Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas serta Kapasitas Antioksidan Total Sari Buah Markisa Ungu (Passiflora edulis Sims) dan Sari Buah Markisa Konyal (Passiflora ligularis Juss)
Lampiran 1. Hasil identifikasi buah markisa ungu dan buah markisa konyal
Lampiran 2. Buah markisa ungu (Passiflora edulis Sims) dan buah markisa
konyal (Passiflora ligularis Juss) Buah markisa ungu (Passiflora edulis Sims)
Buah markisa konyal (Passiflora ligularis Juss)
Lampiran 3. Bagan kerja penelitian
Masing-masing 30 buah markisa ungu dan markisa konyal
← Dicuci bersih, dibelah menjadi dua bagian dan diambil isinya ← Disaring menggunakan saringan untuk mengambil sari buah nya tanpa penambahan air
Filtrat sari buah ← Dibekukan dalam freezer ← Dikentalkan dengan menggunakan freeze dryer ← Ditimbang beratnya
Markisa ungu : 18,938 g Markisa konyal : 21,370 g
Sari buah kental Skrining fitokimia
Pemeriksaan alkaloida Pemeriksaan glikosida
Pemeriksaan flavonoida Pemeriksaan tanin Pemeriksaan saponin Pemeriksaan Steroida/ triterpenoida
Identifikasi vitamin C berdasarkan daya reduksi
Reaksi Ag ammoniakal Reaksi Fehling
Hasil Uji aktivitas antioksidan
Hasil
Dilakukan uji aktivitas antioksidan secara spektrofoto metri UV- Visible
Uji kapasitas antioksidan total
Hasil
Dilakukan uji kapasitas antioksidan total secara spektrofotom etri UV- Visible
Lampiran 4. Gambar hasil identifikasi vitamin C berdasarkan daya reduksi
a. Reaksi Fehling
A B
b. Reaksi Ag Ammoniakal
C D Keterangan A & C : markisa ungu B & D : markisa konyal
Lampiran 5. Contoh perhitungan persen peredaman
% pemerangkapan radikal bebas = 100 (A kontrol – A sampel ) / A kontrol Sari kental buah markisa ungu Percobaan I
- Konsentrasi 2000 ppm
% pemerangkapan radikal bebas = 100 (0,9683 – 0,6322) / 0,9683 = 34,71 %
- Konsentrasi 4000 ppm
% pemerangkapan radikal bebas = 100 (0,9683 – 0,3028) / 0,9683 = 68,73%
- Konsentrasi 6000 ppm % pemerangkapan radikal bebas = 100 (0,9683 – 0,1852) / 0,9683
= 80,87%
- Konsentrasi 8000 ppm
% pemerangkapan radikal bebas = 100 (0,9683 – 0,0840) / 0,9683 = 91,33%
Lampiran 6. Perhitungan nilai IC
50
50 Persamaan regresi linear dan nilai IC Sampel Uji Persamaan regresi Nilai IC50 (ppm)
Sari kental buah markisa ungu Y = 0,0115X + 9,536 3518,61 Sari kental buah markisa konyal Y = 0,0074X + 0,0040 6752,62
Vitamin C Y = 11,8955X + 0,4940 4,16
50 sari kental buah markisa ungu
Contoh perhitungan nilai IC
2 X Y
XY
X
2000 34,79 69580 4000000 4000 68,98 275920 16000000 6000 82,67 496020 36000000 8000 91,24 729920 64000000
2
= 120000000 ∑ = 20000 ∑ = 277,68 ∑ = 1571440 ∑
X Y
= 4000 = 55,536
Keterangan : X = konsentrasi (ppm)
Y = % peredaman
( ∑ XY )−(∑ X)(∑ Y)/n
a =
2
2 ( ) /n ∑ X
−(∑ X) (1571440 ) 460720 −(20000)(277.68)/5
= = = 0,0115
2 (120000000 ) /5 40000000 −(20000)
b = Y � − aX�
= 55,536 − (0,0115)(4000)
= 9,536 Maka persamaan regresinya adalah Y = 0,0115X + 9,536
Nilai IC 50 50 = 00115X + 9,536
X = 3518,61 Maka IC
50 sari buah markisa ungu = 3518,61 ppm
Lampiran 7. Perhitungan bahan-bahan untuk pembuatan 100 ml larutan pereaksi
fosfomolibdenum
a. Ammonium Molibdat
BM = 1235,86 Molaritas yang diinginkan = 4 mM = 0,004 M
Berat (g) 1000 =
Molaritas × BM Volume (ml)
Berat (g) 1000 0,004 M = ×
1235,86 100 ml Berat (g) = 0,4943 g
b. Natrium Fosfat
BM = 163,94 Molaritas yang diinginkan = 28 mM = 0,028 M
Berat (g) 1000 Molaritas = ×
BM Volume (ml) Berat (g) 1000
= 0,028 M ×
163,94 100 ml Berat (g) = 0,459 g
c. Asam Sulfat
Molaritas yang diinginkan = 600 mM = 0,6 M Molaritas Asam Sulfat 98% = 18,4
M .V = M .V
1
1
2
2
18,4 . V = 0,6 M . 100 ml
1 V = 3,26 ml
1 Keterangan :
M
1 = Molaritas asam sulfat 98%
V = Volume asam sulfat 98% yang dibutuhkan
1 M 2 = Molaritas asam sulfat yang diinginkan
V
2 = Volume asam sulfat yang akan dibuat
Lampiran 8. Data penentuan waktu kerja (operating time)
Hasil pengukuran absorbansi larutan vitamin C dengan konsentrasi 12,727 µg/ml pada panjang gelombang 715,5 nm yang telah membentuk kompleks dengan larutan pereaksi fosfomolibdenum dapat dilihat pada Tabel berikut ini :
No. Menit ke- Absorbansi 1.
37 0,493 2. 38 0,491 3. 39 0,491 4. 40 0,492 5. 41 0,492 6. 42 0,492 7. 43 0,492 8. 44 0,493 9. 45 0,493 10. 46 0,493 11. 47 0,493 12. 48 0,493 13. 49 0,493 14. 50 0,493 15. 51 0,493 16. 52 0,494 17. 53 0,493 18. 54 0,493 19.
55 0,494 20. 56 0,494 21. 57 0,494 22. 58 0,494 23. 59 0,494 24. 60 0,494 25. 61 0,494 26. 62 0,494 27. 63 0,494
28.
64 0,494 29. 65 0,494 30. 66 0,494 31. 67 0,494 32.
68 0,495 33. 69 0,494 34. 70 0,494 35. 71 0,494 36. 72 0,495 37. 73 0,495 38. 74 0,494 39. 75 0,495 40. 76 0,495 41. 77 0,495
Lampiran 9. Contoh perhitungan konsentrasi larutan standar vitamin C untuk
penentuan kurva kalibrasi Konsentrasi LIB I = 1000 µg/ml Untuk larutan standar I: dipipet 4 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dengan akuades hingga garis tanda. Maka didapat konsentrasi sebagai berikut: 4 ml × 1000
μg/ml = = 80
Konsentrasi μg/ml 50 ml
Kemudian dipipet 0,5 ml, ditambahkan 5 ml pereaksi. Maka didapat konsentrasi sebagai berikut: 0,5 ml ×
80
40 μg/ml μg
Konsentrasi = = = 7,272 μg/ml
(0,5 + 5)ml 5,5 ml Untuk larutan standar II: dipipet 5 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dengan akuades hingga garis tanda. Maka didapat konsentrasi sebagai berikut: 5 ml × 1000
μg/ml Konsentrasi = = 100
μg/ml 50 ml Kemudian dipipet 0,5 ml, ditambahkan 5 ml pereaksi. Maka didapat konsentrasi sebagai berikut:
0,5 ml × 100
50 μg/ml μg
Konsentrasi = = = 10,909 μg/ml
(0,5 + 5)ml 5,5 ml Demikian untuk larutan standar berikutnya.
Lampiran 10. Kurva kalibrasi larutan vitamin C dengan berbagai konsentrasi
pada panjang gelombang 715,5 nm a. Daftar tabel kalibrasi larutan vitamin C dengan berbagai konsentrasi pada panjang gelombang 715,5 nm
No. Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi
1. 0,0000 0,0000 2. 7,272 0,3237 3. 9,090 0,3739 4. 10,909 0,4844 5. 12,727 0,5220 6. 14,545 0,6121 b.
Grafik kurva kalibrasi larutan vitamin C dengan berbagai konsentrasi pada panjang gelombang 715,5 nm
0.7
0.6
0.5 nsi
0.4 rba
0.3 bso A
0.2
0.1
0.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0 Konsentrasi µg/ml
Lampiran 11. Perhitungan persamaan garis regresi
= 0,3860
− (0,0418)(9,091) =
= 0,3860
= 0,0418 b = Y � − aX�
5,528 132,223
=
2 /6
(26,583) −(54,543)(2,3161)/6 (628,05) −(54,543)
=
2 /n
2 ) −(∑ X)
( ∑ XY )−(∑ X)(∑ Y)/n ( ∑ X
Y = % peredaman a =
Keterangan : X = konsentrasi (ppm)
Y
X Y
= 9,091
X
= 1,1264
2
628,05 ∑Y
2 =
∑ = 54,543 ∑ = 2,3161 ∑ =26,583 ∑
10,909 0,4844 5,284 119,006 0,2346 12,727 0,5220 6,643 161,977 0,2725 14,545 0,6121 8,903 211,557 0,3747
0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 7,272 0,3237 2,354 52,882 0,1048 9,090 0,3739 3,399 82,628 0,1398
2
2 Y
X
XY
0,0060 Maka persamaan regresinya adalah Y = 0,0418X + 0,0060
Lampiran 12. Perhitungan persamaan korelasi
( Σx)(Σy)
Σxy - n r =
2
2
( ( Σx) Σy)
2
2
- y
��Σx n � �Σ n � (54,543)(2,3161)
26,583 –
6 r =
2
2
(54,543) (2,3161) ��628,05 - � �1,1264 - �
6
6 126,327
26,583 –
6 r = 2974,939 5,3643
� �1,1264 – � ��628,05 –
6
6 26,583 – 21,055 r =
�|628,05 – 495,823||1,1264 – 0,8940| 5,528 r =
�|132,227||0,2324| 5,528 r =
�30,731 5,528 r = 5,544 r = 0,9971
Koefisien korelasi yang diperoleh adalah 0,9971, artinya ada hubungan yang linier antara konsentrasi dan serapan.
Lampiran 13. Contoh perhitungan kapasitas antioksidan total sari buah markisa
ungu Jumlah antioksidan yang terdapat dalam larutan sampel dihitung dengan menggunakan persamaan garis regresi:
Y = 0,0418X + 0,0060 Jumlah antioksidan yang terdapat dalam larutan sampel yang diukur adalah: Y = 0,0418X + 0,0060 0,4410 = 0,0418X + 0,0060 0,435 = 0,0418X X = 10,41 µg/ml Kapasitas antioksidan total sari buah markisa ungu adalah:
5,5 ml 25 ml 1 mg μg
= 10,41 × × ×
ml 0,5 ml 0,55 g 1000 μg
= 5,205 mg/g sari buah markisa ungu ekuivalen terhadap vitamin C = 1 g sari buah markisa ungu ekuivalen terhadap 5,205 mg vitamin C
Lampiran 14. Contoh perhitungan kapasitas antioksidan total sari buah markisa
konyal Jumlah antioksidan yang terdapat dalam larutan sampel dihitung dengan menggunakan persamaan garis regresi:
Y = 0,0418X + 0,0060 Jumlah antioksidan yang terdapat dalam larutan sampel yang diukur adalah: Y = 0,0418X + 0,0060 0,4331 = 0,0418X + 0,0060 0,4271 = 0,0418X X = 10,217 µg/ml Kapasitas antioksidan total sari buah markisa konyal adalah:
5,5 ml 25 ml 1 mg μg
= 10,217 × × ×
ml 0,5 ml 0,65 g 1000 μg
= 4,323 mg/g sari buah markisa konyal ekivalen terhadap vitamin C = 1 g sari buah markisa konyal ekivalen terhadap 4,323 mg vitamin C
Lampiran 15. Perhitungan statistik a.
= 0,163 Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = 5 maka t table = α/2, dk=4,0321. Data diterima jika t hitung
= 1,352 t hitung 6 = 0,163 6 /
, 163 6 / 0,090
0,056 - = 0,842 t hitung 5 =
= 2,495 t hitung 4 = 0,163 6 /
0,163 6 / 0,166 -
0,161 - = 2,419 t hitung 3 =
2 = 0,163 6 /
hitung
= 3,907 t
0,163 6 / 0,260
/ − t hitung 1 =
X X
SD n
≤ t tabel. t hitung =
6 0,133 −
Uji t untuk kapasitas antioksidan total sari buah markisa ungu No.
∑(X –
X X-
X (X- X )
2
1. 5,204 0,260 0,068 2. 4,783 -0,161 0,026 3. 4,778 -0,166 0,028 4. 4,888 -0,056 0,003 5. 5,034 0,090 0,008 6. 4,975 0,031 0,0009
∑X = 29,662
X = 4,944
X
1
)
2
= 0,133 SD =
( ) 1 - n X -
X 2 ∑
=
0,031 = 0,466 Dari hasil perhitungan di atas didapat semua t hitung ≤ t tabel, maka semua data tersebut diterima.
Maka, kapasitas antioksidan total sebenarnya adalah : µ =
X ± (t x SD / (α/2, dk) √n )
= 4,944 ± (4,0321 x 0,163 / √6 )
= ( 4,944 ± 0,27) mg/g b.
Uji t untuk kapasitas antioksidan total sari buah markisa konyal
X X-
2 No.
X (X- X )
1. 4,323 0,046 0,002 2. 4,356 0,079 0,006 3. 4,183 -0,094 0,008 4. 4,433 0,156 0,024 5. 4,214 -0,063 0,004 6. 4,151 -0,126 0,016
2
∑X = 25,66
X ) = 0,061
∑(X –
X = 4,277 2 X
- 0,061
X ( )
∑
SD = = = 0,110
−
- n
1
6
1 Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = 5 maka t table = α/2,
dk=4,0321. Data diterima jika t hitung ≤ t tabel.
X −
X
t hitung =
SD / n
0,046 t 1 = = 1,024
hitung
0,110 /
6 0,079 t hitung 2 = = 1,759
0,110 /
6
- 0,094 t 3 = = 2,093
hitung
0,110 /
6 0,156 t hitung 4 = = 3,474
0,110 /
6
- 0,063 t hitung 5 = = 1,403
0,110 /
6
- 0,126 t 6 = = 2,806
hitung
0,110 /
6 Dari hasil perhitungan di atas didapat semua t hitung ≤ t tabel, maka semua data tersebut diterima.
Maka, kapasitas antioksidan total sebenarnya adalah : µ =
X ± (t x SD / (α/2, dk) √n )
= 4,277 ± (4,0321 x 0,110 / √6 )
= (4,277 ± 0,18) mg/g
Lampiran 16. Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
∑ n Yi Y
0418 , 0167 , 10 x
10 =
X SY x
slope
= 1,199 µg/ml Batas kuantitasi =
0418 , 0167 , 3 x
3 =
X SY x
slope
Batas deteksi =
4 00112 , = 0,0167
=
2 2 − −
Y = 0,0418X + 0,0060 Slope = 0,0418
( )
=
X SY
= 0,00112
2
∑X = 54,543 ∑(Y –Yi)
0,31 0,014 0,000196 3 9,090 0,3739 0,386 -0,012 0,000144 4 10,909 0,4844 0,462 0,022 0,000484 5 12,727 0,5220 0,538 -0,016 0,000256 6 14,545 0,6121 0,614 -0,002 0,000004
1 0,0000 0,0000 0,006 -0,006 0,000036 2 7,272 0,3237
2
(Absorbansi) Yi (Y-Yi) (Y-Yi)
µg/ml) Y
X (Konsentrasi
No
= 3,995 µg/ml
Sari kental buah markisa ungu No
- baku
- baku
Serapan sampel
Standard Deviation (SD) 8,82
Rata-rata (% Recovery) 104,24
Sampel 1. 0,6084 0,4331 14,411 10,218 3,995 104,96 2. 0,6030 0,4364 14,282 10,297 3,995 99,75 3. 0,5997 0,4184 14,203 9,866 3,995 108,56 4. 0,5923 0,4440 14,026 10,478 3,995 88,82 5. 0,6075 0,4223 14,389 9,959 3,995 110,91 6. 0,6039 0,4161 14,304 9,811 3,995 112,46
(%) Sampel
(µg/ml) Persen perolehan
Baku ditambah kan
Serapan sampel Kapasitas (µg/ml)
Standard Deviation (SD) 7,14 b.
Rata-rata (% Recovery) 111,46
Sampel 1. 0,6087 0,4410 14,419 10,407 3,995 100,43 2. 0,6035 0,4058 14,294 9,565 3,995 118,38 3. 0,6054 0,4054 14,339 9,555 3,995 119,77 4. 0,6028 0,4146 14,278 9,775 3,995 112,70 5. 0,6079 0,4263 14,399 10,067 3,995 108,45 6. 0,6040 0,4219 14,306 9,950 3,995 109,04
(%) Sampel
(µg/ml) Persen perolehan
Baku ditambah kan
Serapan sampel Kapasitas (µg/ml)
Serapan sampel
metode penambahan baku vitamin C (Standard addition method) a.
Lampiran 17. Hasil uji perolehan kembali kapasitas antioksidan total dengan
Sari kental buah markisa konyal No
- baku
- baku
Lampiran 18. Contoh perhitungan persen perolehan kembali kapasitas
antioksidan total dengan metode penambahan baku (Standard
Addition Method )
Serapan Sampel + Baku = 0,6087 Serapan Sampel = 0,4410 Persamaan regresi : y = 0,0418 x + 0,0060 Kapasitas antioksidan total sampel + baku:
0,6087 - 0,0060 x = = 14,419 μg/ml
0,0418 Kapasitas antioksidan total dalam sampel:
0,4410 - 0,0060 x = = 10,407 μg/ml
0,0418 Kapasitas baku antioksidan yang ditambahkan = 3,995 µg/ml
C − C
F A
× 100% % recovery =
- C A Keterangan : C F = Konsentrasi antioksidan dalam sampel setelah penambahan baku C A = Konsentrasi antioksidan dalam sampel sebelum penambahan baku C* = Kapasitas antioksidan baku vitamin C yang ditambahkan
A
Kapasitas antioksidan (sampel+baku) - Kapasitas antioksidan sampel %Recovery =
×100% Kapasitas baku yang ditambahkan
14,419 μg/ml – 10,407 μg/ml
= ×100%
3,995 μg/ml
= 100,43% Perhitungan perolehan kembali (%) kapasitas antioksidan total pada sampel lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh di atas
Lampiran 19. Perhitungan simpangan baku relatif (RSD) kapasitas antioksidan
( ) 1 - n X - Xi 2
x
7
% 100 111 46 , 14 ,
100% =
X SD _
= 7,14 RSD = x
6 255 058 , −
1
=
∑
SD =
total a. Sari kental buah markisa ungu (Passiflora edulis Sims) No.
= 255,058
2
X )
∑(Xi –
X = 111,46
∑X = 668,77
1. 100,43 -11,03 121,661 2. 118,38 6,92 47,886 3. 119,77 8,31 69,056 4. 112,70 1,24 1,538 5. 108,45 -3,01 9,060 6. 109,04 -2,42 5,856
2
(Xi- X ) (Xi- X )
Persen Perolehan Kembali (Xi) (%)
= 6,41 % b.
Sari kental buah markisa konyal (Passiflora ligularis Juss) Persen Perolehan Kembali
2 No.
(Xi- X ) (Xi- X ) (Xi) (%)
1. 104,96 0,72 0,518 2. 99,75 -4,49 20,160 3. 108,56 4,32 18,662 4. 88,82 -15,42 237,776 5. 110,91 6,67 44,489 6. 112,46 8,22 67,568
2
∑X = 625,46
X ) =
∑(Xi – 389,175 2 X = 104,24
Xi
- SD =
X ( )
∑
n -
1 389 , 175
=
−
6
1
= 8,82
SD
RSD = x _ 100%
X
8 ,
82
x 100 %
= 104 ,
24 = 8,46 %
Lampiran 20. Tabel distribusi t
Lampiran 21. Gambar Alat Spektrofotometer UV-Visible (Shimadzu 1800)