Uji Efektifitas Bakteri Kitinolitik Terhadap Penyakit Layu Fusarium Pada Tanaman Bawang Merah
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas
Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dengan ketinggian tempat + 25
meter di atas permukaan laut pada bulan juli 2016 sampai dengan selesai.
Bahan dan Alat
Adapun bahan yang digunakan adalah isolat murni F. oxysporum, isolat
murni bakteri kitinolitik, alkohol 96%, kloroks 5%, kapas, spirtus, cling wrap,
aquades, Media Kitin, Media nutrient agar (Na), Media nutrient broth (NB),
Media Potato Dextrose Agar (PDA), kertas stensil, aluminium foil, methyl blue,
label nama dan bahan yang mendukung lainnya.
Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop
compound, micropipet, batang kaca, cawan petri, pinset, tabung reaksi, inkubator,
timbangan analitik, erlenmeyer, oven, beaker glass, objek glass, autoclave,
bunsen, laminar air flow, coke borer, kulkas, jarum ose, gunting, pisau,
handsprayer, kamera, alat tulis dan alat yang mendukung lainnya.
Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)non Faktorial
dengan perlakuan sebagai berikut:
BK0
= F. oxysporum (Kontrol)
BK1
= Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging A + F. oxysporum
BK2
= Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging B + F. oxysporum
BK3
= Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara A
BK4
= Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara B + F. oxysporum
+ F. oxysporum
11
Universitas Sumatera Utara
BK5
= Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A + F. oxysporum
BK6
= Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B + F. oxysporum
BK7
= Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir A
+ F. oxysporum
BK8
= Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir B
+ F. oxysporum
BK9= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 10% + F. oxysporum
BK10
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 20% + F. oxysporum
BK11
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 30% + F. oxysporum
BK12
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 40% + F. oxysporum
BK13
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 50% + F. oxysporum
BK14= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 10% + F. oxysporum
BK15
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B20%+ F. oxysporum
BK16
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 30% + F. oxysporum
BK17
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B40%+ F. oxysporum
BK18
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B50%+ F. oxysporum
BK19
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 10% + F. oxysporum
BK20
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 20% + F. oxysporum
BK21
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 30% + F. oxysporum
BK22
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 40% + F. oxysporum
BK23
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 50% + F. oxysporum
BK24
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 10%+ F. oxysporum
BK25
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 20%+ F. oxysporum
BK26
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 30%+ F. oxysporum
BK27
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 40% + F. oxysporum
BK28
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 50% + F. oxysporum
12
Universitas Sumatera Utara
BK29
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A10% + F. oxysporum
BK30
= FiltratBakteri Kitinolitik Haranggaol A20% + F. oxysporum
BK31
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 30% + F. oxysporum
BK32
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 40% + F. oxysporum
BK33
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A50% + F. oxysporum
BK34
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B10% + F. oxysporum
BK35
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B 20% + F. oxysporum
BK36
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B30% + F. oxysporum
BK37
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B40% + F. oxysporum
BK38
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B50% + F. oxysporum
BK39
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 10% + F. oxysporum
BK40
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 20% + F. oxysporum
BK41
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 30% + F. oxysporum
BK42
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 40% + F. oxysporum
BK43
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 50% + F. oxysporum
BK44
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 10% + F. oxysporum
BK45
=FiltratBakteri Kitinolitik Samosir B 20% + F. oxysporum
BK46
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 30%+ F. oxysporum
BK47
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 40% + F. oxysporum
BK48
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 50% + F. oxysporum
13
Universitas Sumatera Utara
Jumlah ulangan sebanyak 3, yang diperoleh dari:
≥ 15
t(r-1)
49 (r-1)≥ 15
49r - 49
≥ 15
49r
≥64
r
≥ 1,3
r
≥2
Pelaksaan Penelitian
Isolasi Bakteri Kitinolitik
Eksplorasi bakteri dimulai dengan mencari tanah Tanaman sehat ini dapat
dianggap telah mendapat stimulus dari mikroorganisme dilingkungan akar yang
melindungi akar tanaman dari infeksi patogen. Tanah-tanah dengan fenomena
suppressivitas ini diambil dari perakaran rumpun tanaman bawang merah
secukupnya untuk isolasi mikroorganisme bakalan di laboratorium Penyakit
Tumbuhan Fakultas Pertanian USU.
Untuk isolasi bakteri, di ambil 10 g sampel tanah rizosfer dicampur dengan
100 ml aquades. Kemudian suspensi tanah dikocok selama 30 menit. Setelah
homogen dilakukan pengenceran (10-4) dalam aquades. Kemudian 0,2 ml suspensi
dari pengenceran disebar dengan batang kaca steril ke medium koloid kitin agar
(CCA) dalam cawan petri berdiameter 9 cm. kemudian di inkubasikan selama 2-3
hari. Isolat yang membentuk zona terang dipindahkan ke media pemurnian.
Isolasi F. oxysporum
Isolasi patogen dilakukan dengan tehnik umpan yaitu dengan mensterilkan
terlebih dahulu umbi bawang dengan merendam dalam larutan 1% NaOCl selama
14
Universitas Sumatera Utara
20 menit, kemudian umbi bawang secara aseptik disayat dengan ketebalan 3-4
mm menggunakan pisau steril, sayatan umbi bawang ini diletakkan dalam cawan
petri steril yang telah dialas dengan kertas saring steril yang dilembabkan dengan
air suling steril. Bagian tanaman terinfeksi yang telah mendapat perlakuan
sterilisasi permukaan dengan larutan 1% NaOCl selama 3 menit dan dicuci
dengan air suling steril sebanyak 3 kali, diletakkan di atas kaca slaid mikroskop.
Perlakuan ini diinkubasi tanpa cahaya selama lebih kurang 5 hari pada temperatur
25 – 26ºC dalam media PDA.
Uji Aktifitas Antibiosis Bakteri Kitinolitik di Laboratorium
a. Uji aktififitas antibiosis Bakteri kitinolitik
Isolat bakteri terjaring diuji secara in-vitro kemampuannya menghambat
pertumbuhan F. oxysporum dengan metode pengujian dual kultur. Miselium
kultur F. oxysporum dalam medium PDA di diambil dengan bor gabus diamater 5
mm dari bagian tepi pertumbuhan koloni, diinokulasikan pada medium PDA di
posisi tengah cawan petri diamater 9 cm, bakteri antagonis diinokulasikan pada
petri yang sama di posisi 1 cm dari tepi cawan petri. Bakteri diinokulasikan dalam
bentuk suspensi bakteri dari kultur murni bakteri umur 1 hari dari media kaldu
nutrien (NB). Sebagai kontrol F. oxysporum di inokulasikan pada medium PDA
di tengah cawan petri tanpa jamur antagonis. Zona hambatan yang terbentuk
dianggap sebagai aktifitas antibiosis. Aktifitas antibiosis diukur dari persentase
nisbah diameter koloni F. oxysporum perlakuan antagonis dengan diameter
pertumbuhan koloni kontrol dikali 100%.
15
Universitas Sumatera Utara
b. Antibiosis filtrat kultur bebas sel
Filtrat kultur bakteri kitinolitik di panen dari kultur masing-masing setelah
5 hari dalam biakan media cair kaldu nutrien. Filtrat di panen dan dan
disentrifugasi pada 8.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit, untuk
mendapatkan bebas sel, filtrat kultur disaring menggunakan membran 0,45
Millipore filter. Antibiosis filtrat diuji dalam medium PDA menggunakan cawan
petri 9 cm dengan cara mencampurkan filtrat kedalam medium PDA dengan
perlakuan 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Cakram miselium F. oxysporum diambil
dari tepi koloni kultur aktif dan diinokulasikan tepat di tengah cawan petri.
Perlakuan ini diinkubasi selama 5 hari.
Peubah Amatan
1. Daerah Hambatan (%)
Gambar 1. Metode pengukuran zona hambat bakteri kitinolitik terhadap
koloni jamur; A. Koloni jamur, B. Zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni
jamur, C. Titik tengah jamur diletakkan, D. Koloni bakteri kitinolitik, X. Diameter
koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya, Y. Diameter koloni jamur normal
(Suryanto, 2010)
Pengukuran pertumbuhan Fusarium oxysporum dilakukan dengan cara
mengukur batas akhir pertumbuhan dari fungi patogen pada sumbu X dan batas
akhir pertumbuhan fungi patogen pada sumbu Y (Gambar 1), dilakukan setelah
terjadi penghambatan bakteri kitinase terhadap fungi patogen dengan rumus uji
antagonis�
�−�
�
� = �����
16
Universitas Sumatera Utara
(Suryanto et al., 2011).
2. Pengamatan Struktur Hifa Abnormal
Pengamatan struktur hifa secara mikroskopis dilakukan dengan cara
mengamati ujung miselium pada daerah zona hambat fungi patogen. Abnormalitas
pada pertumbuhan miselium fungi pathogen seperti, pembengkokan ujung
miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium
lisis, dan miselium tumbuh kerdil yang diamati dibawah mikroskop dan dilakukan
dokumentasi (Lorito et al., 1992).
3. Kecepatan Tumbuh
Laju pertumbuhan cendawan diketahui dengan cara mengukur pertambahan
diameter koloni cendawan setiap hari setelah inokulasi (hsi) sampai hari ke-5
(hsi).
Analisis Data
Data berupa hasil pengamatan morfologi serta pertumbuhan hifa abnormal
dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa datakuantitatif daerah
hambatan dilakukan perhitungan statistik analisa varian dengan Uji Duncan
dengan taraf 5 %
17
Universitas Sumatera Utara
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas
Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dengan ketinggian tempat + 25
meter di atas permukaan laut pada bulan juli 2016 sampai dengan selesai.
Bahan dan Alat
Adapun bahan yang digunakan adalah isolat murni F. oxysporum, isolat
murni bakteri kitinolitik, alkohol 96%, kloroks 5%, kapas, spirtus, cling wrap,
aquades, Media Kitin, Media nutrient agar (Na), Media nutrient broth (NB),
Media Potato Dextrose Agar (PDA), kertas stensil, aluminium foil, methyl blue,
label nama dan bahan yang mendukung lainnya.
Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop
compound, micropipet, batang kaca, cawan petri, pinset, tabung reaksi, inkubator,
timbangan analitik, erlenmeyer, oven, beaker glass, objek glass, autoclave,
bunsen, laminar air flow, coke borer, kulkas, jarum ose, gunting, pisau,
handsprayer, kamera, alat tulis dan alat yang mendukung lainnya.
Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)non Faktorial
dengan perlakuan sebagai berikut:
BK0
= F. oxysporum (Kontrol)
BK1
= Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging A + F. oxysporum
BK2
= Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging B + F. oxysporum
BK3
= Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara A
BK4
= Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara B + F. oxysporum
+ F. oxysporum
11
Universitas Sumatera Utara
BK5
= Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A + F. oxysporum
BK6
= Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B + F. oxysporum
BK7
= Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir A
+ F. oxysporum
BK8
= Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir B
+ F. oxysporum
BK9= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 10% + F. oxysporum
BK10
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 20% + F. oxysporum
BK11
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 30% + F. oxysporum
BK12
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 40% + F. oxysporum
BK13
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 50% + F. oxysporum
BK14= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 10% + F. oxysporum
BK15
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B20%+ F. oxysporum
BK16
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 30% + F. oxysporum
BK17
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B40%+ F. oxysporum
BK18
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B50%+ F. oxysporum
BK19
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 10% + F. oxysporum
BK20
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 20% + F. oxysporum
BK21
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 30% + F. oxysporum
BK22
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 40% + F. oxysporum
BK23
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 50% + F. oxysporum
BK24
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 10%+ F. oxysporum
BK25
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 20%+ F. oxysporum
BK26
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 30%+ F. oxysporum
BK27
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 40% + F. oxysporum
BK28
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 50% + F. oxysporum
12
Universitas Sumatera Utara
BK29
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A10% + F. oxysporum
BK30
= FiltratBakteri Kitinolitik Haranggaol A20% + F. oxysporum
BK31
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 30% + F. oxysporum
BK32
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 40% + F. oxysporum
BK33
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A50% + F. oxysporum
BK34
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B10% + F. oxysporum
BK35
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B 20% + F. oxysporum
BK36
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B30% + F. oxysporum
BK37
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B40% + F. oxysporum
BK38
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B50% + F. oxysporum
BK39
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 10% + F. oxysporum
BK40
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 20% + F. oxysporum
BK41
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 30% + F. oxysporum
BK42
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 40% + F. oxysporum
BK43
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 50% + F. oxysporum
BK44
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 10% + F. oxysporum
BK45
=FiltratBakteri Kitinolitik Samosir B 20% + F. oxysporum
BK46
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 30%+ F. oxysporum
BK47
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 40% + F. oxysporum
BK48
= Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 50% + F. oxysporum
13
Universitas Sumatera Utara
Jumlah ulangan sebanyak 3, yang diperoleh dari:
≥ 15
t(r-1)
49 (r-1)≥ 15
49r - 49
≥ 15
49r
≥64
r
≥ 1,3
r
≥2
Pelaksaan Penelitian
Isolasi Bakteri Kitinolitik
Eksplorasi bakteri dimulai dengan mencari tanah Tanaman sehat ini dapat
dianggap telah mendapat stimulus dari mikroorganisme dilingkungan akar yang
melindungi akar tanaman dari infeksi patogen. Tanah-tanah dengan fenomena
suppressivitas ini diambil dari perakaran rumpun tanaman bawang merah
secukupnya untuk isolasi mikroorganisme bakalan di laboratorium Penyakit
Tumbuhan Fakultas Pertanian USU.
Untuk isolasi bakteri, di ambil 10 g sampel tanah rizosfer dicampur dengan
100 ml aquades. Kemudian suspensi tanah dikocok selama 30 menit. Setelah
homogen dilakukan pengenceran (10-4) dalam aquades. Kemudian 0,2 ml suspensi
dari pengenceran disebar dengan batang kaca steril ke medium koloid kitin agar
(CCA) dalam cawan petri berdiameter 9 cm. kemudian di inkubasikan selama 2-3
hari. Isolat yang membentuk zona terang dipindahkan ke media pemurnian.
Isolasi F. oxysporum
Isolasi patogen dilakukan dengan tehnik umpan yaitu dengan mensterilkan
terlebih dahulu umbi bawang dengan merendam dalam larutan 1% NaOCl selama
14
Universitas Sumatera Utara
20 menit, kemudian umbi bawang secara aseptik disayat dengan ketebalan 3-4
mm menggunakan pisau steril, sayatan umbi bawang ini diletakkan dalam cawan
petri steril yang telah dialas dengan kertas saring steril yang dilembabkan dengan
air suling steril. Bagian tanaman terinfeksi yang telah mendapat perlakuan
sterilisasi permukaan dengan larutan 1% NaOCl selama 3 menit dan dicuci
dengan air suling steril sebanyak 3 kali, diletakkan di atas kaca slaid mikroskop.
Perlakuan ini diinkubasi tanpa cahaya selama lebih kurang 5 hari pada temperatur
25 – 26ºC dalam media PDA.
Uji Aktifitas Antibiosis Bakteri Kitinolitik di Laboratorium
a. Uji aktififitas antibiosis Bakteri kitinolitik
Isolat bakteri terjaring diuji secara in-vitro kemampuannya menghambat
pertumbuhan F. oxysporum dengan metode pengujian dual kultur. Miselium
kultur F. oxysporum dalam medium PDA di diambil dengan bor gabus diamater 5
mm dari bagian tepi pertumbuhan koloni, diinokulasikan pada medium PDA di
posisi tengah cawan petri diamater 9 cm, bakteri antagonis diinokulasikan pada
petri yang sama di posisi 1 cm dari tepi cawan petri. Bakteri diinokulasikan dalam
bentuk suspensi bakteri dari kultur murni bakteri umur 1 hari dari media kaldu
nutrien (NB). Sebagai kontrol F. oxysporum di inokulasikan pada medium PDA
di tengah cawan petri tanpa jamur antagonis. Zona hambatan yang terbentuk
dianggap sebagai aktifitas antibiosis. Aktifitas antibiosis diukur dari persentase
nisbah diameter koloni F. oxysporum perlakuan antagonis dengan diameter
pertumbuhan koloni kontrol dikali 100%.
15
Universitas Sumatera Utara
b. Antibiosis filtrat kultur bebas sel
Filtrat kultur bakteri kitinolitik di panen dari kultur masing-masing setelah
5 hari dalam biakan media cair kaldu nutrien. Filtrat di panen dan dan
disentrifugasi pada 8.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit, untuk
mendapatkan bebas sel, filtrat kultur disaring menggunakan membran 0,45
Millipore filter. Antibiosis filtrat diuji dalam medium PDA menggunakan cawan
petri 9 cm dengan cara mencampurkan filtrat kedalam medium PDA dengan
perlakuan 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Cakram miselium F. oxysporum diambil
dari tepi koloni kultur aktif dan diinokulasikan tepat di tengah cawan petri.
Perlakuan ini diinkubasi selama 5 hari.
Peubah Amatan
1. Daerah Hambatan (%)
Gambar 1. Metode pengukuran zona hambat bakteri kitinolitik terhadap
koloni jamur; A. Koloni jamur, B. Zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni
jamur, C. Titik tengah jamur diletakkan, D. Koloni bakteri kitinolitik, X. Diameter
koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya, Y. Diameter koloni jamur normal
(Suryanto, 2010)
Pengukuran pertumbuhan Fusarium oxysporum dilakukan dengan cara
mengukur batas akhir pertumbuhan dari fungi patogen pada sumbu X dan batas
akhir pertumbuhan fungi patogen pada sumbu Y (Gambar 1), dilakukan setelah
terjadi penghambatan bakteri kitinase terhadap fungi patogen dengan rumus uji
antagonis�
�−�
�
� = �����
16
Universitas Sumatera Utara
(Suryanto et al., 2011).
2. Pengamatan Struktur Hifa Abnormal
Pengamatan struktur hifa secara mikroskopis dilakukan dengan cara
mengamati ujung miselium pada daerah zona hambat fungi patogen. Abnormalitas
pada pertumbuhan miselium fungi pathogen seperti, pembengkokan ujung
miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium
lisis, dan miselium tumbuh kerdil yang diamati dibawah mikroskop dan dilakukan
dokumentasi (Lorito et al., 1992).
3. Kecepatan Tumbuh
Laju pertumbuhan cendawan diketahui dengan cara mengukur pertambahan
diameter koloni cendawan setiap hari setelah inokulasi (hsi) sampai hari ke-5
(hsi).
Analisis Data
Data berupa hasil pengamatan morfologi serta pertumbuhan hifa abnormal
dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa datakuantitatif daerah
hambatan dilakukan perhitungan statistik analisa varian dengan Uji Duncan
dengan taraf 5 %
17
Universitas Sumatera Utara