UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh : Fajarini Wibondari Juvianingrum

  NIM : 058114032

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

  UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh : Fajarini Wibondari Juvianingrum

  NIM : 058114032

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

  

Berbahagialah dengan berkat yang diberikan hidup

untuk kita, dan jangan menggerutu dengan apa yang

tidak kita miliki. Rumah dibangun dengan batu-batu

yang telah tersedia, namun bukan dengan batu-batu yang

ada dipekarangan orang lain

( J. Donald Walters)

  Kupersembahkan karya ini untuk My Lord Yesus Kristus atas karunia-Nya Kakek dan Nenekku tersayang Papa, Mama dan Adik-adikku tercinta, Teman-taman dan almamaterku

  

PRAKATA

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala anugrah, rahmat, dan karuniaNya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi berjudul ”Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah

  

(Piper Crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa.” Skripsi ini disusun

dalam rangka memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.

  Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma.

  Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari bimbingan, bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih kepada :

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. drh. Reny Kusumastuti, M. P., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu dan atas ketersediaan memberikan arahan, dukungan serta masukan dalam penelitian dan penulisan skripsi ini.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. dan Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan saran serta kritikan yang membangun bagi penulis.

  4. Ibu Tri Yuliani, Ibu Haryati, Mas Anif dan segenap karyawan LPPT Universitas Gajah Mada yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

  5. Papa dan Mamaku tercinta atas kasih sayang, doa dan dukungan yang selalu menyertaiku.

  6. Adik-adikku tersayang Astiarani dan Agita yang selalu memberikan semangat.

  7. Presti, Erlin, dan Sinta atas kerjasama, canda tawa, dan keluh kesahnya selama penelitian.

  8. Andina, Novi, Nisi, Septi dan Vivi terima kasih atas segala motivasi dan kebersamaan kita yang indah.

  9. Teman kostku Sari dan Rias tempatku mengadu segala keluh kesah.

  10. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skrispsi ini.

  Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmi pengetahuan.

  Yogyakarta, 20 Agustus 2009 Penulis

  

INTISARI

  Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap 100.000 penduduk. Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Banyak studi dilakukan untuk memperoleh senyawa baru yang memiliki aktivitas antikanker, termasuk dari bahan-bahan alam. Salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Untuk itu, perlu dilakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui efek sititoksik fraksi etanol dari daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa berdasarkan harga LC .

  50 Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan

  lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberikan perlakuan terhadap kultur sel SiHa dengan fraksi etanol daun sirih merah. Metode pembuatan fraksi daun sirih merah menggunakan metode perkolasi dengan heksan kemudian etanol, sedangkan metode yang digunakan untuk uji sitotoksisitas yaitu metode MTT dan direct counting. Hasil yang diperoleh berupa persen kematian sel yang kemudian diolah secara statistik menggunakan analisis probit untuk mendapatkan harga LC .

50 Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etanol daun sirih merah

  memiliki efek sitotoksik pada sel SiHa dengan diperoleh harga LC untuk fraksi

  50

  etanol daun sirih merah terhadap sel SiHa sebesar 189,81 μg/ml pada metode

  MTT dan 129.12 μg/ml pada metode direct counting. Kata kunci: sitotoksisitas, sel SiHa, fraksi etanol, sirih merah, LC

  50

  

ABSTRACT

  Every year there are 100 new patients suffering cancer from each 100.000 people in Indonesia. Nowadays, cervix cancer becomes the most killing cancer in Indonesia. Many studies were done to obtain new anticancer drugs, include the ones from natural product. Piper crocatum Ruiz & Pav was one of the plants believed by Indonesian society which can be used as anticancer. Therefore, a research was done to figure out the cytotoxicity effect of Piper crocatum Ruiz & Pav ethanol fraction toward SiHa cell culture based on LC50 value.

  Cytotoxicity assay of ethanol fraction of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves was done toward SiHa cell. Percolation method was used to make the

  

Piper crocatum Ruiz & Pav leaves fraction with hexane and than ethanol.

  Afterward, MTT and direct counting method were applied for cytotoxicity assay. The percentages of cells death was calculated using probit analysis to get LC50. The result showed that ethanol fraction of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves has cytotoxicity effect on SiHa cell with LC50 189.81

  μg/ml using MTT method and 129.12 μg/ml using direct counting (trypan blue) method.

  Key words : cytotoxicity, SiHa cell, ethanol fraction, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC

  50

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN SAMPUL………………………………………………………. i HALAMAN JUDUL……................................................................................. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………………… iii HALAMAN PENGESAHAN………………………………………………… iv HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………… v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………………………… vi PRAKATA …………………………………………………………………… vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ……………………………………... ix

  INTISARI…………………………………………………………………….. x

  

ABSTRACT …………………………………………………………………… xi

  DAFTAR ISI…………………………………………………………………. xii DAFTAR TABEL……………………………………………………………. xvi DAFTAR GAMBAR………………………………………………………… xvii DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………. xix

  

BAB I PENGANTAR...................................................................................... 1

A. Latar Belakang.....................................................................................

  1 1. Permasalahan..................................................................................

  2 2. Keaslian penelitian………………………………………………..

  3 3. Manfaat penelitian...........................................................................

  3 B. Tujuan Penelitian…………………………………………………….

  3

  2. Tujuan khusus…………………………………………………….

  2. Fraksinasi…………………………………………………………

  9 H. Hipotesis…………………………………………………………...... 10

  F. Uji Sitotoksisitas…………………………………………………....... 8 G. Landasan Teori…………………………………………………….....

  E. Sel SiHa…………………………………………………………….... 7

  6 D. Kanker Cervix……………………………………………………….. 7

  5 C. Kanker………………………………………………………………..

  5 3. Perkolasi…………………………………………………………..

  5

  3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………….. 4 A. Tanaman Sirih Merah...........................................................................

  5 1. Penyarian………………………………………………………….

  5 B. Metode Penyarian…………………………………………………….

  5 4. Khasiat dan Penggunaan………………………………………….

  3. Kandungan Kimia…………………………………………………

  4

  4 2. Deskripsi Tanaman.........................................................................

  4 1. Keterangan Botani...........................................................................

  

BAB III METODE PENELITIAN………………………………………… 11

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……………………………………... 11 B. Variabel dan Definisi Operasional…………………………………… 11

  2. Definisi operasional………………………………………………

  12 C. Alat dan Bahan………………………………………………………. 12 1. Alat……………………………………………………………….

  12 2. Bahan……………………………………………………………..

  13 D. Tata Cara Penelitian…………………………………………………. 14

  1. Determinasi tanaman……………………………………………... 14

  2. Pengumpulan daun sirih merah…………………………………... 14

  3. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah……………………….. 14

  4. Identifikasi fraksi etanol daun sirih merah dengan KLT…………

  15

  5. Preparasi Sel SiHa………………………………………………... 16 6. Pembuatan larutan uji…………………………………………….

  18

  7. Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah………………..... 18

  8. Analisis Hasil…………………………………………………….. 19

  

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………. 21

A. Determinasi Tanaman………………………………………………..

  21 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah…………………………………...... 21

  C. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah……………………………….. 22

  D. Pembuatan Fraksi Etanol Daun Sirih Merah………………………… 22

  E. Preparasi Kultur Sel SiHa……………………………………………

  25 F. Uji Sitotokssitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah pada Sel SiHa…… 26

  1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT……………………………

  26

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN……………………………............. 37 A. Kesimpulan……………………………………………………..........

  37 B. Saran…………………………………………………………………

  37 DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………… 38 LAMPIRAN…………………………………………………………………..

  41 BIOGRAFI PENULIS………………………………………………………... 67

  

DAFTAR TABEL

Tabel I Hasil pengamatan profil KLT fraksi etanol daun sirih merah…….

  24 Tabel II Tabel nilai absorbansi fraksi etanol daun sirih merah pada tingkat konsentrasi dari 2000 – 0.122 μg/ml dengan metode MTT………. 27

  Tabel III Hasil %kematian sel SiHa dan harga probit setelah pemberian fraksi etanol daun sirih merah pada metode MTT………………... 28 Tabel IV Hasil perhitungan sel SiHa secara Direct Counting pada perlakuan masing-masing konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah dan control setelah inkubasi selama 24 jam...........................................

  31 Tabel V Hasil perhitungan sel Vero secara Direct Counting pada perlakuan masing-masing konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah dan kontrol setelah inkubasi selama 24 jam...........................................

  31 Tabel VI Hasil %kematian sel SiHa dan harga probit setelah pemberian fraksi etanol daun sirih merah pada metode direct counting……… 33 Tabel VII Hasil %kematian sel Vero dan harga probit setelah pemberian

  Fraksi etanol daun sirih merah pada metode direct counting…….. 33

  DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan…………………………..

  27 Gambar 2. Kurva konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap hasil perhitungan % kematian sel SiHa...........................................…… 28 Gambar 3. Grafik hubungan log konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap harga probit pada kultur sel SiHa pada metode MTT…… 29 Gambar 4. Kultur sel SiHa yang hidup dan kultur sel SiHa sel yang mati pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x……………………………………………………

  30 Gambar 5. Grafik konsentrasi ( μg/ml) fraksi etanol daun sirih merah terhadap

  % kematian sel SiHa dan sel Vero pada metode Direct Counting... 32 Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap harga probit pada kultur sel SiHa pada metode direct

   counting …………………………………………………………… 34

  Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap harga probit pada kultur sel Vero pada metode diret

   counting …………………………………………………………… 34 Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) …………….

  41 Gambar 9. Laminar Air Flow…………………………………………………

  41 Gambar 10.Tabung conical, flask dan 96 well plate…………………………... 42 Gambar 11. Inverted Microscope…………………………………………….. 42 Gambar 12. Cell counter dan haemocytomet…………………………………. 42 Gambar 13. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding cineol………………………………………………. 44 Gambar 14. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding caryophylen………………………………………..

  45 Gambar 15. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan Pembandingcavicol……………………………………………… 46 Gambar 16. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding carvacrol………………………………………….... 47 Gambar 17. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding kinin..………………………………………………. 48 Gambar 18. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding tanin.……………………………………………….

  49 Gambar 19. Hasil pengamatan KLT fraksi etanol daun sirih merah dengan pembanding rutin..……………………………………………….

  50

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Foto alat dan bahan uji sitotoksisitas……………………………

  43 Lampiran 2. Hasil kualitatif daun sirih merah dengan KLT………………….

  43 Lampiran 3. Perhitungan %kematian kultur sel SiHa dengan metode MTT…

  51 Lampiran 4. Perhitungan %kematian kultur sel SiHa dengan metode Direct

   Counting …………………………………………………………

  54 Lampiran 5. Perhitungan harga LC fraksi etanol daun sirih merah terhadap

  50

  sel SiHa pada metode direct counting………………………….. 58 Lampiran 6. Perhitungan harga LC fraksi etanol daun sirih merah terhadap

  50

  sel Vero pada metode direct counting………………………….. 60 Lampiran 7. Analisis Z-test pada kultur sel SiHa dengan metode Direct

  

Counting ………………………………………………………… 62

  Lampiran 8. Analisis Z-test pada kultur sel SiHa dengan metode Direct

  

Counting ………………………………………………………… 63

  Lampiran 9. Perhitungan harga LC fraksi etanol daun sirih merah terhadap

  50 sel SiHa pada metode MTT……………………………………..

  64 lampiran 10. Hasil determinasi daun sirih merah……………………………..

  66

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari

  setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2008a). Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Jumlah penderita kanker cervix adalah 90 hingga 100 per 100.000 penduduk, atau sekitar 230.137 orang yang 63% diantaranya sudah berada di stadium 3-4 dan 50% diantaranya meninggal (Angel, 2008).

  Dewasa ini pengobatan penyakit kanker dilakukan dengan cara pembedahan, penyinaran (secara fisika), dan secara kimia menggunakan obat baik sintetik maupun obat tradisional. Obat-obat yang termasuk obat sintetik mempunyai toksisitas yang sangat tinggi. Selain toksisitas yang sangat tinggi, obat sintetik memiliki efek samping yang tinggi pula, karena obat sintetik biasanya digunakan dalam dosis yang tinggi. Apabila tubuh penderita tidak mampu menerima obat sintetik tersebut maka obat tersebut tidak menyembuhkan melainkan dapat membunuh penderita tersebut. Oleh karena itu, perlu dikembangkan obat antikanker dari bahan alami yang memiliki efek samping merugikan yang relatif lebih kecil daripada obat antikanker sintetik (Mulyadi, 1996).

  Salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit seperti, kanker payudara, kanker rahim dan leukemia (Sudewo, 2005).

  Dari penelitian Nur’aniyah (2008) diketahui bahwa ekstrak etanol daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel kultur SiHa dengan nilai LC

  50

  sebesar 200,6 μg/ml. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap sel kanker untuk mengetahui seberapa besar potensi ketoksikan fraksi etanol daun sirih merah terhadap sel kanker. Jenis sel kanker yang berbeda dapat mempunyai sensitivitas dan selektivitas yang berbeda pula terhadap obat-obat antikanker.

  Pada penelitian ini dilakukan uji efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

  Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000). Metode lainnya yaitu direct counting yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien dengan menggunakan haemocytometer.

1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. apakah fraksi etanol daun sirih merah mengandung senyawa yang b. berapa harga LC

  50

  dari fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa? 2.

   Keaslian penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi ilmiah mengenai khasiat, kegunaan, dan efek sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

  b. Manfaaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat membuktikan secara ilmiah penggunaan fraksi etanol daun sirih merah sebagai obat antikanker dari bahan alam.

  B.

  

Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah.

2. Tujuan khusus

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga

BAB II PENELAAH PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah 1. Keterangan botani Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk famili Piperaceae dan genus Piper, dengan sinonim Piper ornatum N. E. Br.

  (Anonim, 2008a).

2. Deskripsi tanaman

  Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar. Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005).

  3. Kandungan Kimia

  Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

  4. Khasiat dan penggunaan

  Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit. Daun sirih merah mampu mengatasi penyakit seperti kanker payudara dan kanker rahim, dan leukemia (Sudewo, 2005).

  B.

  

Metode Penyarian

1. Penyarian

  Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).

  2. Fraksinasi

  Fraksinasi berupa beberapa tahapan ekstraksi pelarut dilakukan sebagai preparasi untuk keperluan analisis (Iqbal,2009).

  3. Perkolasi

  Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan Prinsip dari perkolasi sebagai berikut : serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zak aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh (Anonim, 1986).

C. Kanker

  Kata kanker berasal dari bahasa latin “cancri” yang berarti liar (Meleka, 1983). Kanker merupakan sekelompok penyakit yang ditandai oleh adanya pertumbuhan dan penyebaran sel abnormal yang tidak terkontrol. Ciri-ciri kanker antara lain pertumbuhan sel yang tinggi, aktivitas miotik tinggi, batasnya tidak teratur, mampu infiltrasi dan membentuk metastasis serta diferensiasi rendah (Bosman, 1996).

  Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel-sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa menyebar ke seluruh tubuh. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali dengan kerusakan gen pada regulator siklus sel. Pertumbuhan kanker merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis di mana dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan membentuk satu koloni kecil dalam jaringan yang sama dan mengakibatkan terjadinya perubahan genetik (Sherr, 1996).

  Karsinogenesis merupakan proses terjadinya kanker yang berlangsung lama. Karsinogenesis dapat terjadi akibat salah satu atau kombinasi faktor karsinogen kimiawi, alami, radiasi, biologis dan genetik. Perubahan akibat rangsangan faktor karsinogen tersebut melibatkan perubahan gen dari sel neoplasia atau sel yang mengalami transformasi (Soeripto, 1998). Kanker terjadi karena pemaparan berulang-ulang oleh satu atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983).

D. Kanker Cervix

  Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa karsinoma yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai

  

adenosquamosa karsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor-faktor penyebab kanker

cervix antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti,

  perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi metastasis yang jauh (King, 2000).

E. Sel SiHa

  Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip dengan sel epitelial dan sel ini mengandung Human

  F.

  

Uji Sitotoksisitas

  Sitotoksisitas ialah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas ini merupakan suatu uji yang cepat, terstandarisasi, sensitif dan tidak terlalu mahal, dengan kepentingan untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksis) secara biologik dalam jumlah yang signifikan. Sensitifitas yang tinggi dari uji ini dikarenakan adanya sel uji yang terisolasi dalam kultur dan tidak adanya mekanisme protektif tubuh yang mempengaruhi sel uji (Wallin dan Arscott, 1998).

  Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel (Barille, 1997). Kemampuan sel untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate reader (Castell & Gomez- Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).

  Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam perhitungan sel karena efisien dan akurat. Suatu chamber hitung yang memiliki kedalaman 0,1 mm digunakan sebagai media bantu dalam perhitungan sel. Pada bawah mikroskop dan sel dapat dihitung pada sejumlah bilik yand dipilih

  

haemocytometer . Dari perhitungan yang dilakukan, dapat ditentukan jumlah sel

  per ml dari suspensi tersebut. Untuk mengetahui sel yang hidup maupun yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue. Pada metode ini perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam chamber pada

  

haemocytometer agar tidak bergelembung yang dapat menyebabkan terjadinya

  kesalahan dalam perhitungan sel. Kondisi lain yang menentukan keakuratan dalam perhitungan sel adalah kebersihan bilik hitung yang digunakan dan ketepatan dalam pengisisan suspensi sel ke dalam chamber (Doyle and Griffiths, 2000).

  Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC . Klasifikasi tersebut

  50

  meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC = 0,19-0,528

  50

  mg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC = 0,528-

  50

  1,197 mg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC = 1,259-

  50

  2,515 mg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC =

  50

  2,528-4,939 mg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC > 5,0

  50 mg/ml (Mazzio,2009).

G. Landasan Teori

  Kanker merupakan sekelompok penyakit yang ditandai oleh adanya pertumbuhan dan penyebaran sel abnormal yang tidak terkontrol. Sejalan dengan dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa menyebar ke seluruh tubuh. Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Faktor-faktor penyebab kanker cervix antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok dan terpapar oleh Human

  Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II.

  Saat ini banyak bahan-bahan alami yang digunakan dalam pengobatan kanker, salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman sirih merah. Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri.

  Pada penelitian sebelumnya disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel SiHa, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui potensi ketoksikan yang lebih dari fraksi etanol daun sirih merah. Hal tersebut yang mendasari dilakukannya penelitian terhadap fraksi etanol daun sirih merah yang bila diperlakukan pada suatu kultur sel kanker seperti sel SiHa dapat menghambat pertumbuhan atau memiliki sitotoksisitas terhadap sel kanker.

H. Hipotesis

  Fraksi etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah (Piper

  

crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian

eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel

  a. Variabel bebas konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

  b. Variabel tergantung persentase kematian sel SiHa.

  c. Variabel pengacau terkendali 1. medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

  2. tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

  d. Variabel pengacau tak terkendali kematian alami sel

2. Definisi Operasional

  a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

  b. Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini merupakan bagian helaian daun (lamina) dari daun sirih merah c. Fraksi etanol daun sirih merah adalah hasil perkolasi serbuk daun sirih merah dengan pelarut etanol yang sudah dipisahkan senyawa non polarnya dengan pelarut heksan.

  d. Sel SiHa adalah salah satu sel kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16).

  e. LC ialah konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah yang mampu

  50 membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa.

C. Alat dan Bahan 1. Alat

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat- alat gelas (Pyrex), Oven, inkubator CO (Memmer), timbangan analitik

  2

  (Denver Instrument L-610), mesin penyerbuk (Modifikasi LPPT UGM), percolator, vacuum rotary evaporator, seperangkat alat KLT, vortex (Max Mix Therolyne), yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc),

  tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge, mikropipet 0,5-10 µl dan

  counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

  a. Bahan utama : daun sirih merah segar

  v

  b. Bahan untuk fraksinasi : heksana dan etanol 96 % /

  v

  c. Uji sitotoksisitas : 1) Kultur sel SiHa yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  2) Kultur sel normal (sel vero) yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  3) Medium pencuci sel : RPMI 1640, M199, Natrium bikarbonat, dan hepes.

  4) Medium penumbuh sel : RPMI 1640, M199, FBS (Fetal Bovine Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco).

  5) Pewarna Trypan blue (Sigma) 6) DMSO (Dimetil Sulfoksida) 7) Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N

  (Merck) 8) Bahan untuk isolasi sel SiHa (Tripsin 0,5 %) 9) Aquabidest

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

  Determinasi daun sirih merah segar dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965).

  2. Pengumpulan daun sirih merah

  Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah yang tumbuh di Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.

  3. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah

  a. Pembuatan serbuk Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 50

  ˚C. Setelah kering, daun diserbuk dengan mesin penyerbuk sampai halus.

  b. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah Serbuk simplisia 100 g ditimbang lalu masukan dalam percolator yang telah diberi kertas saring. Serbuk dalam perkolator direndam dengan 400 ml heksana. Setelah 24 jam hasil rendaman dialirkan dan ditampung dalam labu ukur, dikarekan hasil rendaman masih berwarna hijau pekat maka pelarut heksana ditambahkan hingga hasil rendaman jernih sebanyak 350 ml. Hasil rendaman diangin- anginkan an didapatkan ekstrak heksana daun sirih merah.

  Sisa rendaman serbuk dikeringkan dalam almari pengering dan selajutnya digunakan untuk membuat fraksi etanol daun sirih merah.

  Serbuk yang telah kering, dimasukan dalam perkolator kembali yang telah diberi kertas penyaring. Serbuk direndam dalam etanol 96% sebanyak 700 ml, setelah 24 jam hasil rendaman dialirkan hingga hasil rendaman jernih. Sisa etanol dihilangkan dengan evaporator dan didapat fraksi kental etanol daun sirih merah. Kandungan senyawa dalam fraksi etanol daun sirih merah diidentifikasi.

4. Identifikasi fraksi etanol daun sirih merah dengan KLT

  a. Identiifikasi minyak atsiri (cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol) Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol serta pembanding cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol ditotolkan pada silika GF 254, kemudian dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh dengan toluene : etil asetat (93 : 3). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Disemprot vanillin-sulphuric acid dan dipanaskan untuk identifikasi bercak kemudian dilihat di bawah sinar UV 254 dan 365 nm.

  b. Identifikasi flavonoid Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol dan pembanding rutin ditotolkan pada selulosa, kemudian masukan formiat : air (100 : 11 : 11 : 27). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Uap amonia untuk identifikasi bercak.

  c. Identifikasi kinin Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol dan tambahkan ammoniak 10% lalu di vortex dan tambahkan kloroform. Fase kloroform

  (bagian bawah) dan pembanding kinin ditotolkan pada silika GF254, kemudian masukan dalam chamber yang telah jenuh dengan etil asetat : methanol : air (100 : 13,5 : 10) dan methanol : amoniak (100 : 1,5). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Disemprot reagen Dragendroff untuk identifikasi bercak.

  d. Identifikasi tannin Fraksi etanol larutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol dengan pembanding tannin disemprotkan pada siika GF254, masukan dalam chamber yang telah jenuh dengan butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Disemprot reagen FeCl untuk identifikasi bercak.

  3 5.

   Preparasi sel SiHa

  a. Propagasi sel SiHa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera