel………..(Banun Kusumawardani)
Thompson, CB. 1995. Apoptosis in the
pathogenesis and treatment of disease.
Science ;267:1456-1462.
Tipton, DA., Braxton, SD., Dabbous, MK.
1995. Role of salivary components as
modulators of bleaching agent toxicity
to human gingival fibroblasts in vitro.
J Periodontol;66:766-774.
Vogelstein, B., Lane, D., Levine, AJ. 2000.
Surfing
the
p53
network.
Nature;408:307-310.
Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D.,
Kesey, J., Manzow, S. 2000. Guide to
cell proliferation and apoptosis
methods.
Roche
Diagnostics
Corporation.