Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Dan Air Daun Bangun-Bangun (Coleus amboinicus Lour) Pada Berbagai Tingkat Petikan Daun Dengan Metode DPPH Chapter III VI
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Januari hingga Mei 2016 di
Laboratorium Teknologi Pangan dan Laboratorium Analisa Kimia Bahan Pangan
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Bahan Penelitian
Bahan utama adalah daun bangun-bangun segardiperoleh dari pasar
tradisional di Medan, Sumatera Utara.
Adapun antioksidan sintesis yang digunakan adalah vitamin C sebagai
kontrol positif, radikal bebas DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhidrazyl) untuk uji
aktivitas antioksidan, n-hexan, metanol, dietil eter dan akuades untuk ekstraksi
senyawa antioksidan serta reagensia untuk analisis proksimat daun bangunbangun seperti NaOH, H 2 SO 4 pekat, K2 SO 4 , dan CuSO 4 .
Alat Penelitian
Pembuatan tepung daun bangun-bangun menggunakan loyang pengering,
oven, blender, dan saringan komersil. Alat untuk ekstraksi meliputi erlenmeyer,
corong kaca, kertas saring (Whatman 41), waterbath, dan corong pisah. Uji
aktivitas antioksidan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS (Genesys 200),
rotari evaporator dan labu ukur. Analisis proksimat yaitu meliputi neraca analitik
(Sartorius), oven (Memmert), tanur, tabung kjeldahl, soxhlet, pendingin balik,
labu didih dan hot plate.
Universitas Sumatera Utara
Metode Penelitian
Kegiatan yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu :
a. Tahap I :Pembuatan tepung daun bangun-bangun. Tahap 1 pada penelitian ini
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial, yaitu : setiap
petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun terdiri dari 3 taraf (P),
yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan analisis proksimat dalam 3 kali ulangan
(kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan kadar serat kasar).
b. Tahap II : Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun. Tahap 2 pada
penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial,
yaitu : setiap petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun terdiri dari
3 taraf (P), yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan analisis rendemen dalam 3 kali ulangan.
c. Tahap III : Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun bangunbangunfraksi eter dan fraksi air. Pada tahap 3, penelitian menggunakan
Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor, yaitu:
Faktor I : Konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter dan air (K) yang
terdiri dari 5 taraf, yaitu :
K 1 = Konsentrasi 10 ppm
K 2 = Konsentrasi 20 ppm
Universitas Sumatera Utara
K 3 = Konsentrasi 40 ppm
K 4 = Konsentrasi 80 ppm
K 5 = Konsentrasi 160 ppm
Faktor II : Petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun yang
(P) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan 3 kali ulangan (Bangun, 2001).
Model Rancangan
Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahap, yaitu :
Tahap 1 : Pembuatan tepung daun bangun-bangun
Tahap 2 : Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Peneltian tahap 1 dan 2 menggunakan model Rancangan Acak Lengkap (RAL)
nonfaktorial dengan model sebagai berikut :
Ŷ ij = µ + α i + ε ij
dimana :
Ŷ ij
: Hasil pengamatan dari faktor P pada taraf ke-i dalam ulangan ke-j
µ
: Efek nilai tengah
αi
: Efek perlakuan ke-i
ε ij
: Efek galat perlakuan ke-i dengan ulangan ke j
Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata dan sangat nyata maka uji
dilanjutkan dengan uji beda rataan menggunakan Least Significant Range (LSR).
Universitas Sumatera Utara
Tahap 3 : Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik fraksi eter dan air. Tahap ini
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktorial dengan model
sebagai berikut:
Ŷ ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk
dimana:
Ŷ ijk
: Hasil pengamatan dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor P pada taraf kej dalam ulangan ke-k
µ
: Efek nilai tengah
αi
: Efek faktor K pada taraf ke-i
βj
: Efek faktor P pada taraf ke-j
(αβ) ij : Efek interaksi faktor K pada taraf ke-i dan faktor P pada taraf ke-j
ε ijk
: Efek galat dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor Ppada taraf ke-j dalam
ulangan ke-k
Apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata maupun sangat nyata maka uji
dilanjutkan dengan uji beda rataan dengan menggunakan uji LSR (Least
Significant Range) (Bangun, 1991).
Pelaksanaan Penelitian
Pembuatan tepung daun bangun-bangun
Daun bangun-bangun disortasi, trimming, dan dicuci. Daun bangun-bangun
diiris untuk mempercepat pengeringan dalam oven. Irisan daun bangun-bangun
disusun di atas loyang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC dalam waktu
48 jam. Irisan kering daun bangun-bangun dihaluskan dengan blender hingga
menjadi bubuk/tepung, diayak dengan ayakan komersil 60 mesh. Dilakukan
pengemasan dengan plastik dalam keadaan tertutup dan diuji komposisi proksimat
Universitas Sumatera Utara
tepung daun bangun-bangun. Skema pembuatan tepung daun bangun-bangun
dapat dilihat pada Gambar 5 (Rusmarilin, 2003).
Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Ekstraksi tepung daun bangun-bangundilakukan untuk memperoleh
ekstrak metanolik. Sebanyak 25 g tepung daun bangun-bangun dimaserasi dalam
pelarut
hexan
150
ml
(maserasi
48
jam),
disaring,
dan
ampasnya
dikeringanginkan. Ampas dimaserasi dengan pelarut methanol, kemudian
disaring, diperoleh filtrat dan dipekatkan dengan rotari evaporator, diperoleh
ekstrak kental metanolik (Kuncahyo dan Sunardi, 2007).
Pembuatanlarutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air
Sebanyak 4 g ekstrak kental metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades
dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter. Digojok selama 30 detik, dan dibiarkan
memisah akibat adanya perbedaan massa jenis antara fraksi eter (lapisan atas) dan
fraksi air (lapisan bawah). Fraksi eter dan air masing-masing dipekatkan dalam
waterbathselama 2 jam dengan suhu 70°C untuk fraksi eter dan 100°C untuk
fraksi air. Masing-masing ekstrak kental metanolik dibuat konsentrasi 10 ppm, 20
ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm, diukur aktivitas antioksidan dengan metode
DPPH. Skema pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun dapat dilihat
pada Gambar 6.
Pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air dapat dilihat pada
Gambar 7 dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm
(Kuncahyo dan Sunardi, 2007).
Universitas Sumatera Utara
Parameter Penelitian
Pengamatan dan pengukuran dilakukan melalui analisis menggunakan alat
di laboratorium (in vitro). Tepung daun bangun-bangun dilakukan analisis
proksimat, yaitu: pengukuran kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak,
dan kadar serat kasar. Ekstrak metanolik daun bangun-bangun dan ekstak
metanolik fraksi eter dan airdihitung rendemen dan diukur absorbansi peredaman
radikal bebas DPPH pada ekstrak metanolik fraksi eter dan air berbagai
konsentrasi dan tingkat petikan.
Kadar air (SNI 01–2891–1992)
Ditimbang sampel sebanyak 1-2 gram pada botol timbang yang telah
diketahui bobotnya.Kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 105°C
selama 3 jam.Didinginkan dalam desikator dan ditimbang, diulangi beberapa kali
hingga diperoleh bobot yang tetap. Prinsipnya dengan menghitung jumlah air
yang menguap saat dipanaskan dalam oven dan dianggap kadar air yang ada pada
bahan. Perhitungannya adalah sebagai berikut :
Kadar air (% bk) =Kehilangan bobot setelah dikeringkan (g)
Bobot setelah dikeringkan (g)
x 100%
Kadar abu (Sudarmadji, et al., 1996)
Penentuan kadar abu cara kering, dengan mengoksidasikan semua zat
dalam bahan pada suhu tinggi 500-6000C. Sampel ditimbang sebanyak 5 g,
dimasukkan dalam cawan porselen dan dibakar dalam tanur.Kemudian zat yang
tersisa di dalam cawan pengabuan ditimbang. Perbandingan bobot zat sisa (abu)
dengan bobot awal sampel (5 g) dinyatakan dalam (%) sebagai kadar abu.
Universitas Sumatera Utara
Kadar abu (%) =
Bobot abu (g) x 100%
Bobot sampel awal (g)
Kadar serat kasar (Apriantono, dkk., 1989)
Sampel sebanyak 2 g yang sudah dikadar lemakkan dimasukkan ke dalam
labu erlenmeyer 300 ml kemudian ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0,325 N.
Hidrolisis dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 105oC. Setelah
didinginkan sampel ditambahkan NaOH 1,25 N sebanyak 50 ml, kemudian
dihidrolisis kembali selama 15 menit. Sampel disaring dengan kertas saring
Whatman No. 41 yang telah dikeringkan dan diketahui beratnya. Kertas saring
tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas lalu 25 ml H 2 SO 4 0,325 N,
kemudian dengan air panas dan terakhir dengan 25 ml etanol 95%. Kertas saring
dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama satu jam, pengeringan dilanjutkan
sampai berat konstan. Kadar serat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Kadar serat kasar (%)
= Berat Kertas Saring + Serat (g) – Berat Kertas saring (g) x
100%
Berat Sampel Awal (g)
Kadar proteincara makro kjeldahl (AOAC, 1995)
Ditimbang sampel yang telah dihaluskansebanyak 0,2 g, dimasukkan ke
dalam labu kjeldahl 30 ml selanjutnya ditambahkan 1,5 ml H 2 SO 4 pekat dan 2 g
katalis (CuSO 4 dan K2 SO 4 ), dan dididihkan selama 2 jam atau sampai berwarna
hijau kebiruan. Labu beserta isinya didinginkan, kemudian isinya dipindahkan ke
dalam alat destilasi dan ditambahkan 15 ml larutan NaOH 40%. Kemudian dibilas
dengan akuades. Erlenmeyer 250 ml berisi H 2 SO 4 0,025 N dan 2–4 tetes indikator
mengsel (campuran metil merah 0,02% dalam alkohol dan metil biru 0,02% dalam
alkohol dengan perbandingan 2:1) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung
kondensor harus terendam dalam labu berisi campuran larutan H 2 SO 4 dengan
Universitas Sumatera Utara
mengsel, kemudian dilakukan destilasi hingga destilat mencapai 125 ml. Ujung
kondensor kemudian dibilas dengan sedikit air destilat dan ditampung dalam
erlenmeyer lalu dititrasi dengan NaOH 0,02 N sampai terjadi perubahan warna
ungu menjadi hijau. Penetapan blanko dilakukan dengan cara yang sama.
Kadar protein = (A-B) x N x 0,014 x 5,18
Bobot Sampel (g)
x 100%
A = ml NaOH untuk tittrasi blankoB = ml NaOH untuk titrasi sampel
N = Normalitas NaOH
Kadar lemak (Metode Soxhlet) (AOAC, 1995)
Dipanaskan labu alas datar 250 ml di dalam oven pada suhu 105oC hingga
didapat bobot tetap kemudian sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu
dimasukkan ke dalam kertas saring. Kertas saring yang berisi sampel diekstrak
dengan 130 ml hexan dengan menggunakan soxhlet selama 5 jam dan labu lemak
dipisahkan dari alat pengekstraksi lalu diuapkan. Labu dikeringkan dalam oven
60oC dan ditimbang sampai bobot tetap. Kemudian dihitung kadar lemak sampel
dengan rumus :
Kadar lemak (%) = Bobot akhir labu lemak (g) - Bobot awal labu lemak (g) x 100%
Bobot sampel (g)
Rendemen (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)
Tepung daun bangun-bangun 25 g dilarutkan dan direndam (maserasi)
dalam pelarut non polar (hexan) 150 ml selama 48 jam.Dilakukan penyaringan,
ampas dikeringkan hingga tidak berbau hexan.Residu dilarutkan dalam metanol
(maserasi 48 jam) kemudian disaring dan filtrat dipekatkan untuk mendapatkan
Universitas Sumatera Utara
ekstrak kental metanolik.Ekstrak kental metanolik dihitung rendemennya dengan
rumus berikut.
Rendemen (%)=
Bobot ekstrak metanolik pekat (g)
Bobot tepung daun bangun-bangun (g)
x 100%
Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades dan
dipartisi dengan 50 ml dietil eter.Dilakukan pemisahan fraksi eter danair.Fraksi
eter dipekatkan dengan waterbathpada suhu 70°Cdan fraksi air pada suhu 100°C
selama2 jam. Ekstrak metanolik fraksi eter dan air hasil pemekatan masingmasing ditimbang dan dihitung rendemen dengan rumus sebagai berikut :
Rendemen (%)= Bobot ekstrak metanolik pekat fraksi eter/air (g) x 100%
Bobot ekstrak metanolik (g)
Uji aktivitas antioksidan fraksi eter dan air (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)
Fraksi air dan eter dibuatlarutan (menggunakan pelarut metanol) dengan 5
konsentrasi berbeda (10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm) sebanyak 4 ml,
ditambahkan radikal bebas DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml dimasukkan dalam vial
dikocok. Didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian dibaca serapan
aktivitasnya pada panjang gelombang 517 nm. Blanko yang digunakan adalah 4
ml metanol dan 1 ml DPPH 0,1 mM. Kontrol positifsebagai pembanding
digunakan antioksidan sintetis BHT dan vitamin C. Nilai absorbansi (Abs.) yang
diperoleh menunjukkan aktivitas antioksidan senyawa uji (% peredaman).Nilai
IC 50 masing-masing dihitiung dengan persamaan regresi.
Peredaman DPPH (%) = 100 (Abs. blanko – Abs. sampel) / Abs. blanko
Universitas Sumatera Utara
IC 50 (Molyneux, 2004)
IC 50 merupakan bilangan yang dapat menunjukkan konsentrasi ekstrak
yang dapat menghambat aktivitas radikal sebesar 50%. Dalam menentukan IC 50
dibutuhkan adanya kurva standar dari % inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi
fraksi antioksidan sebagai sumbu x. IC 50 dihitung dengan cara memasukkan nilai
50% ke dalam persamaan kurva standar sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai
x sebagai konsentrasi IC 50 . Semakin kecil nilai IC 50 menunjukkan semakin tinggi
aktivitas antioksidannya.
Universitas Sumatera Utara
Daun bangun-bangun
Disortasi, trimming, dan dan dicuci
Diiris tipis
Disusun di atas loyang dan keringkan dalam
oven suhu 500C selama 48 jam (sampai kering)
Irisan kering diblender hingga menjadi tepung
Diayak dengan ayakan komersil (60 mesh)
Tepung daun bangun-bangun
Dikemas dengan plastik dalam keadaan tertutup
Analisis proksimat
- Kadar air
- Kadar abu
- Kadar lemak
- Kadar protein
- Kadar serat kasar
Gambar 10. Skema pembuatan tepung daun bangun-bangun
Universitas Sumatera Utara
Maserasi tepung daun bangun-bangun dalam pelarut nhexan (1:6) selama 48 jam
Disaring
Ampas dikeringkan
600C, 30 menit
Maserasi dalam pelarut
metanol (1:6) 48 jam
Disaring
Filtrat metanol
Filtrat/ekstrak methanol dipekatkan menjadi ekstrak kental metanolik yang diletakkan
pada erlenmeyer dengan rotari evaporatorpada suhu 70°C selama 20 menit
Ekstrak metanolik
Penghitungan rendemen
ekstrak metanolik
Gambar 11. Skema pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi
50 ml akuades dan dipartisi 50 ml dietil eter
Rendemen
Digojok selama 30 detik dan dipisahkan
dalam corong pisah
Rendemen
Fraksi eter (lapisan atas), dipekatkan
dalam waterbath selama 2 jam dengan
suhu 70 °C, dan dihitung rendemen
fraksi kental
Fraksi air (lapisanbawah), dipekatkan
dalam waterbath selama 2 jam
dengan suhu 100°C, dan dihitung
rendemen fraksi kental
Dibuat larutan uji fraksi eter
konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm,
80 ppm, 160 ppm
Dibuat larutan uji fraksi air
konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm,
80 ppm, 160 ppm
Analisis: aktivitas antioksidan
(% peredaman radikal bebas DPPH)
dengan kontrol positif vitamin C
Analisis: aktivitas antioksidan
(% peredaman radikal bebas DPPH)
dengan kontrol positif vitamin C
Gambar 12. Skema pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
I : Pembuatan Tepung Daun Bangun-Bangun
Pengeringan dan penepungan daun bangun-bangun dilakukan dengan
tujuan untuk mengurangi kadar air bahan. Kandungan air yang tinggi pada bahan
dapat menghambat proses pemekatan karena titik didih air lebih tinggi daripada
pelarut yang digunakan. Penepungan bertujuan untuk memperbesar luas
permukaan bahan dengan ukuran partikel yang lebih kecil dan seragam, sehingga
ekstraksi pada bahan dapat berlangsung dengan optimum.Hasil analisis proksimat
tepung daun bangun-bangun dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil penelitian yang
dilakukan, diperoleh hasil komposisi kimia tepung daun bangun-bangun yang
memberikan pengaruh terhadap kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak
dan kadar serat kasar.
Tabel 2.Komposisi kimia tepung daun bangun-bangun pada bagian pucuk, tengah
dan bawah.
Petikan I
Petikan II
Petikan III
Parameter
(Pucuk)
(Tengah)
(Bawah)
Kadar air (%bk)
6,24 ±0,34
6,13 ±0,41
6,74 ±0,11
Kadar abu (%bk)
12,89 ±0,05
13,64 ±0,27
14,05 ±0,05
Kadar lemak (%bk)
3,84±0,48
3,81 ±0,13
5,05 ±0,25
Kadar protein (%bk)
4,41 ±0,37
4,89 ± 0,44
4,04 ±0,87
Kadar serat (%bk)
11,23 ± 1,48
12,09 ±0,89
13,29 ± 0,32
Keterangan : Data terdiri dari 3 ulangan ± Standar deviasi
Universitas Sumatera Utara
Kadar air (%bk)
Tabel 2 dapat diketahui bahwa perbedaan tingkat petikan daun bangunbangun memberikan pengaruh berbeda tidak nyata (P>0,05) terhadap kadar air
tepung daun bangun-bangun, sehingga uji LSR tidak dilanjutkan. Dapat dilihat
pada Lampiran 1.
Kadar abu (%bk)
Hasil analisis ragam pada Lampiran 2 dan Tabel 2 dapat dilihat bahwa
tingkat petikan daun bangun-bangun memberikan pengaruh berbeda sangat nyata
(P0,05) terhadap kadar serat
kasar tepung daun bangun-bangun, sehingga uji LSR tidak dilanjutkan. Dapat
dilihat pada Lampiran 5.
Universitas Sumatera Utara
II : Pembuatan Ekstrak Metanolik Daun Bangun-Bangun
Tepung daun bangun-bangun dengan petikan 1 (4 daun dari pucuk),
petikan 2 (4 daun bagian tengah), dan petikan 3 (4 daun bagian bawah) diambil
masing-masing 25 g dilarutkan dalam 150 ml n-hexan, kemudian residu diekstrak
menggunakan pelarut metanol untuk mendapatkan ekstrak metanolik. Ekstrak
metanolik yang dihasilkan kemudian dipekatkan hingga dihasilkan ekstrak
metanolik yang kental
Rendemen (%)
Ekstrak kental metanolik yang dihasilkan, kemudian ditimbang beratnya
dan dilakukan perhitungan rendemen pada semua perlakuan pada setiap tingkat
petikan.Rendemen ekstrak kental metanolik dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Rendemen ekstrak metanolik
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat
serbuk (g)
Berat ekstrak
metanolik (g)
Rendemen
(%)
Rataan ±
standar deviasi
(%)
26,2929
25,2347
25,0929
4,3238
4,3997
4,4668
16,4447
17,4351
17,8010
17,22±0,70
25,0013
26,0161
25,1035
4,5437
4,4764
4,2615
18,1738
17,2062
16,9757
17,45±0,63
26,0144
25,1013
25,2194
4,5119
4,5022
4,6988
17,3438
17,9361
16,9757
17,97±0,64
Tabel 3 dapat diketahui rendemen ekstrak kental metanolik tertinggi
terdapat pada perlakuan bagian bawah, yaitu sebesar 17,97%, sedangkan
rendemen terendah terdapat pada perlakuan bagian pucuk, yaitu sebesar 17,22%.
Lampiran 6 diketahui tingkat petikan memberikan pengaruh berbeda tidak nyata
(P>0,05) terhadap rendemen ekstrak metanolik.
Universitas Sumatera Utara
Ekstrak metanolik yang telah diperoleh selanjutnya disuspensi dengan 50
ml akuades dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter.Larutan tersebut dipisahkan
dengan menggunakan corong pisah menjadi dua bagian fraksi, yaitu fraksi eter
dan fraksi air. Fraksi eter merupakan larutan bagian atas, sedangkan fraksi air
merupakan larutan bagian bawah. Fraksi eter dan fraksi air yang telah diperoleh
kemudian dipekatkan, ditimbang beratnya, dan kemudian dilakukan perhitungan
rendemen.Rendemen fraksi eter dan fraksi air dapat dilihat pada Tabel 4 dan
Tabel 5.
Tabel 4. Rendemen ekstrak metanolik fraksi eter
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat ekstrak
metanolik (g)
Berat fraksi
(g)
Rendemen
(%)
Rataan ± standar
deviasi (%)
4,3238
4,3997
4,4668
0,0290
0,0358
0,0288
0,6707
0,8136
0,6447
0,70±0,09bB
4,5437
4,4764
4,2615
0,0368
0,0384
0,0308
0,8099
0,8578
0,7227
0,79±0,06bB
4,5119
4,5022
4,6988
0,0398
0,0377
0,0388
0,8821
0,8373
0,8257
0,84±0,02aA
Keterangan : notasi huruf yang berbeda menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata pada taraf 5%
dan berbeda sangat nyata 1%
Tabel 4 diketahui rendemen tertinggi fraksi eter terdapat perlakuan pada
petikan ketiga (bagian bawah), yaitu sebesar 0,84%, sedangkan rendemen
terendah terdapat pada perlakuan petikan pertama (bagian pucuk), yaitu sebesar
0,70%. Hasil sidik ragam yang terdapat pada Lampiran 7 diketahui bahwa tingkat
petikan memberikan pengaruh berbeda sangat nyata terhadap rendemen ekstrak
metanolik fraksi eter.
Universitas Sumatera Utara
0,9
0,8
0.7968
0.8484
0.7097
Rendemen (%)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
P1
P2
P3
Petikan
Gambar 15. Hubungan tingkat petikan daun bangun-bangun dengan rendemen
ekstrak metanolik fraksi eter (%)
Gambar 15 dapat kita lihat bahwa rendahnya petikan daun bangun-bangun
dengan rendemen ekstrak metanolik fraksi eter (%) memiliki rendemen yang
paling tinggi pada perlakuan P 3 dan rendemen terendah pada P 1 .Maka semakin
rendah tingkat petikan maka semakin tinggi rendemen yang dimiliki oleh tepung
daun bangun-bangun ekstrak metanolik fraksi eter. Adanya rendemen ekstrak
metanolik fraksi eter meningkat pada P 3 (bagian bawah) dan cenderung menurun
pada P 1 (bagian pucuk) dikarenakan tanaman pada bagian pucuk sampai pada
bagian tengah lebih banyak mengandung komponen bioaktif, sedangkan pada
bagian bawah sudah mulai mengalami adanya proses pelayuan, sehingga
mengakibatkan adanya proses pembentukan metabolit sekunder dalam tanaman
cenderung berkurang (Lintang, dkk., 2014).
Universitas Sumatera Utara
Tabel 5. Rendemen ekstrak metanolik fraksi air
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat ekstrak
metanolik (g)
Berat fraksi
(g)
Rendemen
(%)
Rataan ± standar
deviasi (%)
4,3238
4,3997
4,4668
3,8104
3,0328
3,3055
88,1261
68,9319
74,0015
77,01±9,94
4,5437
4,4764
4,2615
3,2141
3,8041
3,4439
70,7375
84,9812
80,8142
78,84±7,32
4,5119
4,5022
4,6988
3,2266
3,1053
3,5907
71,5131
68,9729
76,4173
72,30±3,78
Tabel 5 dapat dilihat bahwa rendemen tertinggi dari fraksi air terdapat
pada perlakuan P 2 (bagian tengah), yaitu sebesar 78,84% dan terendah terdapat
pada perlakuan P 3 (bagian bawah), yaitu sebesar 72,30%. Lampiran 8 dapat
diketahui bahwa pengaruh tingkat petikan daun bangun-bangun memberikan
pengaruh berbeda tidak nyata terhadap rendemen ekstrak metanolik fraksi air.
Fraksi eter rendemen tertinggi terdapat pada perlakuan P 3 (bagian bawah),
dan pada fraksi air terdapat pada perlakuan P 2 (bagian tengah).Hal tersebut
dikarenakan rendemen ekstrak metanolik tertinggi dihasilkan dari perlakuan P3
(bagian bawah). Adanya rendemen fraksi eter yang jauh lebih rendah daripada
fraksi air, menunjukkan bahwa adanya kandungan senyawa polar yang lebih besar
pada daun bangun-bangun karena pelarut air yang bersifat polar (Kuncahyo dan
Sunardi, 2007), atau adanya senyawa polar dalam ekstrak metanolik daun bangunbangun lebih banyak dibandingkan senyawa yang bersifat semipolar yang dapat
terlarut pada fraksi eter (Lintang, dkk., 2014).
Universitas Sumatera Utara
III: Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanolik Tepung Daun BangunBangun Fraksi Eter dan Air
Adapun ekstrak kental metanolik fraksi eter dan air masing-masing dibuat
larutan uji dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm.
Larutan uji tersebut masing-masing 4 ml ditambahkan dengan radikal bebas yaitu
DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml, kemudian dibaca absorbansinya dengan alat
spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm. Adapun hasil serapan yang
dihasilkan oleh radikal DPPH dapat dinyatakan dengan aktivitas antioksidan (%
peredaman DPPH).Aktivitas antioksidan ekstrak kental metanolik fraksi eter dan
fraksi air dari berbagai tingkat petikan dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Aktivitas antioksidan ekstrak metanolik fraksi eter dan fraksi air
Aktivitas antioksidan (% peredaman DPPH)
Perlakuan
(Petikan)
Konsentrasi
(ppm)
I
(Pucuk)
10
20
40
80
160
10
20
40
80
160
10
20
40
80
160
II
(Tengah)
III
(Bawah)
Fraksi eter
I
38,52
44,55
56,70
67,09
77,48
35,93
42,85
53,24
64,93
74,89
32,90
39,39
50,21
63,20
73,16
II
38,09
43,29
54,11
70,56
80,51
35,06
42,42
51,94
68,83
78,78
30,30
37,22
46,32
60,60
71,86
III
41,55
41,55
54,11
58,44
80,51
35,06
43,72
52,81
57,14
61,90
30,30
37,22
46,32
60,60
71,86
Fraksi air
Rataan
39,39
43,13
54,97
65,36
79,50
35,35
42,99
52,66
63,63
71,86
31,16
37,95
47,61
61,47
72,29
I
39,35
45,80
50,96
60,00
69,03
36,12
42,58
47,74
56,77
65,80
35,48
41,93
47,09
56,12
65,16
II
41,93
48,38
53,54
60,00
74,19
36,77
43,22
50,96
61,29
70,32
35,48
41,93
45,80
56,12
69,03
III
41,93
47,09
53,54
61,29
72,90
40,64
47,09
53,54
61,29
70,32
36,77
43,22
49,67
56,12
69,03
Rataan
41,07
47,09
52,68
60,43
72,04
37,84
44,30
50,75
59,78
68,81
35,91
42,36
47,52
56,12
67,74
Tabel 6 dapat diketahui bahwa ekstrak metanolik daun bangun-bangun
fraksi eter dan fraksi air memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan %
peredaman radikal DPPH.Adapun senyawa antioksidan yang terkandung dalam
daun bangun-bangun yaitu senyawa flavonoid.Menurut Santosa dan Hertiani
(2005) menyatakan bahwa pada ekstrak daun bangun-bangun mengandung
Universitas Sumatera Utara
senyawa flavonoid, glikosida flavonol, polifenol, dan minyak atsiri. Menurut
Sirait (2007), adapun flavonoid sendiri pada umumnya pada tanaman berperan
sebagai glikosida, dan gugusan gula yang terdiri atas satu atau lebih gugus
hidroksil fenolik. Flavonoid pada tanaman terdapat pada daun, buah, sari dan akar.
Golongan flavonoid merupakan flavor yang berperan sebagai antioksidan.
Flavonoid adalah satu dari senyawa alami yang paling beragam dan
merupakan senyawa alami fenol yang sangat penting.Flavonoid merupakan
senyawa yang memiliki spectrum yang luas dalam aktivitas biologi dan kimia
termasuk dalam penghambatan radikal bebas.Senyawa ini memiliki sekitar 9000
jenis struktur senyawa yang telah diidentifikasi.Adapun kelompok utama senyawa
utama flavonoid adalah flavon, isoflavon, flavonol, antosianin, katekin dan
khalkon (Lukitaningsih, 2009).
Gambar 16. Struktur kimia flavonoid (Waji dan Sugrani, 2009)
Menurut Kaliappan (2008), daun bangun-bangun dibuktikan sebagai
antiinflamasi karena dapat menghambat respon inflamasi yang diinduksi oleh
adanya siklooksiginase, dan juga sebagai anti kanker dan anti tumor.Daun
bangun-bangun mengandung jenis flavonoid yaitu quercetin, apigenin, luteolin,
salvigenin dan genkwanin.
Flavonoid sendiri merupakan sumber antioksidan seperti alfa tokoferol,
vitamin dan betakaroten. Menurut Sartika (2013), hampir 80% dari total
Universitas Sumatera Utara
antioksidan dalam buah dan sayuran adalah flavonoid, yang berfungsi sebagai
penangkap anion superoksida, lipid peroksida radikal, oksigen singlet, dan
pengkelat logam. Lintang, dkk., (2014) menyatakan berdasarkan kelarutannya
dalam air. Flavonoid terdiri dari aglikon dan glukosida, dan di alam senyawa ini
dapat ditemukan dalam bentuk 7-O-glukosida.
Surya, dkk., (2013) menyatakan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak daun
bangun-bangun dengan menggunakan empat metode yang berbeda salah satunya
metode DPPH, antara ekstrak methanol dan ekstrak etil asetat dari tanaman daun
bangun-bangun menunjukkan dengan menggunakan pelarut metanol lebih baik
aktivitas antioksidannya dibandingkan dengan menggunakan pelarut etil asetat.
Menurut Kemala (2012) juga menyatakan bahwa aktivitas antioksidan daun
bangun-bangun menggunakan pelarut etil asetat dari ekstrak etanol memiliki
aktivitas toksik yang disebabkan oleh adanya senyawa flavonoid.Penelitian yang
dilakukan oleh Kuncahyo dan Sunardi (2009) terhadap aktivitas antioksidan
belimbing wuluh dengan menggunakan pelarut metanol dengan fraksi eter dan air
memperlihatkan bahwa belimbing wuluh memiliki aktivitas antioksidan.
Pengaruh interaksi antara tingkat petikan daun bangun-bangun dengan
konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter terhadap aktivitas antioksidan (%
peredaman DPPH)
Daftar analisis sidik ragam dari Lampiran 9 dapat diketahui bahwa
konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter dan tingkat petikan daun bangun-bangun
memberikan pengaruh berbeda sangat nyata (P
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Januari hingga Mei 2016 di
Laboratorium Teknologi Pangan dan Laboratorium Analisa Kimia Bahan Pangan
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Bahan Penelitian
Bahan utama adalah daun bangun-bangun segardiperoleh dari pasar
tradisional di Medan, Sumatera Utara.
Adapun antioksidan sintesis yang digunakan adalah vitamin C sebagai
kontrol positif, radikal bebas DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhidrazyl) untuk uji
aktivitas antioksidan, n-hexan, metanol, dietil eter dan akuades untuk ekstraksi
senyawa antioksidan serta reagensia untuk analisis proksimat daun bangunbangun seperti NaOH, H 2 SO 4 pekat, K2 SO 4 , dan CuSO 4 .
Alat Penelitian
Pembuatan tepung daun bangun-bangun menggunakan loyang pengering,
oven, blender, dan saringan komersil. Alat untuk ekstraksi meliputi erlenmeyer,
corong kaca, kertas saring (Whatman 41), waterbath, dan corong pisah. Uji
aktivitas antioksidan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS (Genesys 200),
rotari evaporator dan labu ukur. Analisis proksimat yaitu meliputi neraca analitik
(Sartorius), oven (Memmert), tanur, tabung kjeldahl, soxhlet, pendingin balik,
labu didih dan hot plate.
Universitas Sumatera Utara
Metode Penelitian
Kegiatan yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu :
a. Tahap I :Pembuatan tepung daun bangun-bangun. Tahap 1 pada penelitian ini
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial, yaitu : setiap
petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun terdiri dari 3 taraf (P),
yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan analisis proksimat dalam 3 kali ulangan
(kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan kadar serat kasar).
b. Tahap II : Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun. Tahap 2 pada
penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial,
yaitu : setiap petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun terdiri dari
3 taraf (P), yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan analisis rendemen dalam 3 kali ulangan.
c. Tahap III : Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik daun bangunbangunfraksi eter dan fraksi air. Pada tahap 3, penelitian menggunakan
Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor, yaitu:
Faktor I : Konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter dan air (K) yang
terdiri dari 5 taraf, yaitu :
K 1 = Konsentrasi 10 ppm
K 2 = Konsentrasi 20 ppm
Universitas Sumatera Utara
K 3 = Konsentrasi 40 ppm
K 4 = Konsentrasi 80 ppm
K 5 = Konsentrasi 160 ppm
Faktor II : Petikan dalam satu tangkai dari daun bangun-bangun yang
(P) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu :
P 1 = petikan 1 (4 daun dari pucuk)
P 2 = petikan 2 (4 daun bagian tengah)
P 3 = petikan 3 (4 daun bagian bawah)
Setiap perlakukan dilakukan 3 kali ulangan (Bangun, 2001).
Model Rancangan
Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahap, yaitu :
Tahap 1 : Pembuatan tepung daun bangun-bangun
Tahap 2 : Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Peneltian tahap 1 dan 2 menggunakan model Rancangan Acak Lengkap (RAL)
nonfaktorial dengan model sebagai berikut :
Ŷ ij = µ + α i + ε ij
dimana :
Ŷ ij
: Hasil pengamatan dari faktor P pada taraf ke-i dalam ulangan ke-j
µ
: Efek nilai tengah
αi
: Efek perlakuan ke-i
ε ij
: Efek galat perlakuan ke-i dengan ulangan ke j
Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata dan sangat nyata maka uji
dilanjutkan dengan uji beda rataan menggunakan Least Significant Range (LSR).
Universitas Sumatera Utara
Tahap 3 : Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik fraksi eter dan air. Tahap ini
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktorial dengan model
sebagai berikut:
Ŷ ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk
dimana:
Ŷ ijk
: Hasil pengamatan dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor P pada taraf kej dalam ulangan ke-k
µ
: Efek nilai tengah
αi
: Efek faktor K pada taraf ke-i
βj
: Efek faktor P pada taraf ke-j
(αβ) ij : Efek interaksi faktor K pada taraf ke-i dan faktor P pada taraf ke-j
ε ijk
: Efek galat dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor Ppada taraf ke-j dalam
ulangan ke-k
Apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata maupun sangat nyata maka uji
dilanjutkan dengan uji beda rataan dengan menggunakan uji LSR (Least
Significant Range) (Bangun, 1991).
Pelaksanaan Penelitian
Pembuatan tepung daun bangun-bangun
Daun bangun-bangun disortasi, trimming, dan dicuci. Daun bangun-bangun
diiris untuk mempercepat pengeringan dalam oven. Irisan daun bangun-bangun
disusun di atas loyang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC dalam waktu
48 jam. Irisan kering daun bangun-bangun dihaluskan dengan blender hingga
menjadi bubuk/tepung, diayak dengan ayakan komersil 60 mesh. Dilakukan
pengemasan dengan plastik dalam keadaan tertutup dan diuji komposisi proksimat
Universitas Sumatera Utara
tepung daun bangun-bangun. Skema pembuatan tepung daun bangun-bangun
dapat dilihat pada Gambar 5 (Rusmarilin, 2003).
Pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Ekstraksi tepung daun bangun-bangundilakukan untuk memperoleh
ekstrak metanolik. Sebanyak 25 g tepung daun bangun-bangun dimaserasi dalam
pelarut
hexan
150
ml
(maserasi
48
jam),
disaring,
dan
ampasnya
dikeringanginkan. Ampas dimaserasi dengan pelarut methanol, kemudian
disaring, diperoleh filtrat dan dipekatkan dengan rotari evaporator, diperoleh
ekstrak kental metanolik (Kuncahyo dan Sunardi, 2007).
Pembuatanlarutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air
Sebanyak 4 g ekstrak kental metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades
dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter. Digojok selama 30 detik, dan dibiarkan
memisah akibat adanya perbedaan massa jenis antara fraksi eter (lapisan atas) dan
fraksi air (lapisan bawah). Fraksi eter dan air masing-masing dipekatkan dalam
waterbathselama 2 jam dengan suhu 70°C untuk fraksi eter dan 100°C untuk
fraksi air. Masing-masing ekstrak kental metanolik dibuat konsentrasi 10 ppm, 20
ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm, diukur aktivitas antioksidan dengan metode
DPPH. Skema pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun dapat dilihat
pada Gambar 6.
Pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air dapat dilihat pada
Gambar 7 dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm
(Kuncahyo dan Sunardi, 2007).
Universitas Sumatera Utara
Parameter Penelitian
Pengamatan dan pengukuran dilakukan melalui analisis menggunakan alat
di laboratorium (in vitro). Tepung daun bangun-bangun dilakukan analisis
proksimat, yaitu: pengukuran kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak,
dan kadar serat kasar. Ekstrak metanolik daun bangun-bangun dan ekstak
metanolik fraksi eter dan airdihitung rendemen dan diukur absorbansi peredaman
radikal bebas DPPH pada ekstrak metanolik fraksi eter dan air berbagai
konsentrasi dan tingkat petikan.
Kadar air (SNI 01–2891–1992)
Ditimbang sampel sebanyak 1-2 gram pada botol timbang yang telah
diketahui bobotnya.Kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 105°C
selama 3 jam.Didinginkan dalam desikator dan ditimbang, diulangi beberapa kali
hingga diperoleh bobot yang tetap. Prinsipnya dengan menghitung jumlah air
yang menguap saat dipanaskan dalam oven dan dianggap kadar air yang ada pada
bahan. Perhitungannya adalah sebagai berikut :
Kadar air (% bk) =Kehilangan bobot setelah dikeringkan (g)
Bobot setelah dikeringkan (g)
x 100%
Kadar abu (Sudarmadji, et al., 1996)
Penentuan kadar abu cara kering, dengan mengoksidasikan semua zat
dalam bahan pada suhu tinggi 500-6000C. Sampel ditimbang sebanyak 5 g,
dimasukkan dalam cawan porselen dan dibakar dalam tanur.Kemudian zat yang
tersisa di dalam cawan pengabuan ditimbang. Perbandingan bobot zat sisa (abu)
dengan bobot awal sampel (5 g) dinyatakan dalam (%) sebagai kadar abu.
Universitas Sumatera Utara
Kadar abu (%) =
Bobot abu (g) x 100%
Bobot sampel awal (g)
Kadar serat kasar (Apriantono, dkk., 1989)
Sampel sebanyak 2 g yang sudah dikadar lemakkan dimasukkan ke dalam
labu erlenmeyer 300 ml kemudian ditambahkan 100 ml H 2 SO 4 0,325 N.
Hidrolisis dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 105oC. Setelah
didinginkan sampel ditambahkan NaOH 1,25 N sebanyak 50 ml, kemudian
dihidrolisis kembali selama 15 menit. Sampel disaring dengan kertas saring
Whatman No. 41 yang telah dikeringkan dan diketahui beratnya. Kertas saring
tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas lalu 25 ml H 2 SO 4 0,325 N,
kemudian dengan air panas dan terakhir dengan 25 ml etanol 95%. Kertas saring
dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama satu jam, pengeringan dilanjutkan
sampai berat konstan. Kadar serat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Kadar serat kasar (%)
= Berat Kertas Saring + Serat (g) – Berat Kertas saring (g) x
100%
Berat Sampel Awal (g)
Kadar proteincara makro kjeldahl (AOAC, 1995)
Ditimbang sampel yang telah dihaluskansebanyak 0,2 g, dimasukkan ke
dalam labu kjeldahl 30 ml selanjutnya ditambahkan 1,5 ml H 2 SO 4 pekat dan 2 g
katalis (CuSO 4 dan K2 SO 4 ), dan dididihkan selama 2 jam atau sampai berwarna
hijau kebiruan. Labu beserta isinya didinginkan, kemudian isinya dipindahkan ke
dalam alat destilasi dan ditambahkan 15 ml larutan NaOH 40%. Kemudian dibilas
dengan akuades. Erlenmeyer 250 ml berisi H 2 SO 4 0,025 N dan 2–4 tetes indikator
mengsel (campuran metil merah 0,02% dalam alkohol dan metil biru 0,02% dalam
alkohol dengan perbandingan 2:1) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung
kondensor harus terendam dalam labu berisi campuran larutan H 2 SO 4 dengan
Universitas Sumatera Utara
mengsel, kemudian dilakukan destilasi hingga destilat mencapai 125 ml. Ujung
kondensor kemudian dibilas dengan sedikit air destilat dan ditampung dalam
erlenmeyer lalu dititrasi dengan NaOH 0,02 N sampai terjadi perubahan warna
ungu menjadi hijau. Penetapan blanko dilakukan dengan cara yang sama.
Kadar protein = (A-B) x N x 0,014 x 5,18
Bobot Sampel (g)
x 100%
A = ml NaOH untuk tittrasi blankoB = ml NaOH untuk titrasi sampel
N = Normalitas NaOH
Kadar lemak (Metode Soxhlet) (AOAC, 1995)
Dipanaskan labu alas datar 250 ml di dalam oven pada suhu 105oC hingga
didapat bobot tetap kemudian sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu
dimasukkan ke dalam kertas saring. Kertas saring yang berisi sampel diekstrak
dengan 130 ml hexan dengan menggunakan soxhlet selama 5 jam dan labu lemak
dipisahkan dari alat pengekstraksi lalu diuapkan. Labu dikeringkan dalam oven
60oC dan ditimbang sampai bobot tetap. Kemudian dihitung kadar lemak sampel
dengan rumus :
Kadar lemak (%) = Bobot akhir labu lemak (g) - Bobot awal labu lemak (g) x 100%
Bobot sampel (g)
Rendemen (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)
Tepung daun bangun-bangun 25 g dilarutkan dan direndam (maserasi)
dalam pelarut non polar (hexan) 150 ml selama 48 jam.Dilakukan penyaringan,
ampas dikeringkan hingga tidak berbau hexan.Residu dilarutkan dalam metanol
(maserasi 48 jam) kemudian disaring dan filtrat dipekatkan untuk mendapatkan
Universitas Sumatera Utara
ekstrak kental metanolik.Ekstrak kental metanolik dihitung rendemennya dengan
rumus berikut.
Rendemen (%)=
Bobot ekstrak metanolik pekat (g)
Bobot tepung daun bangun-bangun (g)
x 100%
Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades dan
dipartisi dengan 50 ml dietil eter.Dilakukan pemisahan fraksi eter danair.Fraksi
eter dipekatkan dengan waterbathpada suhu 70°Cdan fraksi air pada suhu 100°C
selama2 jam. Ekstrak metanolik fraksi eter dan air hasil pemekatan masingmasing ditimbang dan dihitung rendemen dengan rumus sebagai berikut :
Rendemen (%)= Bobot ekstrak metanolik pekat fraksi eter/air (g) x 100%
Bobot ekstrak metanolik (g)
Uji aktivitas antioksidan fraksi eter dan air (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)
Fraksi air dan eter dibuatlarutan (menggunakan pelarut metanol) dengan 5
konsentrasi berbeda (10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm) sebanyak 4 ml,
ditambahkan radikal bebas DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml dimasukkan dalam vial
dikocok. Didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian dibaca serapan
aktivitasnya pada panjang gelombang 517 nm. Blanko yang digunakan adalah 4
ml metanol dan 1 ml DPPH 0,1 mM. Kontrol positifsebagai pembanding
digunakan antioksidan sintetis BHT dan vitamin C. Nilai absorbansi (Abs.) yang
diperoleh menunjukkan aktivitas antioksidan senyawa uji (% peredaman).Nilai
IC 50 masing-masing dihitiung dengan persamaan regresi.
Peredaman DPPH (%) = 100 (Abs. blanko – Abs. sampel) / Abs. blanko
Universitas Sumatera Utara
IC 50 (Molyneux, 2004)
IC 50 merupakan bilangan yang dapat menunjukkan konsentrasi ekstrak
yang dapat menghambat aktivitas radikal sebesar 50%. Dalam menentukan IC 50
dibutuhkan adanya kurva standar dari % inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi
fraksi antioksidan sebagai sumbu x. IC 50 dihitung dengan cara memasukkan nilai
50% ke dalam persamaan kurva standar sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai
x sebagai konsentrasi IC 50 . Semakin kecil nilai IC 50 menunjukkan semakin tinggi
aktivitas antioksidannya.
Universitas Sumatera Utara
Daun bangun-bangun
Disortasi, trimming, dan dan dicuci
Diiris tipis
Disusun di atas loyang dan keringkan dalam
oven suhu 500C selama 48 jam (sampai kering)
Irisan kering diblender hingga menjadi tepung
Diayak dengan ayakan komersil (60 mesh)
Tepung daun bangun-bangun
Dikemas dengan plastik dalam keadaan tertutup
Analisis proksimat
- Kadar air
- Kadar abu
- Kadar lemak
- Kadar protein
- Kadar serat kasar
Gambar 10. Skema pembuatan tepung daun bangun-bangun
Universitas Sumatera Utara
Maserasi tepung daun bangun-bangun dalam pelarut nhexan (1:6) selama 48 jam
Disaring
Ampas dikeringkan
600C, 30 menit
Maserasi dalam pelarut
metanol (1:6) 48 jam
Disaring
Filtrat metanol
Filtrat/ekstrak methanol dipekatkan menjadi ekstrak kental metanolik yang diletakkan
pada erlenmeyer dengan rotari evaporatorpada suhu 70°C selama 20 menit
Ekstrak metanolik
Penghitungan rendemen
ekstrak metanolik
Gambar 11. Skema pembuatan ekstrak metanolik daun bangun-bangun
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi
50 ml akuades dan dipartisi 50 ml dietil eter
Rendemen
Digojok selama 30 detik dan dipisahkan
dalam corong pisah
Rendemen
Fraksi eter (lapisan atas), dipekatkan
dalam waterbath selama 2 jam dengan
suhu 70 °C, dan dihitung rendemen
fraksi kental
Fraksi air (lapisanbawah), dipekatkan
dalam waterbath selama 2 jam
dengan suhu 100°C, dan dihitung
rendemen fraksi kental
Dibuat larutan uji fraksi eter
konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm,
80 ppm, 160 ppm
Dibuat larutan uji fraksi air
konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm,
80 ppm, 160 ppm
Analisis: aktivitas antioksidan
(% peredaman radikal bebas DPPH)
dengan kontrol positif vitamin C
Analisis: aktivitas antioksidan
(% peredaman radikal bebas DPPH)
dengan kontrol positif vitamin C
Gambar 12. Skema pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter dan air
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
I : Pembuatan Tepung Daun Bangun-Bangun
Pengeringan dan penepungan daun bangun-bangun dilakukan dengan
tujuan untuk mengurangi kadar air bahan. Kandungan air yang tinggi pada bahan
dapat menghambat proses pemekatan karena titik didih air lebih tinggi daripada
pelarut yang digunakan. Penepungan bertujuan untuk memperbesar luas
permukaan bahan dengan ukuran partikel yang lebih kecil dan seragam, sehingga
ekstraksi pada bahan dapat berlangsung dengan optimum.Hasil analisis proksimat
tepung daun bangun-bangun dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil penelitian yang
dilakukan, diperoleh hasil komposisi kimia tepung daun bangun-bangun yang
memberikan pengaruh terhadap kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak
dan kadar serat kasar.
Tabel 2.Komposisi kimia tepung daun bangun-bangun pada bagian pucuk, tengah
dan bawah.
Petikan I
Petikan II
Petikan III
Parameter
(Pucuk)
(Tengah)
(Bawah)
Kadar air (%bk)
6,24 ±0,34
6,13 ±0,41
6,74 ±0,11
Kadar abu (%bk)
12,89 ±0,05
13,64 ±0,27
14,05 ±0,05
Kadar lemak (%bk)
3,84±0,48
3,81 ±0,13
5,05 ±0,25
Kadar protein (%bk)
4,41 ±0,37
4,89 ± 0,44
4,04 ±0,87
Kadar serat (%bk)
11,23 ± 1,48
12,09 ±0,89
13,29 ± 0,32
Keterangan : Data terdiri dari 3 ulangan ± Standar deviasi
Universitas Sumatera Utara
Kadar air (%bk)
Tabel 2 dapat diketahui bahwa perbedaan tingkat petikan daun bangunbangun memberikan pengaruh berbeda tidak nyata (P>0,05) terhadap kadar air
tepung daun bangun-bangun, sehingga uji LSR tidak dilanjutkan. Dapat dilihat
pada Lampiran 1.
Kadar abu (%bk)
Hasil analisis ragam pada Lampiran 2 dan Tabel 2 dapat dilihat bahwa
tingkat petikan daun bangun-bangun memberikan pengaruh berbeda sangat nyata
(P0,05) terhadap kadar serat
kasar tepung daun bangun-bangun, sehingga uji LSR tidak dilanjutkan. Dapat
dilihat pada Lampiran 5.
Universitas Sumatera Utara
II : Pembuatan Ekstrak Metanolik Daun Bangun-Bangun
Tepung daun bangun-bangun dengan petikan 1 (4 daun dari pucuk),
petikan 2 (4 daun bagian tengah), dan petikan 3 (4 daun bagian bawah) diambil
masing-masing 25 g dilarutkan dalam 150 ml n-hexan, kemudian residu diekstrak
menggunakan pelarut metanol untuk mendapatkan ekstrak metanolik. Ekstrak
metanolik yang dihasilkan kemudian dipekatkan hingga dihasilkan ekstrak
metanolik yang kental
Rendemen (%)
Ekstrak kental metanolik yang dihasilkan, kemudian ditimbang beratnya
dan dilakukan perhitungan rendemen pada semua perlakuan pada setiap tingkat
petikan.Rendemen ekstrak kental metanolik dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Rendemen ekstrak metanolik
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat
serbuk (g)
Berat ekstrak
metanolik (g)
Rendemen
(%)
Rataan ±
standar deviasi
(%)
26,2929
25,2347
25,0929
4,3238
4,3997
4,4668
16,4447
17,4351
17,8010
17,22±0,70
25,0013
26,0161
25,1035
4,5437
4,4764
4,2615
18,1738
17,2062
16,9757
17,45±0,63
26,0144
25,1013
25,2194
4,5119
4,5022
4,6988
17,3438
17,9361
16,9757
17,97±0,64
Tabel 3 dapat diketahui rendemen ekstrak kental metanolik tertinggi
terdapat pada perlakuan bagian bawah, yaitu sebesar 17,97%, sedangkan
rendemen terendah terdapat pada perlakuan bagian pucuk, yaitu sebesar 17,22%.
Lampiran 6 diketahui tingkat petikan memberikan pengaruh berbeda tidak nyata
(P>0,05) terhadap rendemen ekstrak metanolik.
Universitas Sumatera Utara
Ekstrak metanolik yang telah diperoleh selanjutnya disuspensi dengan 50
ml akuades dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter.Larutan tersebut dipisahkan
dengan menggunakan corong pisah menjadi dua bagian fraksi, yaitu fraksi eter
dan fraksi air. Fraksi eter merupakan larutan bagian atas, sedangkan fraksi air
merupakan larutan bagian bawah. Fraksi eter dan fraksi air yang telah diperoleh
kemudian dipekatkan, ditimbang beratnya, dan kemudian dilakukan perhitungan
rendemen.Rendemen fraksi eter dan fraksi air dapat dilihat pada Tabel 4 dan
Tabel 5.
Tabel 4. Rendemen ekstrak metanolik fraksi eter
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat ekstrak
metanolik (g)
Berat fraksi
(g)
Rendemen
(%)
Rataan ± standar
deviasi (%)
4,3238
4,3997
4,4668
0,0290
0,0358
0,0288
0,6707
0,8136
0,6447
0,70±0,09bB
4,5437
4,4764
4,2615
0,0368
0,0384
0,0308
0,8099
0,8578
0,7227
0,79±0,06bB
4,5119
4,5022
4,6988
0,0398
0,0377
0,0388
0,8821
0,8373
0,8257
0,84±0,02aA
Keterangan : notasi huruf yang berbeda menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata pada taraf 5%
dan berbeda sangat nyata 1%
Tabel 4 diketahui rendemen tertinggi fraksi eter terdapat perlakuan pada
petikan ketiga (bagian bawah), yaitu sebesar 0,84%, sedangkan rendemen
terendah terdapat pada perlakuan petikan pertama (bagian pucuk), yaitu sebesar
0,70%. Hasil sidik ragam yang terdapat pada Lampiran 7 diketahui bahwa tingkat
petikan memberikan pengaruh berbeda sangat nyata terhadap rendemen ekstrak
metanolik fraksi eter.
Universitas Sumatera Utara
0,9
0,8
0.7968
0.8484
0.7097
Rendemen (%)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
P1
P2
P3
Petikan
Gambar 15. Hubungan tingkat petikan daun bangun-bangun dengan rendemen
ekstrak metanolik fraksi eter (%)
Gambar 15 dapat kita lihat bahwa rendahnya petikan daun bangun-bangun
dengan rendemen ekstrak metanolik fraksi eter (%) memiliki rendemen yang
paling tinggi pada perlakuan P 3 dan rendemen terendah pada P 1 .Maka semakin
rendah tingkat petikan maka semakin tinggi rendemen yang dimiliki oleh tepung
daun bangun-bangun ekstrak metanolik fraksi eter. Adanya rendemen ekstrak
metanolik fraksi eter meningkat pada P 3 (bagian bawah) dan cenderung menurun
pada P 1 (bagian pucuk) dikarenakan tanaman pada bagian pucuk sampai pada
bagian tengah lebih banyak mengandung komponen bioaktif, sedangkan pada
bagian bawah sudah mulai mengalami adanya proses pelayuan, sehingga
mengakibatkan adanya proses pembentukan metabolit sekunder dalam tanaman
cenderung berkurang (Lintang, dkk., 2014).
Universitas Sumatera Utara
Tabel 5. Rendemen ekstrak metanolik fraksi air
Perlakuan
Bagian pucuk (P1)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian tengah (P2)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Bagian bawah (P3)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Berat ekstrak
metanolik (g)
Berat fraksi
(g)
Rendemen
(%)
Rataan ± standar
deviasi (%)
4,3238
4,3997
4,4668
3,8104
3,0328
3,3055
88,1261
68,9319
74,0015
77,01±9,94
4,5437
4,4764
4,2615
3,2141
3,8041
3,4439
70,7375
84,9812
80,8142
78,84±7,32
4,5119
4,5022
4,6988
3,2266
3,1053
3,5907
71,5131
68,9729
76,4173
72,30±3,78
Tabel 5 dapat dilihat bahwa rendemen tertinggi dari fraksi air terdapat
pada perlakuan P 2 (bagian tengah), yaitu sebesar 78,84% dan terendah terdapat
pada perlakuan P 3 (bagian bawah), yaitu sebesar 72,30%. Lampiran 8 dapat
diketahui bahwa pengaruh tingkat petikan daun bangun-bangun memberikan
pengaruh berbeda tidak nyata terhadap rendemen ekstrak metanolik fraksi air.
Fraksi eter rendemen tertinggi terdapat pada perlakuan P 3 (bagian bawah),
dan pada fraksi air terdapat pada perlakuan P 2 (bagian tengah).Hal tersebut
dikarenakan rendemen ekstrak metanolik tertinggi dihasilkan dari perlakuan P3
(bagian bawah). Adanya rendemen fraksi eter yang jauh lebih rendah daripada
fraksi air, menunjukkan bahwa adanya kandungan senyawa polar yang lebih besar
pada daun bangun-bangun karena pelarut air yang bersifat polar (Kuncahyo dan
Sunardi, 2007), atau adanya senyawa polar dalam ekstrak metanolik daun bangunbangun lebih banyak dibandingkan senyawa yang bersifat semipolar yang dapat
terlarut pada fraksi eter (Lintang, dkk., 2014).
Universitas Sumatera Utara
III: Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanolik Tepung Daun BangunBangun Fraksi Eter dan Air
Adapun ekstrak kental metanolik fraksi eter dan air masing-masing dibuat
larutan uji dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm.
Larutan uji tersebut masing-masing 4 ml ditambahkan dengan radikal bebas yaitu
DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml, kemudian dibaca absorbansinya dengan alat
spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm. Adapun hasil serapan yang
dihasilkan oleh radikal DPPH dapat dinyatakan dengan aktivitas antioksidan (%
peredaman DPPH).Aktivitas antioksidan ekstrak kental metanolik fraksi eter dan
fraksi air dari berbagai tingkat petikan dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Aktivitas antioksidan ekstrak metanolik fraksi eter dan fraksi air
Aktivitas antioksidan (% peredaman DPPH)
Perlakuan
(Petikan)
Konsentrasi
(ppm)
I
(Pucuk)
10
20
40
80
160
10
20
40
80
160
10
20
40
80
160
II
(Tengah)
III
(Bawah)
Fraksi eter
I
38,52
44,55
56,70
67,09
77,48
35,93
42,85
53,24
64,93
74,89
32,90
39,39
50,21
63,20
73,16
II
38,09
43,29
54,11
70,56
80,51
35,06
42,42
51,94
68,83
78,78
30,30
37,22
46,32
60,60
71,86
III
41,55
41,55
54,11
58,44
80,51
35,06
43,72
52,81
57,14
61,90
30,30
37,22
46,32
60,60
71,86
Fraksi air
Rataan
39,39
43,13
54,97
65,36
79,50
35,35
42,99
52,66
63,63
71,86
31,16
37,95
47,61
61,47
72,29
I
39,35
45,80
50,96
60,00
69,03
36,12
42,58
47,74
56,77
65,80
35,48
41,93
47,09
56,12
65,16
II
41,93
48,38
53,54
60,00
74,19
36,77
43,22
50,96
61,29
70,32
35,48
41,93
45,80
56,12
69,03
III
41,93
47,09
53,54
61,29
72,90
40,64
47,09
53,54
61,29
70,32
36,77
43,22
49,67
56,12
69,03
Rataan
41,07
47,09
52,68
60,43
72,04
37,84
44,30
50,75
59,78
68,81
35,91
42,36
47,52
56,12
67,74
Tabel 6 dapat diketahui bahwa ekstrak metanolik daun bangun-bangun
fraksi eter dan fraksi air memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan %
peredaman radikal DPPH.Adapun senyawa antioksidan yang terkandung dalam
daun bangun-bangun yaitu senyawa flavonoid.Menurut Santosa dan Hertiani
(2005) menyatakan bahwa pada ekstrak daun bangun-bangun mengandung
Universitas Sumatera Utara
senyawa flavonoid, glikosida flavonol, polifenol, dan minyak atsiri. Menurut
Sirait (2007), adapun flavonoid sendiri pada umumnya pada tanaman berperan
sebagai glikosida, dan gugusan gula yang terdiri atas satu atau lebih gugus
hidroksil fenolik. Flavonoid pada tanaman terdapat pada daun, buah, sari dan akar.
Golongan flavonoid merupakan flavor yang berperan sebagai antioksidan.
Flavonoid adalah satu dari senyawa alami yang paling beragam dan
merupakan senyawa alami fenol yang sangat penting.Flavonoid merupakan
senyawa yang memiliki spectrum yang luas dalam aktivitas biologi dan kimia
termasuk dalam penghambatan radikal bebas.Senyawa ini memiliki sekitar 9000
jenis struktur senyawa yang telah diidentifikasi.Adapun kelompok utama senyawa
utama flavonoid adalah flavon, isoflavon, flavonol, antosianin, katekin dan
khalkon (Lukitaningsih, 2009).
Gambar 16. Struktur kimia flavonoid (Waji dan Sugrani, 2009)
Menurut Kaliappan (2008), daun bangun-bangun dibuktikan sebagai
antiinflamasi karena dapat menghambat respon inflamasi yang diinduksi oleh
adanya siklooksiginase, dan juga sebagai anti kanker dan anti tumor.Daun
bangun-bangun mengandung jenis flavonoid yaitu quercetin, apigenin, luteolin,
salvigenin dan genkwanin.
Flavonoid sendiri merupakan sumber antioksidan seperti alfa tokoferol,
vitamin dan betakaroten. Menurut Sartika (2013), hampir 80% dari total
Universitas Sumatera Utara
antioksidan dalam buah dan sayuran adalah flavonoid, yang berfungsi sebagai
penangkap anion superoksida, lipid peroksida radikal, oksigen singlet, dan
pengkelat logam. Lintang, dkk., (2014) menyatakan berdasarkan kelarutannya
dalam air. Flavonoid terdiri dari aglikon dan glukosida, dan di alam senyawa ini
dapat ditemukan dalam bentuk 7-O-glukosida.
Surya, dkk., (2013) menyatakan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak daun
bangun-bangun dengan menggunakan empat metode yang berbeda salah satunya
metode DPPH, antara ekstrak methanol dan ekstrak etil asetat dari tanaman daun
bangun-bangun menunjukkan dengan menggunakan pelarut metanol lebih baik
aktivitas antioksidannya dibandingkan dengan menggunakan pelarut etil asetat.
Menurut Kemala (2012) juga menyatakan bahwa aktivitas antioksidan daun
bangun-bangun menggunakan pelarut etil asetat dari ekstrak etanol memiliki
aktivitas toksik yang disebabkan oleh adanya senyawa flavonoid.Penelitian yang
dilakukan oleh Kuncahyo dan Sunardi (2009) terhadap aktivitas antioksidan
belimbing wuluh dengan menggunakan pelarut metanol dengan fraksi eter dan air
memperlihatkan bahwa belimbing wuluh memiliki aktivitas antioksidan.
Pengaruh interaksi antara tingkat petikan daun bangun-bangun dengan
konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter terhadap aktivitas antioksidan (%
peredaman DPPH)
Daftar analisis sidik ragam dari Lampiran 9 dapat diketahui bahwa
konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter dan tingkat petikan daun bangun-bangun
memberikan pengaruh berbeda sangat nyata (P