Email: primanandafauziahanalis-ayani.ac.id ABSTRAK - View of ANALISIS DAN KARAKTERISTIK PROMOTER GEN ZIF23 UNTUK PENGEMBANGAN SISTEM PENAPISAN ANTITUBERKULAR BARU

  

ANALISIS DAN KARAKTERISTIK PROMOTER GEN ZIF23 UNTUK

PENGEMBANGAN SISTEM PENAPISAN ANTITUBERKULAR BARU

_1*

Prima Nanda Fauziah , Ernawati Arifin Giri-Rachman

  

Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Jenderal Achmad Yani Cimahi

_{1 2} Prodi Analis Kesehatan (D-III) _*

Prodi Biologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung

Email: primanandafauziah@analis-ayani.ac.id

  

ABSTRAK

  MDR-TB (Multidrug-Resistant Tuberculosis ) dan

  XDR-TB (Extensivelydrug-Resistant

  

Tuberculosis ) adalah penyakit infeksi akibat resistensi antibiotik yang menjadi pandemik di seluruh

  dunia. Kemunculan MDR-TB dan XDR-TB menjadi alasan utama dalam pengembangan antituberkular baru yang bersifat multitarget. Obat antituberkular yang tersedia saat ini pada dasarnya hanya menarget satu produk gen untuk satu obat. Oleh karena itu, perlu dicari target obat yang dapat mengganggu beberapa gen di dalam Mycobacterium tuberculosis khususnya gen yang diketahui berperan dalam virulensi.Pengembangan antituberkular baru yang bersifat multitarget dengan menghambat sistem regulasi TCS (Two-component System) M. tuberculosis dapat berperan besar dalam pengobatan kasus resistensi tersebut.Kandidat antituberkularbaru yang akan diuji coba dapat dideteksi karena adanya kegagalan represi promoter. Pada penelitian ini, dilakukan analisis dan karakteristik motif-motif promoter gen zif23sebagai langkah awal dalam pengembangan sistem penapisan antituberkular baru. Promoter zif23 merupakan promoter sintetik dari organisme eukariot (Mus musculusdanSaccharomyces cerevisiae), tetapi mampu dikenali oleh RNA polimerase dan faktor sigma dari organisme prokariot. Motif promoter gen zif23 berukuran 52 pb telah berhasil dianalisis. Hasil penelusuran lebih lanjut menunjukkan bahwa ternyata motif-motif -10 Pribnow box (GATACT), motif -35 box (TTGACA), dan konsensus pengikatan zif23 (CCCACGCGCGTGGGA dan CCCACGCGCGTGGG) terdapat pada urutan DNA komplemen dari urutan DNA zif23 hasil sintesis.Analisis dan karakteristik promoter tersebut diharapkan dapat menjadi bagian dari pengembangan sistem penapisan yang dapat bermanfaat bagi pencarian antituberkular baru di Indonesia.

  Kata kunci: Antituberkular, mycobacterium tuberculosis, promoter, Zif23

  

ABSTRACT

Multi-Drug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) and Extensively-Drug Resistant Tuberculosis (XDR-

TB) are among the most worrisome elements of the pandemic of antibiotic resistance. The emergence

of Multi-Drug and Extensively-Drug Resistant Tuberculosis (MDR and XDR-TB) has revealed the

need for the discovery of novel antitubercular drugs. The characteristic of current antitubercular

drugs basically one drug which just targeting one gene product, hence we are trying to investigate

a drug target which could influence a number of genes in Mycobacterium tuberculosis which are

known to have a role in virulence. The development of an antitubercular drug active with multitarget

pathways such as two component regulatory system (TCS) of Mycobacterium tuberculosis will

potentially give a profound impact on MDR-TB and XDR-TB treatment programmes. The novel

antitubercular drug candidates will be detected by the failure of repression at promoter. Zif23

promoter is a synthetic promoter from eukaryotic organism (Mus musculus and Saccharomyces

cerevisiae), but recognized by RNA polymerase and sigma factor of prokaryotic organism. In this

research we tried to analyze promoter motifs of zif23 synthetic promoter. Promoter motifs of 52 bp

of zif23 gene was analyzed. Advance analysis showed that the -10 Pribnow box motif (GATACT), -

35 box motif (TTGACA), and consensus binding site of zif23 (CCCACGCGCGTGGGA dan

CCCACGCGCGTGGG) were located on the complement of DNA synthesized. It is expected that the

construct could be part of high throughput screening system that can be usefull for generating novel

drugs against tuberculosis in Indonesia.

  Keywords: Antitubercular, mycobacterium tuberculosis, promoter, Zif23

A. PENDAHULUAN

  Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi saluran pernapasan akibat infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis (Mtb) dan termasuk salah satu penyakit infeksi global yang menyebabkan kematian di dunia (Barletta dkk., 2013; Baussano dkk., 2013). Rendahnya efektifitas obat antituberkular (OAT) yang beredar saat ini menekankan perlunya dikembangkan obat antituberkular baru dengan target yang lebih luas, bekerja cepat, dan mampu mengeliminasi sifat-sifat virulensi Mtb sehingga Mtb akan dengan mudah dihancurkan oleh sistem imun (Dover dkk., 2008). Salah satu caranya adalah melalui penghambatan sinyal transduksi yang berperan dalam mekanisme regulasi transkripsi dari banyak gen pada Mtb, termasuk gen yang berperan dalam virulensi (Gupta dkk., 2006; Koul dkk., 2011). Sistem sinyal transduksi yang sederhana dan umum ditemukan pada bakteri termasuk pada Mtb adalah two- component system (TCS) (Ryndak dkk., 2008).

  TCS memiliki potensi untuk dijadikan sebagai target obat antibakteri karena beberapa alasan. Pertama, TCS sangat penting dalam mengkoordinasikan ekspresi dari beberapa gen termasuk faktor-faktor virulensi (gen penginduksi respon stres pada sel) dan mekanisme

  Pada penelitian ini digunakan metode in silico dalam proses analisis dan karakteristik motif- motif promoter menggunakan software Bioedit™ dan SnapGene™. drug-efflux pumps . Kedua, proses signalling berupa fosforilasi histidin dalam tahap regulasi pada bakteri berbeda dengan fosforilasi serin/treonin dan tirosin pada eukariot tingkat tinggi, termasuk manusia. Terakhir, sistem ini dapat mengendalikan ekspresi gen-gen secara simultan, sehingga mengurangi frekuensi strain yang resisten terhadap obat (Okada dkk., 2007). TCS dapat dikembangkan dalam suatu sistem konstruksi gen untuk penapisan/ skrining secara in vitro dengan menyisipkan promoter, repressor, dan gen target (TCS) serta gen pelapor seperti GFP (Green Fluorescent Protein ) atau EmGFP (Emerald Green Fluorescent Protein

  ). Sistem penapisan/skrining yang akan diuji coba dapat dideteksi karena adanya kegagalan represi promoter (Fauziah dkk., 2015).

  Promoter zif23 (zinc finger 2 and 3) merupakan promoter sintetik dari organisme eukariot (Mus musculus dan Saccharomyces cerevisiae) , tetapi mampu dikenali oleh RNA polimerase dan faktor sigma dari organisme prokariot. Pada penelitian ini, dilakukan analisis dan karakteristik motif-motif promoter gen zif23 sebagai langkah awal dalam pengembangan sistem penapisan antituberkular baru.

B. MET ODE

  Promoter zif23 merupakan promoter sintetik yang diperoleh dari parts iGem (2014) .

  Promoter sintetik ini dirancang oleh Scot Wolfe dan Ronny Krashinsky dari UMASS. Hasil penelusuran pada situs European Nucleotide Archive (ENA) menunjukkan bahwa promoter zif23 dikategorikan sebagai promoter kuat dan memiliki afinitas tinggi terhadap RNA polimerase serta mengekspresikan

GCG-CGT-GGG-ATA-CTC-CCA-CGC- GCG-TGG-G.

  Promoter merupakan urutan DNA tempat menempelnya enzim RNA polimerase dan diinisiasinya transkripsi suatu gen termasuk gen penyebab virulensi bakteri. Daerah promoter terletak di daerah upstream

  (arah 5’) dari daerah pengkode gen (coding sequence) (Lodish dkk., 2004). Berdasarkan strukturnya, promoter prokariot memiliki elemen dasar yang disebut core

  promoter elements yang terdiri dari -10 (pribnow box

  ) dan -35 box. Kedua elemen tersebut berperan penting dalam interaksi ikatan dengan enzim RNA polimerase (Madigan dan Martinko, 2006).

  Hasil analisis secara in silico menunjukkan bahwa promoter zif23 memiliki panjang 52 pb, serta memiliki elemen dasar (core promoter

  elements ) yang terdiri dari -10 pribnow box

  (GATACT) terletak pada nukleotida 33-38, sedangkan urutan DNA -35 box (TTGACA) terletak pada nukleotida 10-15 (Gambar 1). Selisih nukleotida antara daerah -10 pribnow box dan -35

  GFP (Green Fluorescent Protein) dalam jumlah yang besar. Promoter zif23 memiliki panjang 52 bp dengan urutan basa: AGT- TTA- TTC-TTG-ACA-TGG-TCC-CAC-

C. HASIL DAN PEMBAHASAN

  box sejumlah 18 pb yang diduga memiliki efisiensi

  transkripsi yang tinggi karena berdasarkan penelitian Madigan dan Martinko (2006) diketahui bahwa efisiensi transkripsi tertinggi didapatkan jika selisih nukleotida 17~1 pb. Wolfe dkk. (2003) mengembangkan promoter zif23 sebagai salah satu upaya melengkapi konstruksi setelah lebih dulu dilakukan pengembangan protein fusi zif23- GCN4. Promoter zif23 ini dapat mengekspresikan GFP ketika dikonstruk ke dalam plasmid pET21D pada sistem Escherichia coli BL21(DE3)pLyss (Wolfe dkk., 2000a; Wolfe dkk., 2003). Daerah

  downstream dari promoter zif23 memiliki urutan

  DNA konsensus pengikatan zif23 yang sangat lestari seperti yang ditunjukkan Gambar 1. Adanya urutan DNA konsensus pengikatan zif23 pada urutan 20 pb promoter zif23 menguatkan dugaan bahwa protein repressor zif23 menempel pada daerah ini untuk merepresi transkripsi gen zif23 (Wolfe dkk., 2003).

   Gambar IV.1 Analisis motif-motif promoter zif23 secara in silico.

  : daerah pengikatan repressor zif23 (operator).

  Banyak faktor transkripsi yang bekerja Dimerisasi protein zinc finger ini dapat

dengan melakukan dimerisasi untuk menjadi alternatif yang dapat dikembangkan

meningkatkan afinitas dan spesifisitas. untuk pembuatan suatu konstruksi yang

Heterodimerisasi digunakan untuk digunakan untuk terapi gen atau

meningkatkan kontrol dari faktor transkripsi. pengembangan sistem penapisan

Pada prinsipnya, dimerisasi zinc finger pada antituberkular (Wolfe dkk., 2003; Meng dkk.,

DNA memberikan keuntungan karena dapat 2007). menambah situs pengenalan dan pengikatan terhadap DNA (Wolfe dkk., 2000b). Dimerisasi zif23 mampu memodulasi spesifisitas DNA.

DAFTAR PUSTAKA

  Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H., dan Matsudaira, P. (2008) : Molecular Cell Biology 6th Edition, W. H. Freeman and Company , New York.

  42, 13401-13409.

  Structure of a Designed Dimeric Zinc Finger Protein Bound to DNA. Biochemistry. Vol.

  (2000b) : Beyond the “Recognition Code”: Structures of Two Cys2His2 Zinc Finger/TATA Box Complexes. Structure, Vol. 9, 717 –723. Wolfe, S.A., Grant, R.A., Carl, O.P. (2003) :

  Vol.8:739-750. Wolfe, S.A., Grant, R.A., Ramm, E.I., Carl, O.P.

  Combining structure-based design with phage display to create new Cys ^{2 His 2 zinc finger} dimers. Research Article Elsevier Science.

  Ryndak, M., Wang, S., dan Issar, S. (2008) : PhoP, a Key Player in Mycobacterium tuberculosis Virulence, Trends Microbiol., 16(11): 528- 534. Wolfe, S.A., Ramm, E.I., Carl, O.P. (2000a) :

  Yamamoto, K., Utsumi, R. (2007). Targetting Two Component Signal Trasduction : A Novel Drug Discovery System, Methods in Enzymology , Vol. 422(19): 386-395.

  Vol. 35(11):1-9. Okada, A., Gotoh, Y., Watanabe, T., Furuta. E.,

  Keith, J., Scot, A.W. (2007) : Profiling the DNA-binding specificities of engineered CysHis ^{2 zinc finger domains using a rapid} cell-based method. Nucleic Acids Research.

  Meng, X., Thibodeau-Beganny, S., Tao, J., J.

  : Biology of Microorganism 11th edition . New Jersey : Pearson Prentice Hall.

  Madigan, M.T., dan Martinko, J.M. (2006) : Brock

  Barletta, F., Otero, L., Jimena, C., Belisa, A., Bouke, C.D.J., Carlos, S., Leen, R. (2013): Genetic variability of Mycobacterium

  tuberculosis complex in patients with no

  Recognition of Novel Direct Repeat Sequences in the Regulatory Region of the Promoter, Elsevier, 580: 5328-5338.

  Mycobacterium tuberculosis PhoP Involves

  Transcriptional Autoregulation by

  [Abstract]. PIT PERMI Conference. Semarang. Gupta, S., Sinha, A., dan Sarkar, D. (2006) :

  (2015): Molecular Cloning, Characterization, Promoter Analysis of the Zinc Finger 23 (Zif23) Gene to Develop A Novel High Throughput Screening System for New Antitubercular by Targetting phoR of Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

  Fauziah, P.N., Suhandono, S., Ernawati, A.G.

  tuberculosis infections, Expert Rev.Vaccines, 7(4): 481-497.

  B.E., dan Besra, G.S. (2008): New Drugs and Vaccines for Drug-Resistant Mycobacterium

  among socially marginalized immigrants in low-incidence area, 1991-2010, Italy. Emerging Infectious Diseases . Vol. 19(9):1437-45. Dover, L.G., Bhatt, A., Bhowruth, V., Willcox,

  Mycobacterium tuberculosis

  Baussano, L., Mercadante, S., Manish, P., Ajit, L., Massimiliano, B. (2013): High rates of

  Disease . Vol. 13: 1-7.

  known risk factors for MDR-TB in the North- eastern part of Lima, Peru. BMC Infectious

  Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., dan Andries, K. (2011) : The Challenge of New Drug Discovery for Tuberculosis, Nature , 469: 483-490.

  Jurnal Kesehatan Kartika Vol.11 No. 1, April 2016