Penerapan Metode Spektrofotometri Ultraviolet Pada Penetapan Amlodipin Besilat dalam Sediaan Tablet
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Sifat
2.1.1 Sifat Fisikokimia
Rumus Struktur
H3C
H
N
H3CO
O
Cl
NH2
O
O
CH3
O
O
S
O
OH
Rumus molekul
: C20H25ClN2O5, C6H6SO3
Nama Kimia
: 3,5-pyridinedicarboxylic acid,
2-[(2Aminoethoxy)methyl]-4-(o –chlorophenyl)
1,4–dihydro–6–methyl–3–ethyl 5–methyl ester,
Berat Molekul
Pemerian
monobenzensulfonate.
: 567,05
: Serbuk hablur, putih atau hampir putih, tidak atau hampirtidak
berbau.
Kelarutan
: Mudah larut dalam etanol, dalam kloroform, dan
dalam eter, praktis tidak larut dalam air.
Penetapan kadar bahan baku : Dilakukan secara acidimetri
Penetapan kadar tablet
: Dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi, kromatografi gas dan spektrofotometri
ultra violet.
2.1.2 Farmakologi
17
Universitas Sumatera Utara
Hipertensi merupahkan penyakit heterogen yang dapat disebabkan oleh penyakit
spesifik (hipertensi sekunder) atau mekanisme patofisiologi yang tidak diketahui
penyebabnya (hipertensi primer atau ensensial). Pada umumnya kasus hipertensi
sekunder disebabkan oleh penyakit gagal ginjal kronik. Penyebab utama kematian
pada hipertensi adalahkardiovascular, dan gagal ginjal.Kemudian kematian
prematur ada korelasinya dengan meningkatkan tekanan darah (ISFI, 2008).
Berdasarkan struktur kimianya Amlodipin merupakan antagonis kalsium
golongan dihidropiridin (antagonis ion kalsium) yang menghambat influks
(masuknya) ion kalsium melalui membran kedalam otot polos vascular dan
otot.Amlodipin absorpsinya lambat, efeknya lebih lama, waktu paruh plasma 35
sampai 50 jam, serta efek dan kadar dalam plasma meningkat selama 7-10 hari
terapi. Amlodipin menghasilkan vasodilatasi arteri perifer dan dilatasi koroner
yang profil hemodinamiknya.Namum amlodipin menyebabkan takikardia reflex
mungkin karena waktu paruhnya yang lama menyebabkan puncak minimumdalam
konsentrasi plasma (Goodman dan Gilman, 2008).
Efek antihipertensi amlodipin adalah dengan bekerja langsung sebagai
vasodilator arteriperifer yang dapat menyebabkan penurunan resisten vaskular
serta penurunan tekanan darah.Dosis satu kali sehari akan menghasilkan
penurunan tekanan darah yang berlangsung selama 24 jam. Onset kerja amlodipin
adalah perlahan-lahan, sehingga tidak menyebabkan terjadinya hipotensi
akut.Efek antiangina amlodipin adalah melalui dilatasi arteriol perifer sehingga
dapat menurunkan resistensi perifer total (afterload).Karena amlodipin tidak
mempengaruhi frekuensi denyut jantung, pengurangan beban jantung akan
menyebabkan penurunan kebutuhan oksigen miokardial serta kebutuhan energi.
18
Universitas Sumatera Utara
Amlodipin menyebabkan dilatasi arteri baik pada keadaan oksigenisasi normal
maupun keadaan iskemia. Pada pasien angina, dosis amlodipin satu kali sehari
dapat meningkatkan waktu latihan, waktu timbulnya angina, waktutimbulnya
depresi segmen ST dan menurunkan frekuensi seranganangina serta penggunaan
tablet nitrogliserin. Amlodipin tidak menimbulkan perubahan kadar lemak plasma
dan dapat digunakan pada pasien asma, diabetes serta gout (Anonim, 2010).
Amlodipin (derivate dihidropiridin) efektif dalam menurunkan tekanan
darah. Perbedaan hemidinamik diantara penghambatan kanal kalsium bisa
mempengaruhi obat tertentu. Aktivitas reflex simpatis dengan takikardia ringan
akan mempertahankan atau meningkatkan curah jantung (Katzung, 1994).
2.1.3 Efek Samping
Efek samping umum yang dapat ditimbulkan oleh amlodipin diantaranya
pusing, nyeri kepala, rasa panas di muka dan terutama pada derivat-piridin dan
udema pergelangan kaki (akibat vasodilatasi perifer). Umumnya, efek ini bersifat
sementara (Tan dan Raharja, 2002).
2.1.4 Dosis
Hipertensi dan angina variant/stabil 1 dd 5 mg (besilat=benzosulfonat),
maksimum 10 mg (Tan dan Raharja, 2002).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet
19
Universitas Sumatera Utara
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya
tampak,
infra
merah
dan
serapan
atom.Jangkauan
panjang
gelombanguntuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm(Ditjen POM, 1995).
Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah
tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis initransisi terjadi dari π→ π*, yang menyerap pada λ
max kecil dari 200nm (tidak terkonyugasi), misalnya pada >C=< dan –C ≡ C .Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron
πpada orbital molekulnya.Untuk senyawa yang mempunyai system konyugasi,
perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar
(Dachriyanus, 2004).
Gugus fungsi seperti –OH, -NH2, dan –Cl yang memberikan transisi
n→
π* disebut gugus auksokrom. Gugus ini adalah gugus yang tidak dapat menyerap
radiasi ultraviolet-sinar tampak, tetapi apabila gugus ini terikat pada gugus
kromofor mengakibatkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih besar
(efekbatokromik).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri
ultraviolet:
a. Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperolehpanjang
gelombang maksimum, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara
20
Universitas Sumatera Utara
absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada
konsentrasi tertentu.Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan
panjang gelombang maksimum, yaitu:
• Pada panjang gelombang maksimum, kepekaannya juga maksimum karena
pada panjang gelombang maksimum tersebut, perubahan absorbansi untuk
setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.
• Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar
dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
• Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang terjadi pada
pengulangan akan kecil sekali, karena digunakan panjang gelombang
maksimum.
b. Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi
diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi. Bila hukum Lamber-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi
merupakan garis lurus.
c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,6.
Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai absorbansi tersebut,
kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman,
2007)
2.2.1
Hukum Lambert-Beer
21
Universitas Sumatera Utara
Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel
yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan
konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus
terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan :
A= a.b.c g/liter atau A= ε. b. c mol/liter
Dimana: A = serapan
a = absorptivitas
b = ketebalan sel
c = konsentrasi
ε = absorptivitas molar
Jadi dengan Hukum Lambert-Beer konsentrasi dapat dihitung dari
ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini, memberikan serapan larutan 1 %
(b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A = A 11 . b. c
Dimana :
A 11 = absorptivitas spesifik (ml g -1cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
c = konsentrasi senyawa terlarut (g/100ml larutan)
2.2.2
Penggunan Spektrofotometri Ultraviolet
22
Universitas Sumatera Utara
Spektrofotometri ultraviolet digunakan dalam analisis senyawa organik
yaitu:
1. Analisis kualitatif
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi
(panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang terjadi
untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda tidaklah sama sehingga
spektrum absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektrum dapat digunakan
sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif (Rohman dan
Gandjar, 2007).
2. Analisis kuantitatif
Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi tertentu nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan
dasaranalisis kuantitatif.
Konsentrasi larutan analit umumnya 10 sampai 20
µg/ml, tetapi untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada
konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi
ultraviolet-sinar
tampak
dapat
juga
ditentukan
dengan
spektrofotometri
ultraviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya
23
Universitas Sumatera Utara
menjadi kromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi kromofor
(Satiadarma, 2004).
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri ultraviolet dapat dilakukan
dengan metode regresi dan pendekatan
1.
Metode Regresi
Analsis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan
persamaan regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi standar
yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5 rentang
konsentrasi
yang
meningkat
yang
dapat
memberikan
serapan
yang
linier,kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva
kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut.
2.
Metode Penekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan
serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel.
Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan
C=
AsxCb
Ab
dimana As = serapan sampel, Ab = serapan standar, Cb = konsentrasi
standar, dan C = konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983).
2.2.3
Peralatan Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan
penggabungan dari dua fungsi alat yang terdiri dari spektrometer yang
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
24
Universitas Sumatera Utara
fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi (Day dan Underwood, 1999).
Unsur-unsur
terpenting
suatu
spektrofotometer
adalah
sebagai
berikut(Khopkar, 1990):
1. Sumber-sumber lampu; lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada
panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau
lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang
antara 350- 900 nm.
2. Monokromotor:
digunakan
untuk
memperoleh
sumber
sinar
yang
monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma maupun grating. Untuk
mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian.
3. Kuvet: Pada pengukuran di daerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex
dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus
menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini.
Umumnya tebal kuvet adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang
lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi,
tetapi bentuk silinder dapat juga digunakan. Kuvet yang tertutup digunakan
untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa atau gelas hasil leburan
yang homogen.
4. Detektor: Peranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap
cahaya pada berbagai panjang gelombang.
5. Suatu amplifier (penguat) dan rangkaian yang berkaitan yang membuat isyarat
listrik dapat diamati.
6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya listrik.
25
Universitas Sumatera Utara
2.3
Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada
prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).Parameter analisis
yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, kespesifikan, limit deteksi,
limit kuantitasi, kelinieran dan rentang.
Akurasi (kecermatan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan
melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode
penambahan bahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi,
sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia) ditambahkan kedalam
campuran bahan sediaan farmasi (plasebo), lalu campuran tersebut dianalisis dan
hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar
sebenarnya). Dalam metode adisi (penambahan bahan baku), sampel dianalisis
lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan kedalam sampel,
dicampur dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar
yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen
perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan
hasil yang sebenarnya.
% PerolehanKembali =
A− B
x100%
C
Keterangan : A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahanbaku
B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan baku
C = Konsentrasi baku yang ditambahkan
26
Universitas Sumatera Utara
Presisi (keseksamaan) adalah derajat kesesuain diantara masing-masing
hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan
yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi
standar atau deviasi standar relative (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan
pula
sebagai
derajat
reprodusibilitas
(ketertiruan)
atau
repeatabilitas
(keterulangan).
Batas deteksi adalah nilai parameter, yaitu konsentrasi analit terendah
yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blanko. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Batas deteksi =
3 xSB
Slope
Batas kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang masih
dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan memenuhi kriteria cermat
dan seksama.
Batas Kuantitasi =
10 xSB
Slope
Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan
bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara secara matematika,
proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang
konsentrasi tertentu.
Rentang suatu metode analisis adalah interval antara batas konsentrasi
tertinggi dan konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan presisi,
akurasi dan kelinieran (Satiadarma, 2004; WHO, 1992)
27
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Sifat
2.1.1 Sifat Fisikokimia
Rumus Struktur
H3C
H
N
H3CO
O
Cl
NH2
O
O
CH3
O
O
S
O
OH
Rumus molekul
: C20H25ClN2O5, C6H6SO3
Nama Kimia
: 3,5-pyridinedicarboxylic acid,
2-[(2Aminoethoxy)methyl]-4-(o –chlorophenyl)
1,4–dihydro–6–methyl–3–ethyl 5–methyl ester,
Berat Molekul
Pemerian
monobenzensulfonate.
: 567,05
: Serbuk hablur, putih atau hampir putih, tidak atau hampirtidak
berbau.
Kelarutan
: Mudah larut dalam etanol, dalam kloroform, dan
dalam eter, praktis tidak larut dalam air.
Penetapan kadar bahan baku : Dilakukan secara acidimetri
Penetapan kadar tablet
: Dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi, kromatografi gas dan spektrofotometri
ultra violet.
2.1.2 Farmakologi
17
Universitas Sumatera Utara
Hipertensi merupahkan penyakit heterogen yang dapat disebabkan oleh penyakit
spesifik (hipertensi sekunder) atau mekanisme patofisiologi yang tidak diketahui
penyebabnya (hipertensi primer atau ensensial). Pada umumnya kasus hipertensi
sekunder disebabkan oleh penyakit gagal ginjal kronik. Penyebab utama kematian
pada hipertensi adalahkardiovascular, dan gagal ginjal.Kemudian kematian
prematur ada korelasinya dengan meningkatkan tekanan darah (ISFI, 2008).
Berdasarkan struktur kimianya Amlodipin merupakan antagonis kalsium
golongan dihidropiridin (antagonis ion kalsium) yang menghambat influks
(masuknya) ion kalsium melalui membran kedalam otot polos vascular dan
otot.Amlodipin absorpsinya lambat, efeknya lebih lama, waktu paruh plasma 35
sampai 50 jam, serta efek dan kadar dalam plasma meningkat selama 7-10 hari
terapi. Amlodipin menghasilkan vasodilatasi arteri perifer dan dilatasi koroner
yang profil hemodinamiknya.Namum amlodipin menyebabkan takikardia reflex
mungkin karena waktu paruhnya yang lama menyebabkan puncak minimumdalam
konsentrasi plasma (Goodman dan Gilman, 2008).
Efek antihipertensi amlodipin adalah dengan bekerja langsung sebagai
vasodilator arteriperifer yang dapat menyebabkan penurunan resisten vaskular
serta penurunan tekanan darah.Dosis satu kali sehari akan menghasilkan
penurunan tekanan darah yang berlangsung selama 24 jam. Onset kerja amlodipin
adalah perlahan-lahan, sehingga tidak menyebabkan terjadinya hipotensi
akut.Efek antiangina amlodipin adalah melalui dilatasi arteriol perifer sehingga
dapat menurunkan resistensi perifer total (afterload).Karena amlodipin tidak
mempengaruhi frekuensi denyut jantung, pengurangan beban jantung akan
menyebabkan penurunan kebutuhan oksigen miokardial serta kebutuhan energi.
18
Universitas Sumatera Utara
Amlodipin menyebabkan dilatasi arteri baik pada keadaan oksigenisasi normal
maupun keadaan iskemia. Pada pasien angina, dosis amlodipin satu kali sehari
dapat meningkatkan waktu latihan, waktu timbulnya angina, waktutimbulnya
depresi segmen ST dan menurunkan frekuensi seranganangina serta penggunaan
tablet nitrogliserin. Amlodipin tidak menimbulkan perubahan kadar lemak plasma
dan dapat digunakan pada pasien asma, diabetes serta gout (Anonim, 2010).
Amlodipin (derivate dihidropiridin) efektif dalam menurunkan tekanan
darah. Perbedaan hemidinamik diantara penghambatan kanal kalsium bisa
mempengaruhi obat tertentu. Aktivitas reflex simpatis dengan takikardia ringan
akan mempertahankan atau meningkatkan curah jantung (Katzung, 1994).
2.1.3 Efek Samping
Efek samping umum yang dapat ditimbulkan oleh amlodipin diantaranya
pusing, nyeri kepala, rasa panas di muka dan terutama pada derivat-piridin dan
udema pergelangan kaki (akibat vasodilatasi perifer). Umumnya, efek ini bersifat
sementara (Tan dan Raharja, 2002).
2.1.4 Dosis
Hipertensi dan angina variant/stabil 1 dd 5 mg (besilat=benzosulfonat),
maksimum 10 mg (Tan dan Raharja, 2002).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet
19
Universitas Sumatera Utara
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya
tampak,
infra
merah
dan
serapan
atom.Jangkauan
panjang
gelombanguntuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm(Ditjen POM, 1995).
Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah
tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis initransisi terjadi dari π→ π*, yang menyerap pada λ
max kecil dari 200nm (tidak terkonyugasi), misalnya pada >C=< dan –C ≡ C .Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron
πpada orbital molekulnya.Untuk senyawa yang mempunyai system konyugasi,
perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar
(Dachriyanus, 2004).
Gugus fungsi seperti –OH, -NH2, dan –Cl yang memberikan transisi
n→
π* disebut gugus auksokrom. Gugus ini adalah gugus yang tidak dapat menyerap
radiasi ultraviolet-sinar tampak, tetapi apabila gugus ini terikat pada gugus
kromofor mengakibatkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih besar
(efekbatokromik).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri
ultraviolet:
a. Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperolehpanjang
gelombang maksimum, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara
20
Universitas Sumatera Utara
absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada
konsentrasi tertentu.Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan
panjang gelombang maksimum, yaitu:
• Pada panjang gelombang maksimum, kepekaannya juga maksimum karena
pada panjang gelombang maksimum tersebut, perubahan absorbansi untuk
setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.
• Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar
dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
• Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang terjadi pada
pengulangan akan kecil sekali, karena digunakan panjang gelombang
maksimum.
b. Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi
diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi. Bila hukum Lamber-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi
merupakan garis lurus.
c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2-0,6.
Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai absorbansi tersebut,
kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman,
2007)
2.2.1
Hukum Lambert-Beer
21
Universitas Sumatera Utara
Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel
yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan
konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus
terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan :
A= a.b.c g/liter atau A= ε. b. c mol/liter
Dimana: A = serapan
a = absorptivitas
b = ketebalan sel
c = konsentrasi
ε = absorptivitas molar
Jadi dengan Hukum Lambert-Beer konsentrasi dapat dihitung dari
ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini, memberikan serapan larutan 1 %
(b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A = A 11 . b. c
Dimana :
A 11 = absorptivitas spesifik (ml g -1cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
c = konsentrasi senyawa terlarut (g/100ml larutan)
2.2.2
Penggunan Spektrofotometri Ultraviolet
22
Universitas Sumatera Utara
Spektrofotometri ultraviolet digunakan dalam analisis senyawa organik
yaitu:
1. Analisis kualitatif
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi
(panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang terjadi
untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda tidaklah sama sehingga
spektrum absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektrum dapat digunakan
sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif (Rohman dan
Gandjar, 2007).
2. Analisis kuantitatif
Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi tertentu nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan
dasaranalisis kuantitatif.
Konsentrasi larutan analit umumnya 10 sampai 20
µg/ml, tetapi untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada
konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi
ultraviolet-sinar
tampak
dapat
juga
ditentukan
dengan
spektrofotometri
ultraviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya
23
Universitas Sumatera Utara
menjadi kromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi kromofor
(Satiadarma, 2004).
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri ultraviolet dapat dilakukan
dengan metode regresi dan pendekatan
1.
Metode Regresi
Analsis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan
persamaan regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi standar
yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5 rentang
konsentrasi
yang
meningkat
yang
dapat
memberikan
serapan
yang
linier,kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva
kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut.
2.
Metode Penekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan
serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel.
Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan
C=
AsxCb
Ab
dimana As = serapan sampel, Ab = serapan standar, Cb = konsentrasi
standar, dan C = konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983).
2.2.3
Peralatan Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan
penggabungan dari dua fungsi alat yang terdiri dari spektrometer yang
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
24
Universitas Sumatera Utara
fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi (Day dan Underwood, 1999).
Unsur-unsur
terpenting
suatu
spektrofotometer
adalah
sebagai
berikut(Khopkar, 1990):
1. Sumber-sumber lampu; lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada
panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau
lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang
antara 350- 900 nm.
2. Monokromotor:
digunakan
untuk
memperoleh
sumber
sinar
yang
monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma maupun grating. Untuk
mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian.
3. Kuvet: Pada pengukuran di daerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex
dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus
menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini.
Umumnya tebal kuvet adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang
lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi,
tetapi bentuk silinder dapat juga digunakan. Kuvet yang tertutup digunakan
untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa atau gelas hasil leburan
yang homogen.
4. Detektor: Peranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap
cahaya pada berbagai panjang gelombang.
5. Suatu amplifier (penguat) dan rangkaian yang berkaitan yang membuat isyarat
listrik dapat diamati.
6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya listrik.
25
Universitas Sumatera Utara
2.3
Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada
prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).Parameter analisis
yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, kespesifikan, limit deteksi,
limit kuantitasi, kelinieran dan rentang.
Akurasi (kecermatan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan
melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode
penambahan bahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi,
sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia) ditambahkan kedalam
campuran bahan sediaan farmasi (plasebo), lalu campuran tersebut dianalisis dan
hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar
sebenarnya). Dalam metode adisi (penambahan bahan baku), sampel dianalisis
lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan kedalam sampel,
dicampur dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar
yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen
perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan
hasil yang sebenarnya.
% PerolehanKembali =
A− B
x100%
C
Keterangan : A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahanbaku
B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan baku
C = Konsentrasi baku yang ditambahkan
26
Universitas Sumatera Utara
Presisi (keseksamaan) adalah derajat kesesuain diantara masing-masing
hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan
yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi
standar atau deviasi standar relative (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan
pula
sebagai
derajat
reprodusibilitas
(ketertiruan)
atau
repeatabilitas
(keterulangan).
Batas deteksi adalah nilai parameter, yaitu konsentrasi analit terendah
yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blanko. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Batas deteksi =
3 xSB
Slope
Batas kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang masih
dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan memenuhi kriteria cermat
dan seksama.
Batas Kuantitasi =
10 xSB
Slope
Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan
bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara secara matematika,
proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang
konsentrasi tertentu.
Rentang suatu metode analisis adalah interval antara batas konsentrasi
tertinggi dan konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan presisi,
akurasi dan kelinieran (Satiadarma, 2004; WHO, 1992)
27
Universitas Sumatera Utara