Karakterisasi Enzim Kitinase dari Bacillus sp. BK17, Isolat Potensial Pengendali Hayati Jamur Patogen Tanaman

Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian
Isolat mikroba dan persiapan kultur bakteri

Produksi enzim kitinase

Ekstrak kasar enzim

Presipitasi enzim dengan amonium sulfat

Dialisis

Pengukuran aktivitas kitinase dan penentuan kadar protein dari Bacillus sp. BK17

Karakterisasi kitinase Bacillus sp. BK17 berdasarkan:
1. pH
2. Suhu
3. Kinetika enzim
4. Penentuan aktivitas enzim kitinase Bacillus sp. BK17
dengan substrat ekstrak jamur

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 2. Pembuatan Konsentrasi N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc)
N-acetyl-D-glukosamin 1 mg + 1 ml air
Vortex
1000 L = 1000 g/ 1 ml
Konsentrasi

H2O (μl)

l

(μl)

Absorbansi
Ulangan 1

0

1000

0

10

950

50

20

900

100

30

850

150

40

800

200

Total

Ulangan 2

dihomogenkan
ditambahkan masing-masing 1000 l (1 ml) larutan Schales
dihomogenkan
dididihkan pada suhu 100 ˚C selama 10 menit
didinginkan
diukur
Konsentrasi

H2O (μl)

l

= 420 nm
(μl)

Absorbansi
Ulangan 1

Ulangan 2

Total

0

1000

0

0,662

0,661

0,6615

10

950

50

0,562

0,575

0,5685

20

900

100

0,492

0,534

0,513

Universitas Sumatera Utara

30

850

150

0,447

0,471

0,459

40

800

200

0,346

0,384

0,365

Gambar 8. Kurva Standar N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc)

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3. Persamaan Lineawer-Burk

Persamaan Lineawer-Burk=
1/Vmaks

=

Vmaks ( g/ml detik) =

0.0029X + 0.0063
0,0063
158,7301587

Km/Vmaks

=

0,0029

Km

=

0,4603

Kemiringan

=

1/= 0, 1/V
1/Km
(-)1/ Km, 1/V

0,0029
0, 0.0029

=
=0

2,172413793
(-)0.4603,0

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 4. Penentuan Standar Bovin Serum Albumin

BSA µgram

Absorbansi terkoreksi

0

0

20

0,1355

40

0,2065

60

0,302

80

0,376

100

0,4465

Gambar 9. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 5. Komposisi Medium
5. 1 Medium Garam Minimum Kitin (MGMK) Agar
KH2PO4

0,3 g

K2HPO4

0,7 g

Mg SO4.7H2O

0,5 g

FeSO4.7H2O

0,01 g

ZnSO4

0,001 g

MnCl2

0,001 g

Koloidal Kitin 0,2 % (b/v)

72,7 ml

Agar

20 g

Akuades

1000 ml

pH

7

5. 2 Medium Garam Minimum Kitin (MGMK) Cair
KH2PO4

0,3 g

K2HPO4

0,7 g

Mg SO4.7H2O

0,5 g

FeSO4.7H2O

0,01 g

ZnSO4

0,001 g

MnCl2

0,001 g

Koloidal Kitin 0,2 % (b/v)

72,7 ml

Akuades

1000 ml

pH

7

Cara Pembuatan :
Semua bahan dicampur dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi 1 L.
Diatur pH sampai 7 dengan menambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N. Setelah

Universitas Sumatera Utara

dicapai pH yang diinginkan, medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121˚C
selama 15 menit.

Lampiran 6. Pembuatan Larutan Schales
Potasium Ferisianida

0,25

g

Na2CO3

26,4975 g

Dilarutkan dalam 500 ml akuades

Distirer

Dituang ke dalam botol kaca

Disimpan dalam kulkas

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 7. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997)
Substrat

Sampel Kontrol

Koloidal Kitin 0,3 %

γ00 l

γ00 l

Penyangga fosfat 50 mM 200 l

200 l

100 l

Enzim

0 l

Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit
Keterangan

Kontrol
100 l

Enzim yang setelah dipanaskan selama 10
menit

Dididihkan 10 menit
Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit
Substrat

Sampel Kontrol

Blanko

Campuran enzim diambil

γ00 l

γ00 l

-

Akuades

700 l

700 l

1000 l

Schales

1000 l 1000 l

1000 l

Vortex
Dididihkan pada suhu 100 ᴼC selama 10 menit
Didinginkan
Diukur

= 4β0 nm
Hasil

Universitas Sumatera Utara

Rumus :


Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel – konsentrasi blanko) – (Konsentrasi
kontrol – konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1
: menit X 1 : BM kitinase.





Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (mL)
Total protein : protein (mg/mL) x volume enzim (mL)
Aktivitas spesifik
Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL)
Total protein (mg/mL)
Hasil % = Total aktivitas n
Total aktivitas 0

X 100

Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n
Aktivitas spesifik 0

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 8. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976).

Pereaksi
Akuades
Enzim
Reagen Bradford

Blanko (ml)
0,5
0
0,75

Sampel (ml)
0
0,5
0,75

Divorteks

Campuran diukur pada

5λ5 nm

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 9. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford
A. Larutan Stock Bradford
Comassie Blue G-250
Etanol 95%
H3Po4 88%

70 mg
20 ml
40 ml

Distirer
Disaring dengan kertas saring

B. Pembuatan Reagen Bradford
425 ml akuades
15 ml 95% Etanol
35 ml 88% fosfat
30 ml larutan Stock
Distirer
Disaring dengan kertas saring
Dimasukkan dalam Botol Kaca
Disimpan dalam kulkas

Universitas Sumatera Utara