BAHAN DAN METODE Pembentukan Populasi F-2 Transgenik
Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 297-305
Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra
TRANSM ISI GEN krt-GP11 DAN PERFORM A KETAHANAN IKAN M AS ( )
Cyprinus carpio
TRANSGENIK F-2 TERHADAP INFEKSI KHV
#Khairul Syahput ra , Flandriant o Sih Palimirmo, dan Yogi Himawan
Balai Penelitian Pem uliaan Ikan
ABSTRAKPembentukan ikan mas transgenik merupakan salah satu program penelitian di Balai Penelitian Pemuliaan
Ikan, Sukamandi dalam rangka menghasilkan varietas unggul ikan mas tahan infeksi KHV ( Koi herpesvirus ).
Pada tahun 2015 telah dilakukan pembentukan ikan mas transgenik tahan KHV generasi F-2. Penelitian ini
bertujuan untuk mengevaluasi transmisi gen krt-GP11, ketahanan ikan mas transgenik F-2 terhadap infeksi
KHV, keberadaan marka Cyca-DAB1*05 tahan KHV pada populasi ikan mas transgenik F-2. Ikan mas transgenik
F-2 dihasilkan dengan memijahkan ikan mas transgenik F-1 jantan dengan betina non-transgenik. Pengujian
transmisi transgen dan deteksi marka ketahanan KHV pada transgenik F-2 dilakukan dengan metode PCR
menggunakan primer spesifik untuk transgen krt-GP11 dan gen Cyca-DAB1*05. Evaluasi ketahanan ikan
mas transgenik F-2 terhadap infeksi KHV dilakukan dengan uji tantang secara kohabitasi. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa transmisi gen krt-GP11 pada keturunan F-2 memiliki persentase yang relatif rendah
yaitu sebesar 0%-2%. Ikan mas transgenik F-2 memiliki ketahanan relatif baik terhadap KHV dengan sintasan
uji tant an g se be sar 90% dan tidak b erbe da n yata d en gan ikan m as pe mb an ding atau no n-tran sgen ik
(P> 0,05). Tingginya pesentase keberadaan marka Cyca-DAB1*05 pada populasi transgenik berperan pada
ketahanan ikan mas transgenik terhadap infeksi KHV.KATA KUNCI: ikan mas; KHV; transgenik; uji tantang; transmisi gen krt-GP11
ABSTRACT: Transmission of krt-GP11 gene and resist ance performance of F-2 transgenic common carp
( Cryprinus carpio) against to KHV infection. By: Khairul Syahputra, Flandrianto Sih Palimirmo, andYogi Himawan
Creat ing of t ransgenic common carp is one of t he breeding programs in Research Inst it ut e for Fish Breeding for
producing a superior st rain of common carp resist ant t o KHV (Koi herpesvirus ). Since 2015, t he creat ion of common
carp t ransgenic has been conduct ed t o produce F populat ion resist ant t o KHV. This st udy was aimed t o evaluat e t he
2 2exist ence of Cyca-DAB1*05 marker resist ant t o KHV in F t ransgenic populat ion. F t ransgenic populat ion has been
2
2produced by mat ing F t ransgenic male wit h non t ransgenic female. Transgene t ransmission and t he exist ence of
1marker resist ant t o KHV in F t ransgenic populat ion were evaluat ed by PCR method using specific primer t o krt -GP11
2gene and Cyca-DAB1*05 gene, respect ively. The resist ance of F t ransgenic populat ion against t o KHV infect ion was
2evaluat ed by challenge t est using cohabit at ion met hod. The result showed t hat t ransmission of krt -GP11 gene in F
2t ransgenic population was relat ively low wit h percent age of 0-2%. The resist ance of F transgenic common carp against
2t o KHV was relat ively high wit h survival rat e of 90% and was not significantly different from non t ransgenic (P> 0.05).
High percent age of t ransgenic population having Cyca-DAB1*05 marker had a role in resistance of t ransgenic population
against KHV infect ion.KEYW ORDS: common carp; KHV; transgenic; challenge test; transgene transmission
PENDAHULUAN khususnya pada ikan budidaya yang bernilai ekono mis
et altinggi (Zhong ., 2002; Dunham, 2009). Pemanfaatan Tekno lo gi t ransgenik po t ensial digunakan unt uk
et al
t ekno lo gi ini t elah diawali o leh Anderso n . (1996) m e n in g k a t k a n k e t a h a n a n p e n ya k it p a d a ik a n d en gan m en t ran sfer ge n p e nyan d i an t ise n se viral # ( viral coat pr ot ein gene ) yan g dap at m e n in gkat kan
Oncorhynchus mykiss
Ko r e sp o nd e n si: Balai Pe ne litian Pem u liaan Ikan . Jl. Raya 2 ket ahanan ikan rainbo w t ro ut ( )
Pan t u r a Su kam an d i, Su b an g 41 2 6 3 , Jawa Bar at , In d o n e sia.t e rh ad ap viru s. Pe n in gk at a n ke t ah an an p e n yak it
Te l. + (0 2 6 0 ) 5 2 0 5 0 0
d e n gan t ran sge n e sis ju g a t e lah d ila ku ka n u n t u k
E-m ail: khai r ul _ syahput r a@ yahoo.com Co p yright @ 2 016 , Jurnal Rise t Akuakultu r, p -ISSN 190 7-67 54, e-ISSN 25 02-6534
297 Co p yright @ 2 016, Ju rnal Riset Aku aku ltur, p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Transmisi gen krt -GP11 dan performa ket ahanan ikan mas ..... (Khairul Syahput ra)
penyakit lainnya sepert i int ro duksi gen lakto ferin pada ikan
. (2011), dan bahkan marka ini t elah berhasil dan efektif digunakan pada kegiatan pemuliaan ikan mas t ahan KHV di Indo nesia (Ariyanto
., 2006), dan ikan ko i (Emmenegger & Kurat h, 2008). Pembent ukan ikan mas t ransgenik tahan KHV t elah diawali de ngan pem be nt u kan ikan mas t ransgen ik
founder dengan mengint ro duksikan gen gliko pro t ein
t a h a n KHV (k r t -GP1 1 ) m e n g g u n a k a n m e t o d e elektroporasi sperma. Pada tahun 2013 telah diperoleh
founder
t r an s ge n d i sp e rm a , d an p ad a t ah u n 2 0 1 4 t e lah dipero leh ikan mas t ransgenik F-1 jant an yang po sit if membawa t ransgen di sperma. Berdasarkan hasil uji t ant ang, ikan mas t ransgenik F-1 memiliki daya t ahan t erhadap KHV yang lebih baik dibandingkan ikan no n- t ran s ge n ik d e n gan p e n in gkat an sin t asan se b e sar 20 ,3 2% (Syahp ut ra et al ., 2 01 4). Pada t ah un 2 01 5, kegiat an pe nelit ian lanju t an yan g dilakukan ad alah pe mb en t u kan ikan m as t ransge nik F-2 t ahan KHV. Pe m b e n t u kan ikan m a s t ran s ge n ik F-2 d ilak u kan dengan mengawinkan ikan mas jant an t ransgenik F-1 dengan ikan mas bet ina no n-t rangenik.
Pe n e lit ia n in i b e r t u ju a n u n t u k m e n ge va lu a s i t ran smisi ge n krt -GP1 1 p ad a ikan mas t ransge nik generasi F-2 dan mengevaluasi performa ketahanannya t erh adap KHV. Selain it u , pad a p e ne lit ian ini juga dilakukan evaluasi keberadaan marka molekuler Cyca- DAB1*05 t erkait ket ahanan KHV pada po pulasi ikan mas t ransgenik F-2. Keberadaan marka t ersebut dapat m e me n garu h i ke t ah an an ikan m as t ran sgen ik F-2 t erhadap infeksi KHV selain gen krt -GP11 yang t elah d iin t r o d u k s ik a n . Be b e r a p a p e n e lit ia n t e r b a r u menunjukkan bahwa marka Cyca-DAB1*05 berko relasi t erhadap ket ahanan ikan mas t erhadap infeksi KHV sepert i yang dilapo rkan o leh Rakus
et al
. (2009) dan Alimuddin
et al
et al
., 2000), ikan mas (Kanello s
., 2015; Sucipt o et al ., 2014).
BAHAN DAN M ETODE Pembentukan Populasi F-2 Transgenik
Sebanyak lima eko r induk jant an F-1 t ransgenik yang membawa gen krt -GP11 pada gamet dipijahkan d e n gan in d u k b e t in a yan g n o n -t ra n sge n ik u n t u k mendapat kan keturunan F-2. Induk yang telah matang go n ad d ip ijah kan d an d it e mp at kan ke d alam b ak pemijahan. Pemijahan dilakukan dengan met o de semi- buat an dan buat an yang disesuaikan dengan ko ndisi kesiapan induk saat pemijahan. Induk diinduksi dengan p e n yu n t ik a n o va p r im u n t u k m e n d a p a t k a n keseragaman kemat angan sperma, t elur, dan o vulasi. Pada induk b et ina o vaprim diberikan dengan d o sis 0 ,3 m L/k g b o b o t , s e d a n g k an p a d a in d u k jan t a n dilakukan penyunt ikan ovaprim dengan dosis 0,15 mL/ kg bo bo t. Pada pemijahan buat an, sel telur, dan sperma d ip e ro leh dari ind u k yan g t e lah d iin jeksi o vap rim dengan cara
st riping
yang dilakukan 10-12 jam set elah penyuntikan. Lar va dan benih yang dihasilkan dipelihara sesuai dengan SOP pemeliharaan lar va dan benih ikan mas. Lar va dipelihara pada bak pendederan t ahap-1 ukuran 25 m 2 dengan kepadat an 800 eko r/m 2 . Selama pemeliharaan, lar va memanfaat kan pakan alami yang t erdapat pada bak pemeliharaan yang t elah disiapkan s e b e lu m n ya . Se t e la h d u a m in g g u d a la m t a h a p pemeliharaan pendederan-1, benih dipindahkan ke bak pendederan t ahap-2 dengan kepadat an 50 eko r/m 2 . Selama t ahap pendederan-2 benih diberi pakan buatan dengan kandungan protein 40% sampai umur 2-3 bulan.
Transm isi Transgen
Transmisi t ransgen pada ket urunanan F-2 dilakukan dengan analisis PCR menggunakan DNA geno m dari la r va d an b e n ih ikan m a s t ra n s ge n ik yan g t e lah b e r u m u r 2 -3 b u lan . Pad a lar va , d e t e ksi t ran s ge n dilakukan pada 150 eko r lar va yang telah berumur t iga hari set elah menet as dan diambil secara acak pada se t ia p p o p u la si F-2 . Eks t ra ksi DNA g e n o m lar va dilakukan d engan cara d igab ung (
pool
), set iap
pool
et al
et al
grass carp
Ict alurus punct at us ) (Du n h a m et al ., 2 0 0 2 ), ik a n m e d a k a
(
Ct enopharyngodon idellus
) yang dapat meningkat kan ket ahanan t erhadap virus GCH (
Grass Carp Haemorrhage ) (Zh o ng et al ., 20 02), sedangkan
pada ud an g t elah dilakukan o le h Lu & Sun (2 00 5) dengan ment ransfer gen ant isense
Taura syndrome vi- rus-coat protein
dapat meningkatkan ketahanan terhadap virus
Taura
. Tid ak hanya ket ahanan t erhadap virus, ketahanan penyakit yang disebabkan bakt eri juga t elah dilapo rkan, sepert i pada ikan channel cat fish (
(Sarmasik
., 2001; Kim
et al
., 2002), dan ikan grass carp (Weifeng
et al
., 2004). Ke t ahanan t erhadap bakt e ri dan virus juga t elah dilapo rkan o leh Chio u et al . (2014) pada ikan rainbo w t ro ut .
Pe ndekat an t ransgenesis perlu dilakukan unt uk menghasilkan ikan mas t ahan penyakit khususnya
Koi H er p esvi r us
(KHV). KHV m e r u p a k a n vir u s ya n g menyerang dan menyebabkan kemat ian massal pada ikan m as, p en yakit KHV m en ye bab kan p e n uru nan pro d ukt ivit as n asio n al ikan mas sejak t ahu n 20 02 (Sunart o
et al
., 2005). Pembent ukan ikan mas t ahan KHV d a p a t d ila k u k a n d e n g a n m e n t r a n s fe r g e n imuno genik (gliko pro t ein) t ahan KHV. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa gen gliko prot ein dapat meningkat kan ket ahanan ikan t erhadap virus sepert i pada ikan rainbo w t ro ut (LaPat ra
et al
berisi sebanyak 30 larva. Berbeda dengan larva, det eksi t r a n s g e n p ad a b e n ih d ila k u k a n s e ca r a in d ivid u Co p yright @ 2 016 , Jurnal Rise t Akuakultu r, p -ISSN 190 7-67 54, e-ISSN 25 02-6534
299
: CTAATGGATACTACTGG d a n
(MRC, USA) sesuai pro sedur yang terdapat pada manual k it . DNA g e n o m h a s il e k s t r a k s i d ia m p lifik a s i menggunakan kit PCR
DNAzol Reagent Genomic DNA Isolation Reagent
Pe m e r ik s a a n KHV p a d a ik a n u ji d ila k u k a n menggunakan DNA geno m yang diekst raksi dari o r- gan insang. DNA geno m diekst raksi menggunakan kit komersil
Pem eriksaan KHV dengan M etode PCR
Uji t an t an g d ilaku k an p a d a w ad ah u ji b e r u p a akuarium berukuran 60 cm x 40 cm x 40 cm. Jumlah ikan uji yang digunakan sebanyak 30 ekor per akuarium d e n gan ke p ad at an s at u e ko r p e r lit e r a ir. Se t iap p e rlaku an u ji t an t an g d ilaku kan d e n gan t iga kali ulangan. Suhu air pemeliharaan dikondisikan pada suhu yang permisif bagi perkembangan KHV yait u berkisar 22°C-24°C. Uji tant ang dilakukan selama 14 hari, set iap akuarium pengujian diberikan aerasi yang cukup selama menggunakan pakan ko mersial (pro t ein 28%). Pakan diberikan secuku pnya agar ikan uji t e t ap be rt ah an hidup. Penyifo nan dan pergant ian air (sebanyak 50% vo lume air pengujian) dilakukan set iap dua hari sekali unt uk membersihkan sisa pakan. Pengamat an gejala klinis dan m o rt alit as ikan uji dilakukan set iap h ari selama pengujian. Ikan yang mat i selama pengujian d a n s e la n ju t n ya d ila k u k a n p e m e r ik s a a n KHV menggunakan met o de PCR.
virus KHV dengan do sis 0,1 mL/eko r. Set elah diinjeksi virus KHV, ikan sumb er dipelihara dalam aku arium berukuran 60 cm x 40 cm x 40 cm dengan kepadat an sat u eko r per lit er air hingga menunjukkan gejala klinis t erinfeksi KHV. Verifikasi ikan sumber t elah t erinfeksi KHV d ilakukan d en gan me t o d e PCR. Analisis PCR d ila k u k a n p a d a b e b e r a p a ik a n s u m b e r ya n g m e n u n ju kkan ge jala klin is t e rin fe ksi KHV se lam a pemeliharaan.
filt rat e homogenat e
F 2 B# 2 m e r u p a k a n p o p u la s i t e r in d ik a s i p o s it if membawa gen krt -GP11 di benih. Sebagai pembanding digunakan ikan mas Rajadanu hasil seleksi t ahan KHV yang merupakan koleksi BPPI, Sukamandi dan ikan mas Majalaya t ahan KHV (Man t ap ) yan g d ip e ro le h d ari BBPAT, Su ka b u m i. Pe n g u jia n d ila k u k a n d e n g a n menambahkan sebanyak t iga ekor ikan sumber infeksi KHV pada t iap pengujian. Ikan sumber infeksi KHV dibuat dengan cara menginjeksikan
Uji t ant ang dilakukan dengan met o de ko habit asi yang me ngacu pada pro t o ko l n o mo r-3 t ent ang u ji t ant ang ikan mas t erhadap KHV (Pusat Pengembangan Ika n Ma s Na sio n al, PPIMN 2 0 1 2 ). Ik a n u ji yan g digunakan adalah benih ikan mas t ransgenik F-2 yang diambil secara acak pada po pulasi F 2 B# 2. Po pulasi
Uji Tantang Ikan M as Transgenik F-2
(Thermo Scient ific, Lit huania), dengan p ro se d u r me n giku t i p ro t o ko l yan g t e rd ap at p ad a manual kit . Pro gram PCR amplifikasi Cyca-DAB1*05 meliput i: 95°C se lama t iga menit ; (95 °C selama 30 det ik; 50°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 30 siklus; dan 72°C selama 10 menit . Hasil am plifikasi PCR m arka Cyca-DAB1 *05 d ivisualisasi dengan pro sedur yang t elah dijelaskan sebelumnya.
GeneJET DNA Purificat ion Kit
: ATCGCTGACTGTCTGTT d e n g a n u k u r a n p ro d u k am p lifikasi seb e sar 3 0 0 b p . Marka Cyca-DAB1 *0 5 d id e t eksi p ad a DNA ge n o m yan g d ie kst raksi d ari jaringan sirip menggunakan kit ko mersial
r ever se
f or w ar d
Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 297-305
reverse
m e n gg u n ak an DNA ge n o m yan g d ie k st r aksi d a ri jaringan sirip. Det eksi dilakukan pada 100 eko r benih ikan mas t rasngenik F-2 yang t elah berumur 2-3 bulan ya n g d iam b il se ca ra a cak . Ek st ra ksi DNA ge n o m dilakukan dengan menggunakan kit ko mersial
GeneJET DNA Pur ificat ion Kit
(The rm o Scie nt ific, Lit h uania), dengan pro sedur mengikut i pro t o ko l yang t erdapat pada manual kit . DNA hasil ekst raksi disimpan pada suhu -20°C hingga dilakukan pro ses amplifikasi PCR. Kemurnian dan kuant it as DNA diukur menggunakan alat GeneQuant TM 1300. Analisis PCR u nt uk de t e ksi t ran sge n d ilaku kan m e n g gu n ak a n k it Fas t St a r t PCR Ma s t e r (Ro ch e ,
Jerman) dan primer spesifik unt uk gen krt -GP11 yait u
forward
: 5’-GCCTTCGTGGCCCTTCCCAC-3’ dan
: 5 ’-GGTTGCTCCTGTCCGCCACC-3 ’ d e n gan p an jan g fragmen amplifikasi 480 bp. Ko mpo sisi bahan yang
., 2 0 1 1 ) ya it u
digunakan untuk amplifikasi PCR adalah 12,5 µL M as- t er M ix
PCR; 0,375 µL untuk tiap primer (20 µM); 2,5 µL DNA genom dan ditambahkan w at er PCR-gr ade hingga total volume 25 µL. Pr o g r a m PCR ya n g
digunakan meliput i: 95°C selama empat menit ; (95°C selama 30 det ik; 64°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 40 siklus; dan 72°C selama t ujuh m e n it . Ha sil a m p lifik a si PCR d is e p a ra s i d e n g a n elekt ro fo resis pada gel agaro se 2% yang t elah diberi pewarna GelRed TM (Bio t ium) dan hasil elekt ro fo resis d ia m a t i p a d a UV t r a n s ilu m in a t o r d a n didokumentasikan menggunakan kamera digital Canon EOS 1100D.
Det eksi M arka Cyca-DAB1*05 pada Populasi Ikan M as Transgenik F-2
Pe n gu jia n in i d ilak u k a n u n t u k m e n g e va lu a s i pengaruh keberadaan marka Cyca-DAB1*05 t erhadap ket ahanan ikan mas t ransgenik F-2 pada infeksi KHV s e la in p e r a n t r a n s g e n k r t -GP1 1 ya n g t e la h diint ro duksi. Det eksi marka Cyca-DAB1*05 dilakukan pada 50 eko r ikan mas t ransgenik F-2 dengan met o de PCR menggunakan primer spesifik unt uk alel Cyca- DAB1 *0 5 (Alim u d d in
et al
Hot St art Green PCR mast er M ix Co p yright @ 2 016, Ju rnal Riset Aku aku ltur, p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Transmisi gen krt -GP11 dan performa ket ahanan ikan mas ..... (Khairul Syahput ra)
2X (Thermo Scie nt ific, Lit huania) . Primer PCR yang
founder
founder
ke F-1 sebesar 3% (Syahput ra
et al
., 2014). Transmisi t ransgen pada penelit ian juga be rbed a de ngan t ransmisi t ran sgen pad a ikan m as t ransgenik yang dilapo rkan o leh Zho ng
et al
. (2012) ikan mas t ran sge nik yan g d it ran sfe r ge n h o rm o n p e t u m b u h a n m e n gg u n a kan m e t o d e m ik ro in je k si m e m iliki t ran sm isi t ransge n yan g m e n giku t i p o la pewarisan Mendel.
Transmisi t ransgen pada ikan mas t ransgenik pada penelit ian ini juga cukup rendah dibandingkan dengan pe nelit ian t ransgen ik pad a ikan lainn ya. Pada ikan t ran sg e n ik co h o sa lm o n , t ran s m isi t ran sge n d ari
ke F-1 be r variasi d engan kisaran t ransmisi 2,2%-18,9% (Devlin
f ounder ke F-1 .
et al
., 1995). Devlin
et al
. (1995) jant an
founder
t idak ment ransmisikan t ransgen pada ket urunan F-1. Variasi t ransmisi t ransgen pada ikan transgenik juga dilapo rkan o leh Kobayashi
et al
. (2007), t ransmisi t rangen dari induk F-1 ikan nila t ransgenik pada ket urunan F-2 berkisar ant ara 55%-60%.
Tran sm isi t ran sge n p ad a p e n e lit ian in i h an ya 2 %, sedangkan dari
Hasil det eksi t ransgen pada lar va dan benih ikan m as t ransge n ik F-2 m en u njukkan bah wa t ransge n dapat diwariskan at au dit ransmisikan dari F-1 pada generasi F-2, meskipun t idak semua induk F-1 dapat menurunkan t ransgen pada F-2. Transmisi t ransgen dari F-1 ke F-2 leb ih rend ah dib andingkan dengan g e n e r as i s e b e lu m n ya ya it u d a r i
d igun akan un t u k p e me riksaan KHV ad alah sph l-5 dengan sekuen
volume 25 µL. Proses PCR dilakukan dengan program:
forward
5'-GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG-3' dan reverse 5'-GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC- 3 ' d e n g an p a n jan g fr ag m e n am p lifik a s i 2 9 0 b p .
Ko mpo sisi bahan yang digunakan unt uk amplifikasi
PCR adalah 12,5 µL M axima Hot St art Green PCR M ast er M ix (2X) ; 0,5 µL untuk tiap primer (20 µM); 2 µL DNA
genom dan ditambahkan
water nuclease-free
hingga to tal
95°C selama empat menit ; (95°C selama 30 det ik; 55°C selama 30 det ik; 72°C selama sat u menit ) sebanyak 40 siklus; dan 72°C selama 10 menit . Hasil amplifikasi PCR dice k d en gan p ro sed u r yan g t e lah dije laskan sebelumnya.
F 2 SA# 3, pada po pulasi ini t ransgen t idak t erdet eksi baik pada t ahap lar va maupun benih. Sampel benih yang diperiksa unt uk t iap po pulasi adalah sebanyak 100 ekor. Transgen yang terdet eksi pada populasi benih F 2 B# 2 memiliki persent ase yang kecil yait u dari 100 e ko r yan g d ip e riksa h an ya d u a e ko r yan g p o sit if t ransgen (Gambar 2).
Analisa Data
Dat a t ran sm isi ge n krt -GP1 1 d an p e m e riksaan marka Cyca-DAB1*05 pada po pulasi t ransgenik F-2, sert a dat a hasil deteksi KHV pada uji t ant ang dianalisis secara deskript if. Analisis statistik dilakukan pada dat a sint asan uji t ant ang menggunakan uji
one way Anova dengan selang kepercayaan 95%.
HASIL DAN BAHASAN Populasi Ikan M as Transgenik F-2
Sebanyak lima po pulasi ikan mas t ransgenik F-2 het ero zigo t t elah dibent uk pada penelit ian ini yait u populasi F 2 SA# 1, F 2 SA# 2, F 2 SA# 3, F 2 B# 1, dan F 2 B# 2. Po pulasi F 2 SA# 1, F 2 SA# 2, dan F 2 SA# 3 dihasilkan dari pemijahan semi-buat an sedangkan F 2 B# 1 dan F 2 B# 2 dihasilkan dari pemijahan buat an.
Det eksi dan Transmisi Gen krt-GP11 Pada Lar va dan Benih Populasi F-2 Transgenik
Hasil analisis PCR det eksi t ransgen krt -GP11 pada lar va menunjukkan bahwa hanya sat u po pulasi yang po sit if membawa t ransgen di lar va dari lima po pulasi yang dihasilkan, yait u populasi F 2 SA# 1. Transgen yang t e rd e t e k s i p a d a p o p u la s i F 2 SA# 1 m e n u n ju k k a n pe rsen t ase yan g ke cil, dari lim a samp el p en gu jian dengan masing-masing sam pel t erdiri at as 30 eko r lar va h an ya sa t u s am p e l yan g p o sit if t e rd e t e ks i t ransgen unt uk masing-masing po pulasi (Gambar 1).
Hasil yang relat if berbeda t erdet e ksi pada level benih, berdasarkan analisis PCR menunjukkan bahwa pada po pulasi F 2 B# 2 yang negat if t ransgen di lar va namun t erdeteksi pada level benih. Hal ini disebabkan karena transmisi t ransgen yang relatif rendah, sehingga individu t ransgenik yang t erdist ribusi pada po pulasi t ransgenik memiliki persent ase yang kecil. Selain it u, p e n g am b ila n sam p e l yan g d ilak u kan s e cara acak m e m un gkin kan t ran sge n ik h an ya t e rd e t e ksi p ad a be nih bukan pada lar va dan ju ga sebaliknya dap at t erdet eksi hanya pada lar va t api t idak t erdet eksi di benih kerena individu yang diperiksa dalam po pulasi b e r b e d a . Se m e n t a r a it u , h a s il ya n g k o n s is t e n d it u n ju kk a n p a d a p o p u la si F 2 B# 1 , F 2 SA# 2 , d a n
Re n d ah n ya t ran s m isi t ra n sge n p a d a ikan m as t ra n s ge n ik F-2 ke m u n gk in an d ise b a b kan kare n a t ran sgen yang t erint ro duksi pad a induk t ransgenik F-1 memiliki jumlah ko pi yang sedikit , t erdist ribusi mo saik pada jaringan t ermasuk sel go nad, dan t idak t erint egrasi pada geno m. Maclean (1998) menyat akan b a h w a t r a n s g e n a ka n s u lit at a u t id a k m u n g k in dit ransmisikan pada generasi berikut nya jika sel-sel germinal ikan t ransgenik hanya membawa sedikit dan atau bahkan t idak membawa t ransgen. Ikan t ransgenik ya n g t id a k m e n t r a n s m is ik a n t r a n s g e n p a d a ket urunannya mengindikasikan bahwa t ransgen t idak t erint egrasi pada sel-sel germinal. Secara t eo ri, jika sem ua se l-sel ge rminal ikan t ran sge nik m e mb awa Co p yright @ 2 016 , Jurnal Rise t Akuakultu r, p -ISSN 190 7-67 54, e-ISSN 25 02-6534
301
. Berdasarkan uji t ant ang dengan met o de dan ko n disi yang relat if sama, ikan mas t ransge nik F-1 memiliki sint asan sebesar 85,56% dan founder memiliki sint asan sebesar 98,89% (Gambar 3).
500 bp 300 bp A
M + 1 2 3 4 5 500 bp M + 1 2 3 4 5 300 bp
Figure 2. Det ect ion of t ransgene (krt -GP11) of j uvenile F-2 t ransgenic common carp; A) F 2 B# 1 popula- t ion and B) F B# 2 populat ion; M = DNA marker; (+ )= posit ive cont rol of plasmid; 1-5= j uvenile samples of F-2 t ransgenic common carp
1 2 + M 3 4 5 480 bp Gambar 2. Det eksi t ransgen (krt -GP11) pada benih ikan mas t ransgenik F-2; A) po pulasi F 2 B# 1 dan B) po pulasi F 2 B# 2; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if plasmid; 1-5= sampel benih ikan mas t ransgenik F-2
1
Figure 1. Det ect ion of t ransgene (krt -GP11) in five larvae of populat ions F-2 t ransgenic com-
mon carp; M = DNA marker; (+ )= posit ive cont rol of plasmid; 1= F
2 B# 1; 2= F 2 B# 2; 3 = F 2 SA# 1; 4= F 2 SA# 2; and 5= F 2 SA# 1F 2 SA# 1; 4= F 2 SA# 2; dan 5= F 2 SA# 1
Gambar 1. Det eksi t ransgen (krt -GP11) pada lima po pulasi lar va ikan mas t ransgenik F 2 ; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if plasmid; 1= F 2 B# 1; 2= F 2 B# 2; 3=
Hasil p e ne lit ian in i me n un ju kkan bahwa selain t ransgen dapat diwariskan, perfo rma ket ahanan ikan mas t ran sgenik t erh adap KHV juga d iwariskan d ari F-1 ke generasi F-2. Beb erapa hasil p ene lit ian lain menyebutkan bahwa karakter ketahanan penyakit pada
founder
Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 297-305
., 2015). Ikan mas t ransgenik F-2 yang d it a n t a n g d e n ga n KHV s e la m a 1 4 h ar i m e m ilik i sin t asan 9 0 %. Pe rfo rm a ke t ah an an KHV ikan m as t ransgenik F-2 lebih baik dibandingkan dengan F 1 dan sedikit lebih rendah dibandingkan dengan generasi
et al
(P> 0 ,0 5 ). Ikan p e m b an din g m e ru p akan ikan m as Rajadanu dan Majalaya yang membawa marka Cyca- DAB1 *0 5 t e rkait ke t ah anan t e rh ad ap in fe ksi KHV (Ariyant o
Berdasarkan hasil uji t ant ang, ikan mas t ransgenik F-2 me miliki ket ahanan t e rh ad ap KHV yang relat if t inggi meskipun t idak lebih baik dibandingkan dengan ikan pembanding atau no n-transgenik. Secara st at istik, t ingkat ket ahanan ikan mas t ransgenik F-2 t erhadap KHV t idak berbeda signifikan dengan ikan pembanding
Uji Tant ang
gene report er .
Maclean (1998) menambahkan bahwa ident ifikasi ikan t ransgenik akan sulit dilakukan pada po pulasi dengan p e r s e n t a s e t r a n s g e n ik ya n g r e la t if k e cil d a n t erdist ribusi mo saik, kecuali pada po pulasi t ersebut menggunakan penanda yang mudah didet eksi sepert i
et al ., 2 0 0 7 ).
t ransgen (tidak terdistribusi mosaik) dan ikan t ersebut dikawinkan dengan non-transgenik akan menghasilkan 5 0 % an akan t ran sge n ik (Figu e ire d o
B Co p yright @ 2 016, Ju rnal Riset Aku aku ltur, p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Transmisi gen krt -GP11 dan performa ket ahanan ikan mas ..... (Khairul Syahput ra)
ik an t ran sg e n ik d a p at d iw arisk an p a d a ge n e ra si berikutnya. Chio u
Hari p engujian (
80
90 100
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14
S in ta sa n ( S u rv iv a l ra te ) (% )
Days in t est
60
)
Rajad anu Mant ap Transgenik (Transgenic)
Rajadanu Mantap
Transgenik
Transgenic Rajadanu Mantap
Transgenik ( Transgenic
)
Gambar 4. Det eksi marka Cyca-DAB1*05 pada ikan mas t ransgenik F-2; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if m arka Cyca-DAB1*05; (-)= ko nt ro l ne gat if; 1-13 = sampe l ikan m as t ransgenik F-2
Figure 4. Det ect ion of Cyca-DAB1*05 marker in F-2 t ransgenic common carp; M = DNA marker; (+ )=
posit ive cont rol of Cyca-DAB1*05 marker; (-)= negative control; 1-13= sample of F-2 t ransgenic common carpM - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 + 100 bp 500 bp 300 bp
70
50
et al
. (20 09) dan Alimud din
. (2014) melapo rkan bahwa pada ik a n t r a n s g e n ik r a in b o w t r o u t t e t a p m e m ilik i ket ahanan t erhadap infeksi IHNV dan
Aeromonas sp.
p ad a g e n e ra s i F-2 d a n F-3 (Ch io u et al ., 2 0 1 4 ). Penelit ian lainnya juga dilapo rkan o leh Sarmasik
et al .
(2 00 2), ikan med aka t ransgen ik p ada gen erasi F-2 memiliki resist ensi t erhadap infeksi bakteri Pseudomo-
nas
dan
Vibrio .
Selain t ransgen krt -GP11, keberadaan marka Cyca- DAB1 *0 5 ju ga be rpe ran p ada ke t ah anan ikan mas t ra n sg e n ik F-2 t e r h a d ap in fe k si KHV s e la m a u ji t ant ang. Hasil uji PCR menunjukkan bahwa 92% (46/ 5 0 ) d ari p o p u lasi ikan mas t ran sge nik F-2 p o sit if membawa marka Cyca-DAB1*05 (Gambar 4). Rakus
et al
et al
S in ta sa n ( S u rv iv a l ra te ) (% )
. (20 11) me nyat akan b a h w a m a r k a Cyca -DAB1 *0 5 m e r u p a k a n m a r k a mo lekuler ketahanan terhadap penyakit KHV pada ikan mas. Persent ase keberadaan marka Cyca-DAB1*05 yang t inggi p ad a po pulasi ikan m as b erko relasi de ngan ket ahanan t erhadap infeksi KHV. Sucipt o
et al
. (2014) melapo rkan bahwa 83,33% populasi ikan mas Majalaya t ahan KHV (MANTAP) membawa marka Cyca-DAB1*05 dan memiliki sint asan uji t ant ang yang t inggi yait u 100%. Ariyant o et al . (2015) menambahkan, po pulasi ikan m as Rajad an u t ah an in fe ksi KHV yan g 1 0 0 % m e m b a w a m a r ka t e rs e b u t m e m iliki s in t as a n u ji t ant ang sebesar 95%.
Berdasarkan hasil pemeriksaan KHV pada ikan uji yan g mat i set elah uji t ant ang me nunjukkan bahwa kemat ian ikan uji selama uji t ant ang disebabkan o leh infeksi KHV. Se mu a ikan u ji po sit if t erinfeksi KHV berdasarkan analisis PCR (Gambar 5). Hasil pengujian ini juga m enunjukkan bahwa ikan uji yang m ampu
Gambar 3. Sint asan (A) dan sint asan harian kumulat if (B) ikan uji hasil uji t ant ang dengan KHV. Sint asan ikan uji t idak berbeda secara signifikan (P> 0,05) (Bar merupakan st andar deviasi (n= 3)
Figure 3. Survival rat e (A) and cumulat ive daily survival rat e (B) of t est fish aft er KHV challenge t est . Survival
rat es of t est fish were not significant ly different (P> 0.05) (Bars are st andard deviat ion (n= 3))20
40
60
80 100
300 bp
Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 297-305
M + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 500 bp 290 bp 300 bp
100 bp Gambar 5. Det eksi KHV pada ikan mas t ransgenik F-2 dan no n-t ransgenik (Majalaya) yang mat i set elah uji t ant ang KHV; M= marker DNA; (+ )= ko nt ro l po sit if KHV; (-)= ko nt ro l negat if; 1-4= t ransgenik; 5-9= no n-t ransgenik
Figure 5. KHV det ect ion in dead fish of F-2 t ransgenic common carp and non-t ransgenic (M aj alaya)
aft er KHV challenge t est ; M = DNA marker ; (+ )= posit ive cont rol of KHV; (-)= negat ive cont rol; 1-4= t ransgenic; 5-9= non-t ransgenicbert ahan hidup merupakan ikan mas yang memiliki tant ang sebesar 90%. Keberadaan marka Cyca-DAB1*05 ket ahanan t erhadap infeksi KHV. be rpe ran t e rh adap ket ahan an ikan m as t ransgen ik t e r h a d a p in fe k s i KHV s e la in t r a n s g e n ya n g
Paramet er lain yang mendukung pada uji t ant ang dint ro duksikan. KHV juga diamat i pada penelit ian ini meliput i gejala klinis dan suhu air pengujian. Berdasarkan pengamat an
UCAPAN TERIM A KASIH
gejala klinis pada ikan uji selama uji t ant ang, ikan uji Penelit ian ini dibiayai o leh Anggaran Pendapat an yang po sit if KHV dari hasil analisis PCR menunjukkan dan Belanja Negara (APBN) melalui DIPA Tahun Anggaran gejala klinis ikan mas t erinfeksi KHV. Gejala klinis yang 2015 di Balai Penelit ian Pemuliaan Ikan, Sukamandi. t eramat i pada ikan sakit dan mat i meliput i respo ns
Terima kasih disampaikan kepada semua t eknisi yang ikan uji t erhadap pakan berkurang, ikan lemah, dan t elah membant u dalam kegiat an penelit ian ini. Terima gerakan lamban, dapat bergerak sangat akt if, sering kasih juga disampaikan kepada dewan redaksi unt uk naik ke permukaan air, insang pucat memut ih dengan se m u a sa ra n , m as u k an , d a n p e rb aika n t e rh ad ap banyak lendir, kulit memar, dan melepuh. Gejala klinis makalah ini. yang t eramat i pada penelit ian ini sama sepert i yang
et al et al
dilapo rkan o leh Gray . (2002), Sano . (2005),
DAFTAR ACUAN et al dan Sunart o . (2005).
Alimuddin, Mubinun, Sant ika, A., Charman, O., Faizal, Suhu air yang terukur selama pengujian berada pada
I., & Sumant adinat a, K. (2011). Ident ificat io n o f kisaran yang permisif bagi perkembangan KHV yait u Majalaya co mmo n carp st rains resist ant t o KHV
et al
b e rkisar an t ar a 2 0 °C-2 2 °C. He d rick . (2 0 0 0 ), infect io n using Cyca-DAB1*05 allele as t he marker.
et al et al
Haenen . (2004), dan Sano . (2004) melaporkan
Indonesian Aquacult ure Journal , 6(2), 157-163.
b a h w a s u h u o p t im a l p e r k e m b a n g a n KHV ya n g Anderso n, E.D., Mo urich, D.V., & Leo ng, J.C. (1996). menyebabkan kemat ian pada ikan mas berkisar antara
Ge n e t ic im m u n iz a t io n o f r a in b o w t r o u t
et al
16°C-25°C. Gillad . (2003) menambahkan bahwa
Oncorhynchus mykiss
( ) against infect io us hemat o - KHV dapat t umbuh pada kisaran suhu 15°C-25°C, suhu
M ol. M ar. Biol. Biot echnol
po iet ic necro sis virus. ., o pt imal bagi perkembangan KHV pada kisaran suhu 5, 114–22. 2 0 °C-2 5 °C ya n g m e n ye b a b k a n k e m a t ia n a t a u Ariyan t o , D., Syahp ut ra K., & Him awan , Y. (20 1 5). mo rt alit as pada ikan mas hingga 90%-95%.
Naskah akademik pelepasan variet as unggul ikan
m as Rajad an u t ah an p en yakit ko i h e rp e sviru s (KHV). Balai Penelit ian Pemuliaan Ikan. Sukamandi,
Transmisi gen krt -GP11 pada ikan mas t ransgenik 90 hlm (Unpublish). ket urunan F-2 relat if rendah yait u berkisar 0%-2%. Ikan
Chio u, P.P., Che n , M.J., Lin , Ch un -Me an ., Kh o o , J., m as t ran sge n ik F-2 m e m iliki ke t ah an an t erh ad ap Larso n, J., Ho lt , R., Leo ng, Jo -An n., Tho rgarrd , in feksi KHV yang re lat if t inggi dengan sin t asan u ji
Co p yright @ 2 016 , Jurnal Rise t Akuakultu r, p -ISSN 190 7-67 54, e-ISSN 25 02-6534
303 Co p yright @ 2 016, Ju rnal Riset Aku aku ltur, p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Transmisi gen krt -GP11 dan performa ket ahanan ikan mas ..... (Khairul Syahput ra)
G., & Chen , T.T. (2014). Pro d uct io n o f ho m o zy- go us t ransgenic rainbo w t ro ut wit h enhanced dis- ease resist ance.
Miwa, S., & Iida, T. (2004). First det ect io n o f ko i he rpesviru s in cu lt ured co mm o n carp (
LaPat ra, S.E., Co rbeil, S., Jo nes, G.J., Shewmaker, W.D., Lo renzen, N., & Kurat h, G. (2001). Pro t ect io n o f rain bo w t ro ut against infect io us he mat ip o iet ic ne cro sis virus fo ur days aft e r spe cific o r sem i- specific DNA vaccinat io n.
Vaccine , 19, 4011-4019.
Lu, Y., & Sun, P.S. (2005). Viral resist ance in shrimp t hat express an ant isense Taura syndro me virus co at pro t ein gene. Ant iviral Res ., 67, 141–146. Macle an, N. (19 98). Regulat io n and explo it at io n o f t ransgenes in fish.
M ut at Res ., 399, 255-266.
Pusat Pen ge mb an gan Ikan Mas Nasio nal [(PPIMN].
(2 01 2). Pro t o ko l p em uliaan ikan mas (
Cyprinus carpio ). Sukabumi, 44 hlm (Unpublish).
Raku s, K.L., Wiege rt je s, G.F., Ad ame k, M., Siwicki, A.K., Lepa, A., & Irnazaro w, I. (2009). Resist ance o f co mmo n carp (
Cyprinus carpio
L.) t o Cyprinid herpesvirus-3 is in flue nced by majo r hist o co m- pat ibilit y (MH) class II B gene po lymo rphism.
Fish & Shellfish Immunology
, 26, 737-743. Sano , M., It o , T., Ku rit a, J., Yan ai, T., Wat anabe, N.,
carpio ) in Japan.
) o ver-expressing gro wt h ho rmo ne sho w reduced ammo nia excret io n.
Fish Pat hol ., 39, 165-167.
Sano , M., It o , T., Kurit a, J., Miwa, S., & Iida, T. (2005).
Diagn o sis o f Ko i Herp esviru s (KHV) disease in Japan.
Bull. Fish. Res. Agen. Supplement , 2, 59-64.
Sarmasik. A., Warr, G., & Chen, T.T. (2002). Pro duc- t io n o f t ransgenic medaka wit h increased resis- t an ce t o bact erial p at h o ge n s.
M ar. Biot echnol
., 4, 310–22. Sucipt o , A., Faridah, N., Mundayana, Y., Haniyant i, D.,
Santika, A., Mawardi, M., Handayani, D.I., Prayo ga, T., Pur want o , J., Juanda, T., & Dimyat i, A. (2014). Nas k a h a k ad e m ik ik a n m a s (
Cypr i nus car pi o
) Majalaya t ahan p enyakit . Balai Be sar Perikan an Budidaya Air Tawar. Sukabumi, 38 hlm (Unpublish).
Sunart o , A., Rukyani, A., & It ami, T. (2005). Indo ne- sian experience o n t he o ut break o f Ko i Herpes Virus in ko i and carp (
Cyprinus carpio ).
Aquacult ure , 270, 427-435.
Oreochromis nilot icus
M ar. Biot echnol ., 16, 299-308.
Gra y, W.L., Mu llis, L., LaPa t ra S.E., Gro ff, J.M., & Go o dwin, A. (2002). Det ect io n o f ko i h erpesvi- rus DNA in t issues o f infect ed fish.
De vlin , R.H., Ye saki, T.Y., Do n aldso n , E.M., & He w, Choy-Leo ng. (1995). Transmissio n and pheno t ypic effect s o f an ant ifreeze/GH gene co nst ruct in co ho salmo n ( Onchorhynchus kisut ch ). Aquacult ure , 137, 161-169.
Dunham, R.A., Warr, G., Nicho ls, A., Duncan, P.L., Ar- gue, B., & Middlet o n, D. (2002). Enhanced bact e- rial disease resistance o f transgenic channel catûsh (
Ict alarus punct at us ), po ssessing cecro pin genes. M ar. Biot echnol ., 4, 338–344.
Dunham, R.A. (2009). Transgenic fish resist ant t o in- fect io us diseases, t heir risk and prevent io n o f es- cape int o t he enviro nment and fut ure candidat e genes fo r disease t ransgene manipulat io n.
Com- par at ive Immunology, M icrobiology and Infect ious Diseases , 2, 139-161.
Emmenegger, E.J., & Kurat h, G. (2008). DNA vaccine p r o t e ct s o rn am e n t al ko i ( Cypr inus car pi o koi ) against No rt h Am erican sp ring virem ia o f carp virus.
Vaccine , 26, 6415-6421.
Figueiredo , M.de.A., Lanes, C.F.C., Alme ida, D.V., & Marins, L.F. (2007). Impro ving t he pro duct io n o f t ransgenic fish germlines:
In vivo
evaluat io n of mo - saicism in ze brafish ( Danio rerio ) using a gre en fluo resncent pro t ein (GFP) and gro wt h ho rmo ne cDNA t ransgene co -inject io n st rat egy.
Genet ic and M olecular Biology , 30(1), 31-36.
Gillad , O., Yu n, S., Adkiso n, M.A., Way, K., Willit s, N.H., Berco vier, H., & Hedrick, R.P. (200 3). Mo - lecular co mpariso n o f iso lat es o f an emerging fish pat ho gen, ko i herpesvirus, and t he effect o f wa- t er t emp erat u re o n mo rt alit y o f e xperiment ally infect ed ko i. Journal of General Virology , 84, 2661– 2668.
Journal of Fish Diseases
(2007). Transgenic nile tilapia (
, 25, 171-178. Haenen, O.L.M., Way, K., Bergmann, S.M., & Ariel, E.
(2004). The emergence o f ko i herpesvirus and it s significance t o Eu ro p ean aq uacu lt u re. Bull. Eur.
Assoc. Fish Pat hol ., 24, 293–307.
Hed rick, R.P., Gilad , O., Yun , S., Spange nb erg, J.V., Ma r t y, G.D., No rd h a u se n , R.W., Ke b u s , M.J., Be rco vie r, H., & Eldar, A. (2 00 0). A h erpe svirus asso ciat e d wit h mass mo rt alit y o f juvenile and adult ko i, a st rain o f co mmo n carp. J. Aquat . Anim.
Healt h , 12, 44–57.
Kanello s, T., Sylvest er, I.D., D’Mello , F., Ho r ward, C.R., Mackie, A., Dixo n, P.F., Chang, K.C., Ramst ad, A.,
Midlying, P.J., & Russel, P.H. (2006). DNA vaccina- t ion can pro t ect
Cyprinus carpio
against spring vire- mia o f carp virus.
Vaccine , 24, 4927-4933.
Kim, H.C., Jo hnso n, M.C., Drennan, J.D., Simo n, B.E., Tho m an n , E., & Le o n g, Jo -An n.C. (20 0 0 ). DNA vaccines enco ding viral glyco pro t eins induce no n- spe cific im mu nit y and m x p ro t e in syn t h esis in fish.
Journal of Virology , 74(15), 7048-7054.
Ko bayashi, Snin-ichiro , Alimuddin., Mo rit a, T., Miwa, M., Lu, J., Endo , M., Takeuchi, T., & Yo shizaki, G.
Bull. Fish. Res. Agen. Supplement , 2, 15-21. Co p yright @ 2 016 , Jurnal Rise t Akuakultu r, p -ISSN 190 7-67 54, e-ISSN 25 02-6534
305
infect io n and enhanced ph- ago cyt ic act ivit ies in human lact o ferrin-t ransgenic grass carp ( Ct enopharyngodon idellus ). Aquacult ure , 242, 93-103.
Cyprinus carpio ).