Paten Negara Republik Indonesia untuk invensi dengan judul: “METODE PENINGKATAN EFISIENSI TRANSFORMASI GENETIK KE TANAMAN ANGGREK Phalaenop sisamabilis DENGAN PREKULTUR BIJI PADA MEDIA DENGAN SUPLEMEN EKSTRAK TOMAT DAN AIR KELAPA” - repository civitas UGM
-
K EM EN TERIA N
REPU BLIK IN D O N ESIA
H U K U M D A N H A K A SA SI M A N U SIA
SERTIFlK A T
PA TEN
M enteri H ukum dan H ak A sasi M anusia atas nam a N egara Republik Indonesia
U ndang-U ndang N om or 14 Tahun 2001 tentang Paten, m em berikan Paten kepada:
N am a dan A lam at
Pem egang Paten
U ntuk Invensi dengan
Judul
berdasarkan
: U N IV ERSITA S G A D JA H M A D A
LPPM U G M K antor Pusat U G M Lt. 3
Sayap Selatan Bulaksum ur
Y ogyakarta
IN D O N ESIA
: M ETO D E PEN IN G K A TA N EFISIEN SI TRA N SFO RM A SI
G EN ETIK K E T A N A M A N A N G G REK Phalaenopsis amabilis
D EN G A N PREK U LTU R BU r PA D A M ED IA D EN G A N
SU PLEM EN EK STRA K TO M A T D A N A IR K ELA PA
Inventor
: D r. Endang Sem iarti, M .S., M .Sc.
Tanggal Penerim aan
: 22 Februari 2010
N om or Paten
: ID P000036164
Tanggal Pem berian
: 25 Juni 2014
Perlindungan Paten
untuk invensi tersebut
Tanggal Penerim aan (Pasal 8).
diberikan
untuk selam a 20 tahun terhitung
sejak
Sertifikat Paten ini dilam piri dengan deskripsi, klaim , abstrak dan gam bar (jika ada) dari invensi
yang tidak terpisahkan dari sertifikat ini.
a.n. M EN TERI H U K U M D A N H A K A SA SI M A N U SIA
REPU BLIK IN D O N ESIA
D IREK TU R JEN D ERA L H A K K EK A Y A A N IN TELEK TU A L
u.b.
e tur
ten
...
Corrie N aryati, S.H .
N IP. 195501231984032001
2012-03-
000001492
•
PATEN INDONESIA
r-jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
(11)
IDP000036164 Be
(19)
DIREKTORAT JENDERAL
HAK KEKAYAAN INTELEKTUAL
(45)
25 Juni 2014
(S1)
Klasifikasi IPCB : A 01 H CBA
S /O O , C 12N 1 5 /0 9
(71)
(21)
No. Perm ohonan Paten: P00201000142
(22)
Tanggal Penerim aan: 22 Februari 2010
Nam a dan Alam at yang M engajukan Perm ohonan Paten:
UNIVERSITAS G ADJAH M ADA
LPPM UG M Kantor Pusat UG M Lt. 3
Sayap Selatan Bulaksum ur
Yogyakarta
INDO NESIA
(30)
Data Prioritas :
(31) Nom or
(72)
Nam a Inventor :
Dr. Endang Sem iarti, M .S., M .Sc., ID
(74)
Nam a dan Alam at Konsultan Paten:
(12)
(32) Tanggal
(33) Negara
(43)
Tanggal Penqurnum an: 25 Agustus 2011
(56)
Dokum en Pem banding:
Kei-ichiro M ishiba, Dong Poh Chin dan M asahiro M ii : "
Agrobacterium -m ediated transform ation of P h a la e n o p s is by
targeting protocorm s at an early stage after germ ination", Plant Cell
Reports, July 2005, Volum e 24, hal. 297-303;
CN 101173297 (A)
US 6,020,S38
Judullnvensi:
Pem eriksa Paten: Dra. Sri Sulistiyani
Jum lah Klaim : 11
M ETO DE PENING KATAN EFISIENSI TRANSFO RM ASI G ENETIK KE TANAM AN ANG G REK P h a la e n o p s is
DENG AN PREKUL TUR BIJI PAD A M EDIA DENG AN SUPLEM EN EKSTRAK TO M AT DAN AIR KELAPA
a m a b ilis
Abstrak:
Invensi ini m engenai m etode peningkatan efisiensi transform asi genetik ke tanam an anggrek P h a la e n o p s is a m a b ilis yang terdiri dari
ahapan sebagai berikut: a) Prekultur biji anggrek dengan m edia NP ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa, b. Transform asi genetik ke
rotokorm anggrek P. a m a b ilis dengan A g r o b a c te r iu m tu m e fa c ie n s , c. Seleksi protokorm setelah transform asi, dan d) Pem buktian
m sform an dan transgenik anggrek.
[am invensi ini prekultur selam a 3 m inggu pada m edia NP + ekstrak tom at 100 m g /l+ air kelapa 1S0 m ill m enyebabkan efisiensi
isform asl pada perlakuan kontrol positif m enjadi relatif tinggi (7-17% ). Frekuensi pem bentukan tunas hasil transform asi genetik dari
okorm anggrek P. a m a b ilis m enjadi sangat tinggi yaitu m encapai 11-14 kali lipat dibandingkan tanpa perlakuan prekultur. gfedcbaZYXWVUTSRQP
ide transform asi dengan 3 m inggu prekultur pada m edia dengan penam bahan eksfrak tom at 1 0 0 m g /l sebelum proses transform asi
tik pada invensi ini sangat signifikan m eningkatkan efisiensi transform asi genetik pad a anggrek P. a m a b ilis , sehingga diharapkan
m m etode ini dapat diperoleh kultivar anggrek yang baru dengan lebih m udah dan sangat prospektif untuk m em ajukan industri
~k.
•
U N IV ERSITA S
lE M B A G A
N om or
Lam p.
H al
P E N E LITIA N
DAN
G A D JA H M A D A jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCB
P E N G A B D IA N
KEPADA
MASYARAKAT
: LP P M -U G M /2418/L1TI2014
23 Juli 2014
: P enerbitan S ertifikat P aten
K epada Y th.
D irektur P aten
D epartem en H ukum dan H A M
JI.H .R R asuna S aid K av 8-9
Jakarta S elatan
D engan horm at,
M enindaklanjuti surat dari D irektur P aten N om or: H K I-3-H I.05.02.04I3511 perihal
pem beritahuan dapat diberi paten tanggal 25 Juni 2014 yang berjudul "M etode
P eningkatan E fisiensi Transform asi G enetik ke Tanam an A nggrek CBA
P h a la e n o p s is
a m a b ilis dengan P rekultur 8ij; pada M edia dengan S uplem en E kstrak Tom at dan A ir
K elapa" dengan nom or perm ohonan P 00201000142 tanggal 22 Februari 2010
dengan pem ohon Lem baga P enelitian dan P engabdian pada M asyarakat U niversitas
G adjah M ada (LP P M U G M ).
S ehubungan sertifikat paten tersebut akan sangat m endukung akreditasi P rogram
S tudi S 1 dan S 2 Fakultas B iologi U G M yang akan habis m asa berJakunya pada
Februari 2015, dan dokum en sudah harus dikirim kan 6 bulan sebelum nya.
D engan ini kam i m ohon dapat segera diterbitkan sertifikat paten tersebut.
A tas perhatian dan kerjasam anya, kam i ucapkan terim a kasih.
Tem busan Y th.
K etua LP P M (sebagai laporan)
Inventor
K antor P usat U G M , Lantai III, S ayap B arat, S ulaksum ur, Y ogyakarta 55281
Telepon: (0274) 552432.548159,520669,6491963,6491972,6491973
• Fax: (0274) 515391
K antor P erw akllan Jakarta: U G M K am pus Jakarta, Tow er S , Lantai 9
Jalan D r. S aharjo N o. 83, Tebet, Jakarta· Telepon . (021) 83702990 • Fax: (021) 83702990
E -m ail: Ippm @ ugm .ac.id • H om epage . http://lppm .ugm .ac.id
•
D e s k r i p s i gfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
M ET O D E
P E N IN G K A T A N
Phalaenopsis amabilis
A N G G R EK
5
D EN G A N
B id a n g
T e k n ik
Phalaenopsis
SU PLEM EN
ini
berkaitan
amabilis
dengan
prekultur yang m enghasilkan
L a ta r
15
TR A N SFO R M A SI
D EN G A N
G E N E T IK
B I J I jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFED
PAD A M E D I A
PR EK U LTU R
EK STR A K
TO M A T
D A N
dengan
m etode
transform asi
m edia
suplem en
K E TA N A M A N
A IR
K ELA PA
In ven si
Invensi
10
E F IS IE N S I
B e la k a n g
ekstrak
genetik
tom at
ke
tanam an
dan air kelapa
anggrek
pada m edia
efisiensi transform asi tinggi.
In ven si
M etode transform asi
genetik ke tanam an
bakteri tanah Agrobacterium
m enggunakan
tumefaciens sebagai m ediator um um nya digunakan untuk tanam an dikotil. Sedangkan pada
A . tumefaciens m enghasilkan
(term asuk anggrek) jika digunakan m ediator CBA
tanam an m onokotil
efisiensi transform asi yang sangat rendah, berkisar antara (0,01-1)% . Tetapi m engingat teknik ini
sangat
20
m udah
dan
m enguntungkan
dalam
biji anggrek
m aka
perlu
dilakukan
berbagai
usaha
peningkatan
efisiensinya.
Em brio
hanya dibungkus
tidak m em iliki
cadangan
m akanan
(endosperm ),
em brio .
dengan selaput sel m ati yang disebut testa. A supan m akanan dari luar akan
m enjadi pem icu pertum buhan
em brio yang kem udian dapat berkem bang m em bentuk protokorrn
(perkem bangan em brio anggrek) dan kem udian berkecam bah m em bentuk tunas dan akar.
25
D alam
drastis,
dasa w arsa terakhir
sehingga
m em punyai
penyediaan
diperlukan
anggrek
alam m engalam i
konservasi
anggrek
dengan
efisiensi tinggi. Selain itu perbanyakan
bibit tanam an
m assal adalah m etode
30
usaha
ini, populasi
tanam an
teknik
penurunan
yang
m udah
tetapi
anggrek juga diperlukan
untuk
dalam jum lah besar. Salah satu teknik perbanyakan
transform asi
D engan invensi ini diharapkan
genetik dengan penyisipan
secara
anggrek secara
gen kunci pem bentuk
dapat diperoleh m etode transform asi
tunas.
genetik yang m udah dan
efisien untuk perbanyakan tanam an anggrek secara m assal.
K eberhasilan transform asi genetik pada tanam an sangat tergantung pada kondisi sitologis
dan fisiologis sel tanam an. K ebanyakan m etode transform asi berangkat dari sel em brio atau sel
som a yang diinduksi m enjadi kalus lebih dahulu baru kem udian ditransform asi
dengan m ediator
•
2
A grobacterium .
seragam .
H asilnya banyak tetapi sering terjadi variasi som aklonal,
Tetapi
bulan P. amabilis
5
N am un
efisiensi
D engan
invensi
et al. (2007) telah berhasil m entransfer
Sem iarti
tanpa m elalui
transform asi
kalus, yaitu m enggunakan
m asih
ini diharapkan
rendah
dapat
yaitu
diperoleh
gen ke protokorm
protokorm
(0,1-1,7)
m etode
sehingga hasilnya tidak
anggrek
utuh um ur 3 m inggu.
% . Sehingga
transform asi
perlu
genetik
ditingkatkan.
pada
tanam an
anggrek P. am abilis dengan efisiensi tinggi.
Pad a m etode
organik kom plek
,
didapatkan
10
pada
m enggunakan
horm on tum buhan
.
tanam an
R in g k a s a n
untuk m endapatkan
anggrek
alam
dan
efisiensi
frekuensi
Agrobacterium
m edia yang tepat untuk m etode
P. amabilis.
Selain
transform asi
tumefaciens
itu
genetik
sebagai m ediator
invensi
pada
transform asi
ini bertujuan
anggrek
untuk m endapatkan
P.
untuk
am abilis
lebih banyak
kultivar baru yang unggul. EDCBA
tanam an yang m erupakan
In ven si
Invensi ini m engenai m etode peningkatan
Phalaenopsis
P.
transform asi,
cfisiensi transform asi
genetik ke tanam an anggrek
amabilis yang terdiri dari tahapan sebagai bcrikut: a) Prekultnr
dengan m edia N P ditam bah
anggrek
deugan air kelapa. D ari ekstrak tom at jihgfedcbaZYXWVUTS
likopen dan vitam in C dan D , dari air k~la1Ja
didapatkan
.. ~. ~.:
ini bertujuan
m eningkatkan
20
substansi
yang sangat penting untuk m engubah protoklorofil m enjadi klorofil.
Invensi
15
em brio yang ditanam pada m edia dengan suplem en
berupa ekstrak tom at yang dikorubinasi
terutam a
trans-zeatin
genetik
ini digunakan
amabilis
ekstrak tom at dan air kelapa, b. Transform asi
dengan
dan d) Pem buktian
Agrobacterium
transform an
tumefaciens,
c.
em brio anggrek
genetik pada tanam an
Seleksi
protokorm
setelah
dan transgenik anggrek.
Lebih lanjut invensi m engenai penghitungan
efisiensi transform asi
pada tanam an anggrek
P.
amabilis.
25
U r a ia n
G am bar
Sing kat
1.
.;
G am bar
m enjelaskan
perkem bangan
norm al em brio
,..
dan tunas anggrek
yang diikuti setiap m inggu sam pai 130 m inggu setelah penanam an
30
G am bar
2.
m enjelaskan
m inggu)
m etode transform asi
P. amabilis dengan Agrobacterium
kelapa dim asukkan
G am bar
3.
m enjelaskan
dengan
genetik pada protokorm
yang
diberi
ekstrak
tom at
em brio.
(em brio anggrek um ur 3
tumefaciens.
pada m edia prekultur untuk nienumbuhkan
hasil seleksi transform an
bulan P.amabilis
Ekstrak
tom at dan air
em brio anggrek.
yang tidak diberi ekstrak tom at dan air kelapa
dan
air
kelapa
pada
m edia
prekulturnya.
,
3 jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK
oJ
'"
.,
'"
•••
,J
oJ
oJ
oJ
il
oJ
J
,;
,J
oJ
oJ
oJ
,J
,J
'"
oJ
oJ
Protokorm
P.am abilis
m enjelaskan
4.
(akum ulasi
5
pem buktian
transgenik
anggrek
~
'"
oJ
~
~
>i
J
,;
J
,;
oJ
-i-
,J
J
.;
,J
J
.••
.I
.;
.I
"""
••
Ekstrak tornat + air kelapa EDCBA
dengan
ekspresi
non tranform an
dilihat dengan cahaya putih, C. Tanam an
dengan
biru autofluoresen,
L engkap
~
-
"
J
positif gen target
m RN A dengan PCR). A . D eteksi gen target dengan PCR,B. Tanam an
cahaya
D .Tanam an
cahaya putih, E. Tanam an transform an
Ur a i a n
oJ
J
um ur 3 m inggu A . N PO tanpa ekstrak tom at dan air kelapa,
B. N P + air kelapa, C. N P + Ekstrak tom at, D . N P
G am bar
CBA
~
non tranform an
transform an
dilihat
target dilihat dengan
target dilihat dengan cahaya biru fluoresen.
In ven si
10
M etode
penam bahan
transform asi
genetik
berefisiensi
tinggi pada tanam an
ekstrak tom at pada m edia prekulturnya
pada G am bar
dilakukan
anggrek
dan dibuktikan
bulan
dengan
seperti disajikan
1, G am bar 2, G am bar 3 dan G am bar 4, terdiri atas beberapa tahap seperti diuraikan
berikut ini.
15
Prekultur em brio anggrek (1)
Em brio
ditam bah
anggrek ditanam
dengan
20
inisial m eristem
(N P) yang
150 m lll dan ekstrak tonat 100 m g /l (Tabell) .. Em brio
air kelapa
em brio akan tum buh
pada m edia preku!tur yaitu m edia N ew Phalaenpsis
m enjadi protokorm .
Pada protokorm
di dalam
um ur 3 m inggu terjadi pem bentukan
ujung batang yang akan m enjadi tunas Pada tahap tersebut m erupakan
yang tepat untuk transform asi
gen ke tanam an anggrek Phalaenopsis
Agrobacterium
Ekstrak
tumefaciens.
m enum buhkaan
em brio
anggrek,
tom at
tetapi
dan
tidak
tahapan
amabilis dengan m ediator
air kelapa
dim asukkan
diberikan
saat
pada
regenerasi
m edia
untuk
tanam an
hasil
transform asi.
25
Tabel 1. Perkem bangan
em bryo anggrek P. amabilis pada m edium N P dengan penam bahan
berbagai variasi konsentrasi
M edium *
ekstrak tom at dan air kelapa, 21 hari setelah penanam an
Fase perkem bangan
Jum lah biji
em brio
Y ang
Em brio
3
2
4
5
ditanam
NP
N P+air
473
395
kelapa
N P+ ekstrak
410
m ati
75
3
(55.4% )
(15.9% )
(0.6% )
53
149
161
10
0
(5.6% )
(13.4% )
(37.7% )
(40.8% )
(2.5% )
(0.00% )
28
68
95
195
18
6
66
67
(13.9% )
(14.1% )
22
262
0.0
(0.0% )
,- -
•
4 jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
••
~
••
tom at
(6.8% )
(16.6% )
(23.1% )
••
••
••
-
,J
. CBA .
••
oJ
oJ
•
••
••
••
"
iii
Q
J
J
••
•
. ... .. ..· .
.. . . · .. ...
. ...
· . .
••
"
"
"
(4.4% )
(47.6% )
(1.5% )
N P+air
203
kelapa
0
63**
6
272
(86.0
+ekstrak
r
(0.00% )
(2.2% )
(23.2% )
%)
tom at
r'
*N P (m edium dasar) ditam bah dengan 15% (v/v) air kelapa dan/100
g
** Perkem bangan
pada m edium N P ditam bah
em brio tercepat adalah em brio yang ditum buhkan
ekstrak tom ato
dengan air kelapa dan ekstrak tom ato
5
Prekultur
untuk
2
pada pada m edia N P dengan
hal,
protoklorofil
yaitu:
1)
m enjadi
klorofil,
tum buh dan berkem bang
responsif
10
untuk
tumefaciens
dengan
dan kultur
15
dan
genetik
paling
m enutup
m udah
A grobacterium
dengan
m engubah
dengan
saat
terjadi
kontak
Agrobacterium
dengan
anggrek
dengan
A. tumefaciens
teknik
transfer
gen yang
lainnya.
tanam an dalam larutan cam puran
rasio
1:4 selam a
30-60
m erupakan
teknik
K arena
hanya
m edia cair tanam an
m en it, kem udian
ditiriskan
dan
ditanam pada m edia budidaya tanam an.
cara m enum buhkan
tunas
yang
disisipkan
telah
pada
em brio/protokorm
m edia
seleksi
em brio
diisi
dengan
Ti plasm id
tersebut.
dari gen yang disisipkan
transform an
gen asing
transgenic
teknik
em brio anggrek)
dengan
(sesuai
dim aksudkan
dengan
untuk
konstruksi
m endapatkan
DNA
yang
pertum buhan
saja, sedangkan yang tidak tersisipi akan m ati pada
tunas yang tum buh
disubkultur/ditransfer
ke m edia baru
m enjadi tanam an transgenik.
tanam an
transgenik
yang m em baw a
perIu dilakukan pem buktian
pada transform an dengan
PCR, ke
dan berfungsi
perIu dilakukan
setelah transform asi
pada m edia seleksi yaitu m edia induksi
K anam isin
A grobacterium )
Selanjutnya
m enggunakan
dapat terkekspresi
antibiotik
m enjadi tunas transform an
U ntuk m endapatkan
keberadaan
(perkem bangan
yang telah ditransform asi
untuk regenerasi transform an
25
anggrek
bertujuan
100 m g /l
genetik.
diantara
em brio/sel
Seleksi em brio/protokorm
20
pada
ke tanam an
m erendam
em brio
tom at
tunas, 2) m em buat sel-sel em brio anggrek m enjadi lebih
pada saat proses transform asi
gen yang
dilakukan
pertum buhan
ekstrak
sehingga em brio cepat berubah w am a m enjadi hijau kem udian
m em bentuk
m em buka
Transform asi
transfer
m em percepat
penam bahan
dua,untuk
m em bentuk
m engetahui
fenotip
(RT)-PCR
sifat baru
secara bertahap, yaitu pertam a, m endeteksi
m engam plifikasi
analisis ada atau tidaknya
Reverse Transcriptase
dan m engekspresikan
bahw a
sebagai
gen yang
kenam pakan
akum ulasi
atau N orthern
gen tersebut
m RN A
Blot analysis.
dari tanam an
dibaw a
tersebut
luar pada tanam an
pada tanam an
Penggunaan
dengan
gen G FP
•
5
••
,
••••
sebagai gen pelapor dapat m em bantu
dengan
dieksitasi
m enggunakan
hijau, sedangkan
5
T ransform asi
cahaya
biru m aka transgenik
ke tanam an
um ur 3 m inggu (yang ditum buhkan
cair dan kultur
,
••
••
"
"
•••
"
••
4
••
,J
••
"
••••••
anggrek
akan berpendar
w am a
dari klorofil.
genetik ke tanam an anggrek dengan A grobacterium
genetik
••
deteksi ekspresi gen tersebut lebih cepat dan m udah yaitu
yang norm al berw am a m erah autofluoresen
T ransform asi
.. .. ..
..
.." ....
.. .. " .. " ~ ~ ..
anggrek dilakukan
(2)
dengan cara m erendam
protokorm
Y2 N P
pad a m edia prekuitur) dengan larutan cam puran m edia
A grobacterium
(pem baw a
gen G FP
dan gen resisten
terhadap
K anam isin)
dengan rasio 1:4 selam a 30 m enit di dalam petridish di ruang steril lam inar air flow . K em udian
10
protokorm
ditanam
transfer
ditiriskan
di atas tum pukan
pad a m edia
induksi
kalus
gen dari A grobacterium
5 lem bar kertas
selam a
1 m inggu
ke genom
m edia induksi tunas (N P+ 2-isopentenil
saring, dan setelah
tanam an.
untuk
m em beri
Setelah
protokorm
300 m g/l untuk m engham bat
pertum buhan
transform an,
yang m engandung
kanam isin yang ditam bahkan
20
Seleksi protokorm
Seleksi
tunas yang
kontrol
N PO
25
ditam bah
digunakan
tanpa
K anam isin
N P+K anam isin
(konstruksi
protokorm
+ K anam isin
K anam isin
ke
pada kondisi
Setiap sem inggu
sekali
200 m g/l dan karbenisilin
diperlukan
untuk seleksi
gen kanam isin
akan resisten terhadap antibiotik
m enum buhkan
protokorm
200 m g/l seperti
yang tidak ditransform asi
200 m g/l (G am bar
m Ill (G b.2C ),
Y2 N
A grobacterium .
dengan
kanam isin
(G am bar
p35S::G FP)
dipindahkan
(3)
dilakukan
dengan
terjadinya
pada m edia seleksi.
setelah transform asi
transform an
kesem patan
adenin 51lM + N A A 0,15 11M ) dipelihara
tersebut dicuci dengan larutan m edia cair
karena tanam an
protokorm
itu transform an
kultur in vitro dengan cahaya putih, kontinyu dan suhu udara (25-28)°C .
15
kering
2A ),
protokorm
dan N P+ tom at ekstrak
m edia
pada G am bar
NT
yang
ditum buhkan
yang ditransform asi
induksi
2. Sebagai
(N T ) yang ditum buhkan
2B ), (C -E ) protokorm
setelah diprekultur
disajikan
pada
pada m edia
pada
m edia
dengan gen G FP
selam a 3 m inggu pada m edia: N P + air kelapa
100 m g/l (G am bar
2D ), dan N P + air kelapa
150
150 m Ill +
tom at ekstrak 100 m g/l (G am bar 2E ), setelah 6 m inggu ditanam pada m edia induksi tunas setelah
transform asi.
30
Protokorm
m ati pada m edia
m edia
seleksi,
N T tum buh
seleksi.
dim ana
transform asi
diprekultur
Pem buktian
transform an
dengan baik pada m edia N PO , tetapi ham per
Sedangkan
protokorm
pem bentukan
tunas
yang telah ditransform asi
yang
terbaik
adalah
seluruhnya
dapat tum buh
protokorm
yang
pada
sebelum
pada m edia N P+ air kelapa 150 m l/l+ ekstrak tom at 100 m g/l.
dan transgenik
anggrek (4)
•
6
.. .. ..
..
..
.. .. .. .. ..
iI
••
••
••
"
T ransfonnan
dapat dinyatakan
gen yang disisipkan.
K eberadaan
chain reaction (peR )
basa dari D N A
5
transgenic
tanam an
eksitasi
akan berpendar
autofluoresen
D ari
10
anggrek
dengan
(G am bar
akum ulasi R N A
, duta (m essenger
pem buktian
••
tranform an
cahaya
berdasarkan
biru panjang
.•
••
••
...."
.• .•
8
....
WI
••
••
dengan polym erase
360 pasangan
pada G am bar 4A .
450 nm , m aka tanam an
diperkuat
tanam an transgenic
frekuensi
.-
.•
ada atau tidaknya ekspresi
gelom bang
gen G FP juga
.....
•.
.. ..
...
••••••
control (N T ) akan berw arna
R N A =m R N A )pada
dihitung
.•
0"
seperti yang disajikan
4B -E ). E kspresi
di atas dapat
.. .. ..
..
••••
fragm en gen G FP sepanjang
w arna hijau, sedangkan
dari klorofil
••
gen G FP pada tanam an anggrek dibuktikan
yaitu dengan teram plifikasinya
genom
Selain itu dilakukan
sebagai transgenik
••
~
"
··"·'"
iI
m erah karena
dengan
deteksi
tetapi tidak pada N T .
dan efisiensi
transform asi
seperti
disajikan pad a T abel2.
T abel 2. Frekuensi transform asi
P. amabilis setelah prekultur pada m edium dengan ekstrak
tom at
Jum lah
lum lah
proto conn yang
m edium N P dengan
protokonn
.
yang
m enghasilkan
penam bahan
diuji
tunas (% )**
E kstrak
A ir K elapa*
plasm id
tom at*
+
+
N on-transform an
pB 1l21 (vector)
+
+
+
+
pB I121 (vector)
pB Il21
+
+
(vector)
p35S::G FP
*Sebelum transform asi,
danllO O g r1ekstrak
15
14 (l.2% )
1200
159 (13.2% )
1557
260 (16.6% )
. 1557
210 (13.5% )
dikultur pada m edium N P+ 15% (v/v) air kelapa
diukur dari jum lah protokorm yang m enghasilkan
prekultur
(efisiensi
tanpa
air kelapa
m edia
prekultur
transfonnasi
1200
tunas per total
yang diuji.
Perlakuan
proto conn
0(0% )
tom at selam a 3 m inggu,
**E fisiensi transfonnasi
protokonn
protokorm
1557
pada m edia N P + air kelapa saja m enghasilkan
transfonnasi
m enghasilkan
N P+
air
1,2 % ), yang diprekultur
159/1200
kelapa
tertinggi yaitu 260 tunasll557
pada m edia N P + tom at
(13,2 % ), sedangkan
150 m l+
ekstrak
protokorm
tom at
14 tunas dari 1200
protokorm
100 m g/l
100 m g/l
yang ditanam
m enghasilkan
(16,7% ) untuk yang ditransfonnan
pada
efisiensi
dengan
•
7gfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
vector
saja,
210/1557
m enunjukkan
bahw a
m eningkatkan
efisiensi
Peningkatan
5
dan
tanam an
ini sangat
m onokotil
transform asinya
(13,5% )
prekultur
untuk
pada
transform asi
m enguntungkan
lainnya
yang
m edia
genetik
ditransform asi
NP
ke
+
ekstrak
tanam an
dengan
tom at
anggrek
bagi industri peranggrekan,
transform asi
dengan
p35S::G FP.
sangat
sam pai
karena
A grobacterium
H al
efektif
14
untuk
kali
pada anggrek
um um nya
ini
lipat.
dan
efisiensi
sangat rendah (0,1-1 )% .
•
8
Klaim
genetik pada tanam an anggrek P. amabilis dengan efisiensi tinggi
1. M etode transform asi
yang terdiri dari tahapan sebagai berikut:
5
a.
Prekultur biji anggrek dengan m edia N P ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa,
b.
T ransform asi
genetik ke protokorm anggrek P. amabilis dengan Agrobacterium
tumefaciens,
c.' Seleksi protokorm setelah transform asi, dan
d.
Pem buktian transform an dan transgenik anggrek.
10
2.
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 1, dim ana
M etode transform asi
konsentrasi ekstrak tom at yang ditam bahkan adalah 100 m g/l dan air kelapa 150 m l/l,
3.
15
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 1, dim ana
M etode transform asi
w aktu
prekultur
pada
tahap
(a) dilakukan
selam a
3 m inggu
sehingga
dihasilkan
protokorm .
4.
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 3, dim ana
M etode transform asi
selanjutnya protokorm
um ur 3 m inggu direndam dalam larutan cam puran m edia cair 'lj
N P dengan kultur Agrobacterium
20
tumefaciens pem baw a gen G FP/vektor dengan rasio
1:4 selam a 30 m enit, kem udian ditiriskan sam pai kering.
5.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 4, dim ana protokorm
yang telah ditiriskan sam pai kering lebih lanjut kem udian ditanam pada m edia induksi
25
kalus (N P + N A A 1 m g/l + B ensil adenin 0,15 rng/l) selam a 1 m inggu dengan cahaya
putih, kontinyu, suhu udara (25-28fC .
6.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 5, dim ana protokorm
dari m edia induksi kalus selanjutnya dipindahkan ke m edia induksi tunas (N P
30
uM
7.
+ NAA
tunas
+
5
0,15 f.!M ) sem inggu setelah induksi kalus.
M etode transform asi
transform an
+ 2-iP
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 1, dim ana tahap seleksi
dilakukan dengan m em indahkan
antibiotik
K anam isin
protokorm
200 m g/l) kem udian
ke m edia seleksi (N P induksi
ditam bahkan
larutan
antibiotik
f
•
9
karbenisilin 300 m g/l,
M etode
transform asi
sem inggu
5
ke tanam an
sekali protokorm .dipindahkan
didahului pencucian
larutan
genetik
antibiotik
protokorm
K anam isin
anggrek
klaim
7, dim ana
setiap
ke m edia induksi tunas yang baru dengan
hasil transform asi
200 m g/l
sesuai
+
dengan larutan m edia cair 12 N P
karbenisilin
+
300 m g/l untuk m em peroleh
transform an target.
9.
10
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 1, dim ana tahap deteksi
transform an dilakukan dengan uji resistensi tanam an terhadap antibiotik K anam isin dan
dilanjutkan
dengan deteksi gen tunas m enggunakan
teknik peR
sehingga didapatkan
transform an target.
10. M etode transform asi
15
target
pada
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 9, dim ana ekspresi gen
transform an
dilakukan
dengan
m endeteksi
akum ulasi
mRNA
pada
transform an, sehingga diperoleh transform an target.
11.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 10, dim ana selanjutnya
transform an target dapat digunakan untuk m enghitung efisiensi transform asi.
20
f
•
10
Abstrak
METODE PENINGKATAN
EFISIENSI TRANSFORMASI GENETIK KE TANAMAN
ANGGREK Phalaenopsis
amabilis DENGAN PREKULTUR BI.JI PADA MEDIA
DENGAN SUPLEMEN EKSTRAK TOMAT DAN AIR KELAPA
5
Invensi ini m engenai m etode peningkatan efisiensi transform asi genetik ke tanam an anggrek
Phalaenopsis amabilis yang terdiri dari tahapan sebagai berikut: a) Prekultur biji anggrek dengan
m edia N P ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa, b. T ransform asi genetik ke protokorm anggrek
10
P. amabilis dengan Agrobacterium
d) Pem buktian transform an
tumefaciens, c. Seleksi protokorm setelah transform asi, dan
dan transgenik anggrek.
D alam invensi ini prekultur selam a 3 m inggu pada m edia N P + ekstrak tom at 100 m g/l+
air kelapa 150 m lll m enyebabkan
efisiensi transform asi pada perlakuan kontrol positif m enjadi
relatif tinggi (7-17% ). Frekuensi pem bentukan
15
tunas hasil transform asi
genetik dari protokorm
anggrek P. amabilis m enjadi sangat tinggi yaitu m encapai 11-14 kali lipat dibandingkan
tanpa
perlakuan prekultur.
M etode transform asi dengan 3 m inggu prekultur pada m edia dengan penam bahan ekstrak
-tam at
100m g/1 sebelum
m eningkatkan
20
efisiensi
proses
transform asi
transform asi
genetik
pada
invensi
genetik pada anggrek P. amabilis,
ini
sangat
sehingga
signifikan
diharapkan
dengan m etode ini dapat diperoleh kultivar anggrek yang baru dengan lebih m udah dan sangat
prospektif untuk m em ajukan industri anggrek.
•
.I
12
18
36
S3
••••
.I
,J
.,
K EM EN TERIA N
REPU BLIK IN D O N ESIA
H U K U M D A N H A K A SA SI M A N U SIA
SERTIFlK A T
PA TEN
M enteri H ukum dan H ak A sasi M anusia atas nam a N egara Republik Indonesia
U ndang-U ndang N om or 14 Tahun 2001 tentang Paten, m em berikan Paten kepada:
N am a dan A lam at
Pem egang Paten
U ntuk Invensi dengan
Judul
berdasarkan
: U N IV ERSITA S G A D JA H M A D A
LPPM U G M K antor Pusat U G M Lt. 3
Sayap Selatan Bulaksum ur
Y ogyakarta
IN D O N ESIA
: M ETO D E PEN IN G K A TA N EFISIEN SI TRA N SFO RM A SI
G EN ETIK K E T A N A M A N A N G G REK Phalaenopsis amabilis
D EN G A N PREK U LTU R BU r PA D A M ED IA D EN G A N
SU PLEM EN EK STRA K TO M A T D A N A IR K ELA PA
Inventor
: D r. Endang Sem iarti, M .S., M .Sc.
Tanggal Penerim aan
: 22 Februari 2010
N om or Paten
: ID P000036164
Tanggal Pem berian
: 25 Juni 2014
Perlindungan Paten
untuk invensi tersebut
Tanggal Penerim aan (Pasal 8).
diberikan
untuk selam a 20 tahun terhitung
sejak
Sertifikat Paten ini dilam piri dengan deskripsi, klaim , abstrak dan gam bar (jika ada) dari invensi
yang tidak terpisahkan dari sertifikat ini.
a.n. M EN TERI H U K U M D A N H A K A SA SI M A N U SIA
REPU BLIK IN D O N ESIA
D IREK TU R JEN D ERA L H A K K EK A Y A A N IN TELEK TU A L
u.b.
e tur
ten
...
Corrie N aryati, S.H .
N IP. 195501231984032001
2012-03-
000001492
•
PATEN INDONESIA
r-jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
(11)
IDP000036164 Be
(19)
DIREKTORAT JENDERAL
HAK KEKAYAAN INTELEKTUAL
(45)
25 Juni 2014
(S1)
Klasifikasi IPCB : A 01 H CBA
S /O O , C 12N 1 5 /0 9
(71)
(21)
No. Perm ohonan Paten: P00201000142
(22)
Tanggal Penerim aan: 22 Februari 2010
Nam a dan Alam at yang M engajukan Perm ohonan Paten:
UNIVERSITAS G ADJAH M ADA
LPPM UG M Kantor Pusat UG M Lt. 3
Sayap Selatan Bulaksum ur
Yogyakarta
INDO NESIA
(30)
Data Prioritas :
(31) Nom or
(72)
Nam a Inventor :
Dr. Endang Sem iarti, M .S., M .Sc., ID
(74)
Nam a dan Alam at Konsultan Paten:
(12)
(32) Tanggal
(33) Negara
(43)
Tanggal Penqurnum an: 25 Agustus 2011
(56)
Dokum en Pem banding:
Kei-ichiro M ishiba, Dong Poh Chin dan M asahiro M ii : "
Agrobacterium -m ediated transform ation of P h a la e n o p s is by
targeting protocorm s at an early stage after germ ination", Plant Cell
Reports, July 2005, Volum e 24, hal. 297-303;
CN 101173297 (A)
US 6,020,S38
Judullnvensi:
Pem eriksa Paten: Dra. Sri Sulistiyani
Jum lah Klaim : 11
M ETO DE PENING KATAN EFISIENSI TRANSFO RM ASI G ENETIK KE TANAM AN ANG G REK P h a la e n o p s is
DENG AN PREKUL TUR BIJI PAD A M EDIA DENG AN SUPLEM EN EKSTRAK TO M AT DAN AIR KELAPA
a m a b ilis
Abstrak:
Invensi ini m engenai m etode peningkatan efisiensi transform asi genetik ke tanam an anggrek P h a la e n o p s is a m a b ilis yang terdiri dari
ahapan sebagai berikut: a) Prekultur biji anggrek dengan m edia NP ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa, b. Transform asi genetik ke
rotokorm anggrek P. a m a b ilis dengan A g r o b a c te r iu m tu m e fa c ie n s , c. Seleksi protokorm setelah transform asi, dan d) Pem buktian
m sform an dan transgenik anggrek.
[am invensi ini prekultur selam a 3 m inggu pada m edia NP + ekstrak tom at 100 m g /l+ air kelapa 1S0 m ill m enyebabkan efisiensi
isform asl pada perlakuan kontrol positif m enjadi relatif tinggi (7-17% ). Frekuensi pem bentukan tunas hasil transform asi genetik dari
okorm anggrek P. a m a b ilis m enjadi sangat tinggi yaitu m encapai 11-14 kali lipat dibandingkan tanpa perlakuan prekultur. gfedcbaZYXWVUTSRQP
ide transform asi dengan 3 m inggu prekultur pada m edia dengan penam bahan eksfrak tom at 1 0 0 m g /l sebelum proses transform asi
tik pada invensi ini sangat signifikan m eningkatkan efisiensi transform asi genetik pad a anggrek P. a m a b ilis , sehingga diharapkan
m m etode ini dapat diperoleh kultivar anggrek yang baru dengan lebih m udah dan sangat prospektif untuk m em ajukan industri
~k.
•
U N IV ERSITA S
lE M B A G A
N om or
Lam p.
H al
P E N E LITIA N
DAN
G A D JA H M A D A jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCB
P E N G A B D IA N
KEPADA
MASYARAKAT
: LP P M -U G M /2418/L1TI2014
23 Juli 2014
: P enerbitan S ertifikat P aten
K epada Y th.
D irektur P aten
D epartem en H ukum dan H A M
JI.H .R R asuna S aid K av 8-9
Jakarta S elatan
D engan horm at,
M enindaklanjuti surat dari D irektur P aten N om or: H K I-3-H I.05.02.04I3511 perihal
pem beritahuan dapat diberi paten tanggal 25 Juni 2014 yang berjudul "M etode
P eningkatan E fisiensi Transform asi G enetik ke Tanam an A nggrek CBA
P h a la e n o p s is
a m a b ilis dengan P rekultur 8ij; pada M edia dengan S uplem en E kstrak Tom at dan A ir
K elapa" dengan nom or perm ohonan P 00201000142 tanggal 22 Februari 2010
dengan pem ohon Lem baga P enelitian dan P engabdian pada M asyarakat U niversitas
G adjah M ada (LP P M U G M ).
S ehubungan sertifikat paten tersebut akan sangat m endukung akreditasi P rogram
S tudi S 1 dan S 2 Fakultas B iologi U G M yang akan habis m asa berJakunya pada
Februari 2015, dan dokum en sudah harus dikirim kan 6 bulan sebelum nya.
D engan ini kam i m ohon dapat segera diterbitkan sertifikat paten tersebut.
A tas perhatian dan kerjasam anya, kam i ucapkan terim a kasih.
Tem busan Y th.
K etua LP P M (sebagai laporan)
Inventor
K antor P usat U G M , Lantai III, S ayap B arat, S ulaksum ur, Y ogyakarta 55281
Telepon: (0274) 552432.548159,520669,6491963,6491972,6491973
• Fax: (0274) 515391
K antor P erw akllan Jakarta: U G M K am pus Jakarta, Tow er S , Lantai 9
Jalan D r. S aharjo N o. 83, Tebet, Jakarta· Telepon . (021) 83702990 • Fax: (021) 83702990
E -m ail: Ippm @ ugm .ac.id • H om epage . http://lppm .ugm .ac.id
•
D e s k r i p s i gfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
M ET O D E
P E N IN G K A T A N
Phalaenopsis amabilis
A N G G R EK
5
D EN G A N
B id a n g
T e k n ik
Phalaenopsis
SU PLEM EN
ini
berkaitan
amabilis
dengan
prekultur yang m enghasilkan
L a ta r
15
TR A N SFO R M A SI
D EN G A N
G E N E T IK
B I J I jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFED
PAD A M E D I A
PR EK U LTU R
EK STR A K
TO M A T
D A N
dengan
m etode
transform asi
m edia
suplem en
K E TA N A M A N
A IR
K ELA PA
In ven si
Invensi
10
E F IS IE N S I
B e la k a n g
ekstrak
genetik
tom at
ke
tanam an
dan air kelapa
anggrek
pada m edia
efisiensi transform asi tinggi.
In ven si
M etode transform asi
genetik ke tanam an
bakteri tanah Agrobacterium
m enggunakan
tumefaciens sebagai m ediator um um nya digunakan untuk tanam an dikotil. Sedangkan pada
A . tumefaciens m enghasilkan
(term asuk anggrek) jika digunakan m ediator CBA
tanam an m onokotil
efisiensi transform asi yang sangat rendah, berkisar antara (0,01-1)% . Tetapi m engingat teknik ini
sangat
20
m udah
dan
m enguntungkan
dalam
biji anggrek
m aka
perlu
dilakukan
berbagai
usaha
peningkatan
efisiensinya.
Em brio
hanya dibungkus
tidak m em iliki
cadangan
m akanan
(endosperm ),
em brio .
dengan selaput sel m ati yang disebut testa. A supan m akanan dari luar akan
m enjadi pem icu pertum buhan
em brio yang kem udian dapat berkem bang m em bentuk protokorrn
(perkem bangan em brio anggrek) dan kem udian berkecam bah m em bentuk tunas dan akar.
25
D alam
drastis,
dasa w arsa terakhir
sehingga
m em punyai
penyediaan
diperlukan
anggrek
alam m engalam i
konservasi
anggrek
dengan
efisiensi tinggi. Selain itu perbanyakan
bibit tanam an
m assal adalah m etode
30
usaha
ini, populasi
tanam an
teknik
penurunan
yang
m udah
tetapi
anggrek juga diperlukan
untuk
dalam jum lah besar. Salah satu teknik perbanyakan
transform asi
D engan invensi ini diharapkan
genetik dengan penyisipan
secara
anggrek secara
gen kunci pem bentuk
dapat diperoleh m etode transform asi
tunas.
genetik yang m udah dan
efisien untuk perbanyakan tanam an anggrek secara m assal.
K eberhasilan transform asi genetik pada tanam an sangat tergantung pada kondisi sitologis
dan fisiologis sel tanam an. K ebanyakan m etode transform asi berangkat dari sel em brio atau sel
som a yang diinduksi m enjadi kalus lebih dahulu baru kem udian ditransform asi
dengan m ediator
•
2
A grobacterium .
seragam .
H asilnya banyak tetapi sering terjadi variasi som aklonal,
Tetapi
bulan P. amabilis
5
N am un
efisiensi
D engan
invensi
et al. (2007) telah berhasil m entransfer
Sem iarti
tanpa m elalui
transform asi
kalus, yaitu m enggunakan
m asih
ini diharapkan
rendah
dapat
yaitu
diperoleh
gen ke protokorm
protokorm
(0,1-1,7)
m etode
sehingga hasilnya tidak
anggrek
utuh um ur 3 m inggu.
% . Sehingga
transform asi
perlu
genetik
ditingkatkan.
pada
tanam an
anggrek P. am abilis dengan efisiensi tinggi.
Pad a m etode
organik kom plek
,
didapatkan
10
pada
m enggunakan
horm on tum buhan
.
tanam an
R in g k a s a n
untuk m endapatkan
anggrek
alam
dan
efisiensi
frekuensi
Agrobacterium
m edia yang tepat untuk m etode
P. amabilis.
Selain
transform asi
tumefaciens
itu
genetik
sebagai m ediator
invensi
pada
transform asi
ini bertujuan
anggrek
untuk m endapatkan
P.
untuk
am abilis
lebih banyak
kultivar baru yang unggul. EDCBA
tanam an yang m erupakan
In ven si
Invensi ini m engenai m etode peningkatan
Phalaenopsis
P.
transform asi,
cfisiensi transform asi
genetik ke tanam an anggrek
amabilis yang terdiri dari tahapan sebagai bcrikut: a) Prekultnr
dengan m edia N P ditam bah
anggrek
deugan air kelapa. D ari ekstrak tom at jihgfedcbaZYXWVUTS
likopen dan vitam in C dan D , dari air k~la1Ja
didapatkan
.. ~. ~.:
ini bertujuan
m eningkatkan
20
substansi
yang sangat penting untuk m engubah protoklorofil m enjadi klorofil.
Invensi
15
em brio yang ditanam pada m edia dengan suplem en
berupa ekstrak tom at yang dikorubinasi
terutam a
trans-zeatin
genetik
ini digunakan
amabilis
ekstrak tom at dan air kelapa, b. Transform asi
dengan
dan d) Pem buktian
Agrobacterium
transform an
tumefaciens,
c.
em brio anggrek
genetik pada tanam an
Seleksi
protokorm
setelah
dan transgenik anggrek.
Lebih lanjut invensi m engenai penghitungan
efisiensi transform asi
pada tanam an anggrek
P.
amabilis.
25
U r a ia n
G am bar
Sing kat
1.
.;
G am bar
m enjelaskan
perkem bangan
norm al em brio
,..
dan tunas anggrek
yang diikuti setiap m inggu sam pai 130 m inggu setelah penanam an
30
G am bar
2.
m enjelaskan
m inggu)
m etode transform asi
P. amabilis dengan Agrobacterium
kelapa dim asukkan
G am bar
3.
m enjelaskan
dengan
genetik pada protokorm
yang
diberi
ekstrak
tom at
em brio.
(em brio anggrek um ur 3
tumefaciens.
pada m edia prekultur untuk nienumbuhkan
hasil seleksi transform an
bulan P.amabilis
Ekstrak
tom at dan air
em brio anggrek.
yang tidak diberi ekstrak tom at dan air kelapa
dan
air
kelapa
pada
m edia
prekulturnya.
,
3 jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK
oJ
'"
.,
'"
•••
,J
oJ
oJ
oJ
il
oJ
J
,;
,J
oJ
oJ
oJ
,J
,J
'"
oJ
oJ
Protokorm
P.am abilis
m enjelaskan
4.
(akum ulasi
5
pem buktian
transgenik
anggrek
~
'"
oJ
~
~
>i
J
,;
J
,;
oJ
-i-
,J
J
.;
,J
J
.••
.I
.;
.I
"""
••
Ekstrak tornat + air kelapa EDCBA
dengan
ekspresi
non tranform an
dilihat dengan cahaya putih, C. Tanam an
dengan
biru autofluoresen,
L engkap
~
-
"
J
positif gen target
m RN A dengan PCR). A . D eteksi gen target dengan PCR,B. Tanam an
cahaya
D .Tanam an
cahaya putih, E. Tanam an transform an
Ur a i a n
oJ
J
um ur 3 m inggu A . N PO tanpa ekstrak tom at dan air kelapa,
B. N P + air kelapa, C. N P + Ekstrak tom at, D . N P
G am bar
CBA
~
non tranform an
transform an
dilihat
target dilihat dengan
target dilihat dengan cahaya biru fluoresen.
In ven si
10
M etode
penam bahan
transform asi
genetik
berefisiensi
tinggi pada tanam an
ekstrak tom at pada m edia prekulturnya
pada G am bar
dilakukan
anggrek
dan dibuktikan
bulan
dengan
seperti disajikan
1, G am bar 2, G am bar 3 dan G am bar 4, terdiri atas beberapa tahap seperti diuraikan
berikut ini.
15
Prekultur em brio anggrek (1)
Em brio
ditam bah
anggrek ditanam
dengan
20
inisial m eristem
(N P) yang
150 m lll dan ekstrak tonat 100 m g /l (Tabell) .. Em brio
air kelapa
em brio akan tum buh
pada m edia preku!tur yaitu m edia N ew Phalaenpsis
m enjadi protokorm .
Pada protokorm
di dalam
um ur 3 m inggu terjadi pem bentukan
ujung batang yang akan m enjadi tunas Pada tahap tersebut m erupakan
yang tepat untuk transform asi
gen ke tanam an anggrek Phalaenopsis
Agrobacterium
Ekstrak
tumefaciens.
m enum buhkaan
em brio
anggrek,
tom at
tetapi
dan
tidak
tahapan
amabilis dengan m ediator
air kelapa
dim asukkan
diberikan
saat
pada
regenerasi
m edia
untuk
tanam an
hasil
transform asi.
25
Tabel 1. Perkem bangan
em bryo anggrek P. amabilis pada m edium N P dengan penam bahan
berbagai variasi konsentrasi
M edium *
ekstrak tom at dan air kelapa, 21 hari setelah penanam an
Fase perkem bangan
Jum lah biji
em brio
Y ang
Em brio
3
2
4
5
ditanam
NP
N P+air
473
395
kelapa
N P+ ekstrak
410
m ati
75
3
(55.4% )
(15.9% )
(0.6% )
53
149
161
10
0
(5.6% )
(13.4% )
(37.7% )
(40.8% )
(2.5% )
(0.00% )
28
68
95
195
18
6
66
67
(13.9% )
(14.1% )
22
262
0.0
(0.0% )
,- -
•
4 jihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
••
~
••
tom at
(6.8% )
(16.6% )
(23.1% )
••
••
••
-
,J
. CBA .
••
oJ
oJ
•
••
••
••
"
iii
Q
J
J
••
•
. ... .. ..· .
.. . . · .. ...
. ...
· . .
••
"
"
"
(4.4% )
(47.6% )
(1.5% )
N P+air
203
kelapa
0
63**
6
272
(86.0
+ekstrak
r
(0.00% )
(2.2% )
(23.2% )
%)
tom at
r'
*N P (m edium dasar) ditam bah dengan 15% (v/v) air kelapa dan/100
g
** Perkem bangan
pada m edium N P ditam bah
em brio tercepat adalah em brio yang ditum buhkan
ekstrak tom ato
dengan air kelapa dan ekstrak tom ato
5
Prekultur
untuk
2
pada pada m edia N P dengan
hal,
protoklorofil
yaitu:
1)
m enjadi
klorofil,
tum buh dan berkem bang
responsif
10
untuk
tumefaciens
dengan
dan kultur
15
dan
genetik
paling
m enutup
m udah
A grobacterium
dengan
m engubah
dengan
saat
terjadi
kontak
Agrobacterium
dengan
anggrek
dengan
A. tumefaciens
teknik
transfer
gen yang
lainnya.
tanam an dalam larutan cam puran
rasio
1:4 selam a
30-60
m erupakan
teknik
K arena
hanya
m edia cair tanam an
m en it, kem udian
ditiriskan
dan
ditanam pada m edia budidaya tanam an.
cara m enum buhkan
tunas
yang
disisipkan
telah
pada
em brio/protokorm
m edia
seleksi
em brio
diisi
dengan
Ti plasm id
tersebut.
dari gen yang disisipkan
transform an
gen asing
transgenic
teknik
em brio anggrek)
dengan
(sesuai
dim aksudkan
dengan
untuk
konstruksi
m endapatkan
DNA
yang
pertum buhan
saja, sedangkan yang tidak tersisipi akan m ati pada
tunas yang tum buh
disubkultur/ditransfer
ke m edia baru
m enjadi tanam an transgenik.
tanam an
transgenik
yang m em baw a
perIu dilakukan pem buktian
pada transform an dengan
PCR, ke
dan berfungsi
perIu dilakukan
setelah transform asi
pada m edia seleksi yaitu m edia induksi
K anam isin
A grobacterium )
Selanjutnya
m enggunakan
dapat terkekspresi
antibiotik
m enjadi tunas transform an
U ntuk m endapatkan
keberadaan
(perkem bangan
yang telah ditransform asi
untuk regenerasi transform an
25
anggrek
bertujuan
100 m g /l
genetik.
diantara
em brio/sel
Seleksi em brio/protokorm
20
pada
ke tanam an
m erendam
em brio
tom at
tunas, 2) m em buat sel-sel em brio anggrek m enjadi lebih
pada saat proses transform asi
gen yang
dilakukan
pertum buhan
ekstrak
sehingga em brio cepat berubah w am a m enjadi hijau kem udian
m em bentuk
m em buka
Transform asi
transfer
m em percepat
penam bahan
dua,untuk
m em bentuk
m engetahui
fenotip
(RT)-PCR
sifat baru
secara bertahap, yaitu pertam a, m endeteksi
m engam plifikasi
analisis ada atau tidaknya
Reverse Transcriptase
dan m engekspresikan
bahw a
sebagai
gen yang
kenam pakan
akum ulasi
atau N orthern
gen tersebut
m RN A
Blot analysis.
dari tanam an
dibaw a
tersebut
luar pada tanam an
pada tanam an
Penggunaan
dengan
gen G FP
•
5
••
,
••••
sebagai gen pelapor dapat m em bantu
dengan
dieksitasi
m enggunakan
hijau, sedangkan
5
T ransform asi
cahaya
biru m aka transgenik
ke tanam an
um ur 3 m inggu (yang ditum buhkan
cair dan kultur
,
••
••
"
"
•••
"
••
4
••
,J
••
"
••••••
anggrek
akan berpendar
w am a
dari klorofil.
genetik ke tanam an anggrek dengan A grobacterium
genetik
••
deteksi ekspresi gen tersebut lebih cepat dan m udah yaitu
yang norm al berw am a m erah autofluoresen
T ransform asi
.. .. ..
..
.." ....
.. .. " .. " ~ ~ ..
anggrek dilakukan
(2)
dengan cara m erendam
protokorm
Y2 N P
pad a m edia prekuitur) dengan larutan cam puran m edia
A grobacterium
(pem baw a
gen G FP
dan gen resisten
terhadap
K anam isin)
dengan rasio 1:4 selam a 30 m enit di dalam petridish di ruang steril lam inar air flow . K em udian
10
protokorm
ditanam
transfer
ditiriskan
di atas tum pukan
pad a m edia
induksi
kalus
gen dari A grobacterium
5 lem bar kertas
selam a
1 m inggu
ke genom
m edia induksi tunas (N P+ 2-isopentenil
saring, dan setelah
tanam an.
untuk
m em beri
Setelah
protokorm
300 m g/l untuk m engham bat
pertum buhan
transform an,
yang m engandung
kanam isin yang ditam bahkan
20
Seleksi protokorm
Seleksi
tunas yang
kontrol
N PO
25
ditam bah
digunakan
tanpa
K anam isin
N P+K anam isin
(konstruksi
protokorm
+ K anam isin
K anam isin
ke
pada kondisi
Setiap sem inggu
sekali
200 m g/l dan karbenisilin
diperlukan
untuk seleksi
gen kanam isin
akan resisten terhadap antibiotik
m enum buhkan
protokorm
200 m g/l seperti
yang tidak ditransform asi
200 m g/l (G am bar
m Ill (G b.2C ),
Y2 N
A grobacterium .
dengan
kanam isin
(G am bar
p35S::G FP)
dipindahkan
(3)
dilakukan
dengan
terjadinya
pada m edia seleksi.
setelah transform asi
transform an
kesem patan
adenin 51lM + N A A 0,15 11M ) dipelihara
tersebut dicuci dengan larutan m edia cair
karena tanam an
protokorm
itu transform an
kultur in vitro dengan cahaya putih, kontinyu dan suhu udara (25-28)°C .
15
kering
2A ),
protokorm
dan N P+ tom at ekstrak
m edia
pada G am bar
NT
yang
ditum buhkan
yang ditransform asi
induksi
2. Sebagai
(N T ) yang ditum buhkan
2B ), (C -E ) protokorm
setelah diprekultur
disajikan
pada
pada m edia
pada
m edia
dengan gen G FP
selam a 3 m inggu pada m edia: N P + air kelapa
100 m g/l (G am bar
2D ), dan N P + air kelapa
150
150 m Ill +
tom at ekstrak 100 m g/l (G am bar 2E ), setelah 6 m inggu ditanam pada m edia induksi tunas setelah
transform asi.
30
Protokorm
m ati pada m edia
m edia
seleksi,
N T tum buh
seleksi.
dim ana
transform asi
diprekultur
Pem buktian
transform an
dengan baik pada m edia N PO , tetapi ham per
Sedangkan
protokorm
pem bentukan
tunas
yang telah ditransform asi
yang
terbaik
adalah
seluruhnya
dapat tum buh
protokorm
yang
pada
sebelum
pada m edia N P+ air kelapa 150 m l/l+ ekstrak tom at 100 m g/l.
dan transgenik
anggrek (4)
•
6
.. .. ..
..
..
.. .. .. .. ..
iI
••
••
••
"
T ransfonnan
dapat dinyatakan
gen yang disisipkan.
K eberadaan
chain reaction (peR )
basa dari D N A
5
transgenic
tanam an
eksitasi
akan berpendar
autofluoresen
D ari
10
anggrek
dengan
(G am bar
akum ulasi R N A
, duta (m essenger
pem buktian
••
tranform an
cahaya
berdasarkan
biru panjang
.•
••
••
...."
.• .•
8
....
WI
••
••
dengan polym erase
360 pasangan
pada G am bar 4A .
450 nm , m aka tanam an
diperkuat
tanam an transgenic
frekuensi
.-
.•
ada atau tidaknya ekspresi
gelom bang
gen G FP juga
.....
•.
.. ..
...
••••••
control (N T ) akan berw arna
R N A =m R N A )pada
dihitung
.•
0"
seperti yang disajikan
4B -E ). E kspresi
di atas dapat
.. .. ..
..
••••
fragm en gen G FP sepanjang
w arna hijau, sedangkan
dari klorofil
••
gen G FP pada tanam an anggrek dibuktikan
yaitu dengan teram plifikasinya
genom
Selain itu dilakukan
sebagai transgenik
••
~
"
··"·'"
iI
m erah karena
dengan
deteksi
tetapi tidak pada N T .
dan efisiensi
transform asi
seperti
disajikan pad a T abel2.
T abel 2. Frekuensi transform asi
P. amabilis setelah prekultur pada m edium dengan ekstrak
tom at
Jum lah
lum lah
proto conn yang
m edium N P dengan
protokonn
.
yang
m enghasilkan
penam bahan
diuji
tunas (% )**
E kstrak
A ir K elapa*
plasm id
tom at*
+
+
N on-transform an
pB 1l21 (vector)
+
+
+
+
pB I121 (vector)
pB Il21
+
+
(vector)
p35S::G FP
*Sebelum transform asi,
danllO O g r1ekstrak
15
14 (l.2% )
1200
159 (13.2% )
1557
260 (16.6% )
. 1557
210 (13.5% )
dikultur pada m edium N P+ 15% (v/v) air kelapa
diukur dari jum lah protokorm yang m enghasilkan
prekultur
(efisiensi
tanpa
air kelapa
m edia
prekultur
transfonnasi
1200
tunas per total
yang diuji.
Perlakuan
proto conn
0(0% )
tom at selam a 3 m inggu,
**E fisiensi transfonnasi
protokonn
protokorm
1557
pada m edia N P + air kelapa saja m enghasilkan
transfonnasi
m enghasilkan
N P+
air
1,2 % ), yang diprekultur
159/1200
kelapa
tertinggi yaitu 260 tunasll557
pada m edia N P + tom at
(13,2 % ), sedangkan
150 m l+
ekstrak
protokorm
tom at
14 tunas dari 1200
protokorm
100 m g/l
100 m g/l
yang ditanam
m enghasilkan
(16,7% ) untuk yang ditransfonnan
pada
efisiensi
dengan
•
7gfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
vector
saja,
210/1557
m enunjukkan
bahw a
m eningkatkan
efisiensi
Peningkatan
5
dan
tanam an
ini sangat
m onokotil
transform asinya
(13,5% )
prekultur
untuk
pada
transform asi
m enguntungkan
lainnya
yang
m edia
genetik
ditransform asi
NP
ke
+
ekstrak
tanam an
dengan
tom at
anggrek
bagi industri peranggrekan,
transform asi
dengan
p35S::G FP.
sangat
sam pai
karena
A grobacterium
H al
efektif
14
untuk
kali
pada anggrek
um um nya
ini
lipat.
dan
efisiensi
sangat rendah (0,1-1 )% .
•
8
Klaim
genetik pada tanam an anggrek P. amabilis dengan efisiensi tinggi
1. M etode transform asi
yang terdiri dari tahapan sebagai berikut:
5
a.
Prekultur biji anggrek dengan m edia N P ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa,
b.
T ransform asi
genetik ke protokorm anggrek P. amabilis dengan Agrobacterium
tumefaciens,
c.' Seleksi protokorm setelah transform asi, dan
d.
Pem buktian transform an dan transgenik anggrek.
10
2.
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 1, dim ana
M etode transform asi
konsentrasi ekstrak tom at yang ditam bahkan adalah 100 m g/l dan air kelapa 150 m l/l,
3.
15
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 1, dim ana
M etode transform asi
w aktu
prekultur
pada
tahap
(a) dilakukan
selam a
3 m inggu
sehingga
dihasilkan
protokorm .
4.
genetik ke tanam an anggrek P. amabilis sesuai klaim 3, dim ana
M etode transform asi
selanjutnya protokorm
um ur 3 m inggu direndam dalam larutan cam puran m edia cair 'lj
N P dengan kultur Agrobacterium
20
tumefaciens pem baw a gen G FP/vektor dengan rasio
1:4 selam a 30 m enit, kem udian ditiriskan sam pai kering.
5.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 4, dim ana protokorm
yang telah ditiriskan sam pai kering lebih lanjut kem udian ditanam pada m edia induksi
25
kalus (N P + N A A 1 m g/l + B ensil adenin 0,15 rng/l) selam a 1 m inggu dengan cahaya
putih, kontinyu, suhu udara (25-28fC .
6.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 5, dim ana protokorm
dari m edia induksi kalus selanjutnya dipindahkan ke m edia induksi tunas (N P
30
uM
7.
+ NAA
tunas
+
5
0,15 f.!M ) sem inggu setelah induksi kalus.
M etode transform asi
transform an
+ 2-iP
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 1, dim ana tahap seleksi
dilakukan dengan m em indahkan
antibiotik
K anam isin
protokorm
200 m g/l) kem udian
ke m edia seleksi (N P induksi
ditam bahkan
larutan
antibiotik
f
•
9
karbenisilin 300 m g/l,
M etode
transform asi
sem inggu
5
ke tanam an
sekali protokorm .dipindahkan
didahului pencucian
larutan
genetik
antibiotik
protokorm
K anam isin
anggrek
klaim
7, dim ana
setiap
ke m edia induksi tunas yang baru dengan
hasil transform asi
200 m g/l
sesuai
+
dengan larutan m edia cair 12 N P
karbenisilin
+
300 m g/l untuk m em peroleh
transform an target.
9.
10
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 1, dim ana tahap deteksi
transform an dilakukan dengan uji resistensi tanam an terhadap antibiotik K anam isin dan
dilanjutkan
dengan deteksi gen tunas m enggunakan
teknik peR
sehingga didapatkan
transform an target.
10. M etode transform asi
15
target
pada
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 9, dim ana ekspresi gen
transform an
dilakukan
dengan
m endeteksi
akum ulasi
mRNA
pada
transform an, sehingga diperoleh transform an target.
11.
M etode transform asi
genetik ke tanam an anggrek sesuai klaim 10, dim ana selanjutnya
transform an target dapat digunakan untuk m enghitung efisiensi transform asi.
20
f
•
10
Abstrak
METODE PENINGKATAN
EFISIENSI TRANSFORMASI GENETIK KE TANAMAN
ANGGREK Phalaenopsis
amabilis DENGAN PREKULTUR BI.JI PADA MEDIA
DENGAN SUPLEMEN EKSTRAK TOMAT DAN AIR KELAPA
5
Invensi ini m engenai m etode peningkatan efisiensi transform asi genetik ke tanam an anggrek
Phalaenopsis amabilis yang terdiri dari tahapan sebagai berikut: a) Prekultur biji anggrek dengan
m edia N P ditam bah ekstrak tom at dan air kelapa, b. T ransform asi genetik ke protokorm anggrek
10
P. amabilis dengan Agrobacterium
d) Pem buktian transform an
tumefaciens, c. Seleksi protokorm setelah transform asi, dan
dan transgenik anggrek.
D alam invensi ini prekultur selam a 3 m inggu pada m edia N P + ekstrak tom at 100 m g/l+
air kelapa 150 m lll m enyebabkan
efisiensi transform asi pada perlakuan kontrol positif m enjadi
relatif tinggi (7-17% ). Frekuensi pem bentukan
15
tunas hasil transform asi
genetik dari protokorm
anggrek P. amabilis m enjadi sangat tinggi yaitu m encapai 11-14 kali lipat dibandingkan
tanpa
perlakuan prekultur.
M etode transform asi dengan 3 m inggu prekultur pada m edia dengan penam bahan ekstrak
-tam at
100m g/1 sebelum
m eningkatkan
20
efisiensi
proses
transform asi
transform asi
genetik
pada
invensi
genetik pada anggrek P. amabilis,
ini
sangat
sehingga
signifikan
diharapkan
dengan m etode ini dapat diperoleh kultivar anggrek yang baru dengan lebih m udah dan sangat
prospektif untuk m em ajukan industri anggrek.
•
.I
12
18
36
S3
••••
.I
,J
.,