Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia Amygdalina Del.) Terhadap Sel Hela Dan Sel Vero
Lampiran 1. Hasil identifikasi tumbuhan
58
Lampiran 2. Ethical clearance
59
Lampiran 3. Karakteristik tumbuhan daun Afrika
Tumbuhan Afrika
Daun Afrika
60
Lampiran 4. Gambar Sel HeLa yang telah konfluen (perbesaran 10x10)
61
Lampiran 5. Gambar Sel Vero yang telah konfluen (perbesaran 10x10)
62
Lampiran 6. Gambar Sel HeLa dalam kamar hitung (perbesaran 10x10)
63
Lampiran 7. Gambar Sel Vero dalam kamar hitung (perbesaran 10x10)
64
Lampiran 8. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa (perbesaran 10x10)
setelah pemberian ekstrak
Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml
65
Lampiran 9. Gambar morfologi sel normal Vero (perbesaran 10x10) setelah
pemberian ekstrak
Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml
66
Lampiran 10. Gambar ELISA Reader, Mikroskop Inverted
Keterangan : Elisa Reader
Keterangan : Mikroskop Inverted
67
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel pada hemositometer
Jumlah Sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel
Jumlah sel/ml :
∑sel/mL =
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D
× 104
4
∑sel/ml =
219
4
= 54,75 x 104 sel/ml
Volume Panenan Sel HeLa :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/ml
Volume panenan sel Hela =
1×10 6
54,75×10 4
= 1,2 ml di tambahkan media kultur hingga
10 ml untuk 1 plate.
Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel
Jumlah sel/ml :
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D
× 104
4
357
∑sel/ml =
4
∑sel/mL =
= 89,25 x 104 sel/ml
68
Volume Panenan Sel Vero :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/ml
Volume panenan sel =
1 × 106
89,25 × 104
= 1,2 ml di tambahkan media kultur
hingga 10 ml untuk 1 plate.
69
Lampiran 12. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap Sel Hela
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,678
0,678
0,669
0,675
Absorbansi kontrol
Media (b)
0,078
0,080
0,108
0,089
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Kadar
Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media
×100%
Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media
Absorbansi
1
2
3
Ratarata
(c)
c-b
a-b
%
Hidup
%
Mati
500
0,135 0,159
0,163 0,152
0,064 0,586 11
89
250
0,114 0,122
0,215 0,150
0,062 0,586 11
89
125
0,275 0,317
0,243 0,278
0,190 0,586 32
68
62,5
0,602 0,493
0,522 0,539
0,450 0,586 77
23
31,25
0,330 0,400
0,548 0,426
0,337 0,586 58
42
15,625 0,507 0,509
0,507 0,508
0,419 0,586 71
29
70
Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap Sel Vero
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,914
0,874
0,892
0,893
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,058
0,057
0,056
0,057
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media
× 100%
1
2
3
RataRata
(c)
500
0,102
0,095
0,093
0,123
0,066 0,836
8
92
250
0,095
0,091
0,103
0,122
0,065 0,836
8
92
125
0,620
0,684
0,663
0,546
0,489 0,836
58
42
62,5
0,795
0,786
0,822
0,653
0,596 0,836
71
29
31,25
0,821
0,816
0,821
0,669
0,612 0,836
73
27
15,625 0,849
0,884
0,629
0,643
0,586 0,836
70
30
Kadar
Absorbansi
71
c-b
a-b
%
Hidup
%
Mati
Lampiran 14. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) Sel HeLa menggunakan analisa Probit SPSS
22.0
Confidence Limits
Probability
5% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
stimate
wer Bound
LOGITa
400.132 826.709
.010
.020 553.677 544.053
.030 303.433 423.246
.040 688.011 352.629
.050 322.997 305.020
.060 081.889 270.145
.070 10.993 243.164
.080 83.673 221.464
.090 85.227 203.495
.100 06.884 188.274
.150 74.593 136.023
.200 60.491 103.508
.250 92.968
79.664
.300 48.475
60.194
.350 17.021
43.106
.400 93.653
27.831
.450 75.642
15.268
.500 61.357
6.893
.550 49.771
2.612
.600 40.199
.862
.650 32.171
.252
.700 25.356
.064
.750 19.510
.014
.800 14.452
.002
.850 10.050
.000
.900 6.203
.000
.910 5.494
.000
.920 4.804
.000
.930 4.133
.000
.940 3.480
.000
.950 2.846
.000
.960 2.230
.000
.970 1.634
.000
.980 1.059
.000
.990 .509
.000
heterogeneity factor is used.
ogarithm base = 10.
Upper Bound
95% Confidence Limits for
log(konsentrasi ekstrak)b
Estimate
wer Bound per Bound
294928872902.620
3.869
2.917
14.131
0602380241.128
766230411.043
60812094.903
7994947.324
1488908.535
151497.558
711010.173
89937.836
00634.782
5578.026
222.112
29.914
0.746
4.764
781
824
974
798
468
63
13
33
19
52
50
81
93
72
04
69
36
57
6
7
3.551
3.362
3.227
3.122
3.034
2.960
2.894
2.836
2.783
2.574
2.416
2.285
2.172
2.068
1.972
1.879
1.788
1.697
1.604
1.507
1.404
1.290
1.160
1.002
.793
.740
.682
.616
.542
.454
.348
.213
.025
-.294
2.736
2.627
2.547
2.484
2.432
2.386
2.345
2.309
2.275
2.134
2.015
1.901
1.780
1.635
1.445
1.184
.838
.417
-.065
-.599
-1.192
-1.858
-2.632
-3.578
-4.844
-5.163
-5.517
-5.913
-6.367
-6.899
-7.543
-8.365
-9.514
11.459
12.188
11.040
10.219
9.576
9.046
8.593
8.198
7.846
7.528
6.271
5.337
4.581
3.944
3.399
2.943
2.585
2.324
2.139
2.002
1.891
1.794
1.701
1.606
1.499
1.366
1.334
1.299
1.259
1.215
1.163
1.102
1.024
.916
.735
72
Lampiran 15. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) Sel Vero menggunakan analisa Probit SPSS
22.0
Confidence Limits
95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for
log(konsentrasi ekstrak)b
Probability
stimate
Lower
Bound
Upper Bound
stimate
Lower
Bound er Bound
GITa
7057.890
756.125 30386537118505080000000000.000
3.849
2.879 25.483
3552.467 517.894
7069538606477302000000.000
3.551
2.714
21.849
2367.534 412.462
50518930414233264000.000
3.374
2.615
19.703
1769.898 349.447
1465848446021061630.000
3.248
2.543
18.166
1409.008
306.247
91608645245120256.000
3.149
2.486
16.962
1167.178
993.700
863.108
761.204
679.442
432.549
307.879
232.501
181.923
145.587
118.191
96.776
79.561
65.408
53.557
43.478
34.794
27.225
20.560
14.634
274.170
249.067
228.672
211.632
197.080
146.156
113.537
89.031
68.518
49.877
32.117
16.062
5.188
1.012
.134
.013
.001
.000
.000
.000
9297288845063562.000
1318055024317724.000
238574069440648.340
52028555277888.690
13139977714697.951
56281906272.025
953406895.387
33998793.479
1941602.392
156145.740
17038.974
2670.166
682.012
288.442
170.534
119.598
90.985
71.764
57.115
44.796
3.067
2.997
2.936
2.882
2.832
2.636
2.488
2.366
2.260
2.163
2.073
1.986
1.901
1.816
1.729
1.638
1.542
1.435
1.313
1.165
2.438
2.396
2.359
2.326
2.295
2.165
2.055
1.950
1.836
1.698
1.507
1.206
.715
.005
-.872
-1.872
-2.985
-4.239
-5.694
-7.469
15.968
15.120
14.378
13.716
13.119
10.750
8.979
7.531
6.288
5.194
4.231
3.427
2.834
2.460
2.232
2.078
1.959
1.856
1.757
1.651
73
9.316
8.316
7.334
6.370
5.423
4.492
3.576
2.674
1.782
.897
heterogeneity factor is used.
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
33.442
31.177
28.884
26.545
24.138
21.629
18.972
16.088
12.825
8.794
ogarithm base = 10.
74
.969
.920
.865
.804
.734
.652
.553
.427
.251
-.047
-9.840
0.438
-11.100
-11.843
-12.692
-13.686
-14.890
-16.428
-18.574
-22.208
1.524
1.494
1.461
1.424
1.383
1.335
1.278
1.207
1.108
.944
Lampiran 16. Perhitungan nilai Indeks Selektivitas
Indeks Selektivitas =
=
IC50 Sel Vero
IC50 Sel Hela
79,561 µg/mL
61,357 µg/mL
= 1,29
75
Lampiran 17. Uji Statistik ANOVA Pada Sel HeLa
Descriptives
Abdorbansi Zat
500
250
125
62,25
31,25
15,625
Total
N
Mean
3
3
3
3
3
3
18
.15
.15
.28
.54
.43
.51
.34
Deviation
.015
.056
.037
.056
.111
.001
.170
td. Error
.009
.032
.021
.033
.064
.001
.040
Confidence Interval for
Mean
Minimum
wer Bound per Bound
.11
.19
0.135
.01
.29
0.114
.19
.37
0.243
.40
.68
0.493
.15
.70
0.33
.50
.51
0.507
.26
.43
0.114
Maximum
0.163
0.215
0.317
0.602
0.548
0.509
0.602
ANOVA
Abdorbansi Zat
een Groups
n Groups
Sum of Squares
.450
.041
.491
Df
5
12
17
Mean Square
.090
.003
F
26.568
Sig.
.000
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable: Abdorbansi Zat
(I) Kadar Daun Afrika
y HSD
5
5
25
) Kadar
an Difference
Daun
(I-J)
Afrika
.002
-.126
5
-.387*
5
-.274*
25
-.355*
-.002
-.128
5
-.389*
5
-.276*
25
-.357*
.126
.128
5
-.261*
5
-.148
25
-.229*
.387*
.389*
.261*
5
.113
25
.031
.274*
.276*
.148
5
-.113
25
-.082
.355*
.357*
.229*
5
-.031
76
d. Error
Sig.
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.000
.158
.000
.001
.000
.000
.148
.000
.001
.000
.158
.148
.002
.076
.004
.000
.000
.002
.238
.983
.001
.001
.076
.238
.546
.000
.000
.004
.983
Confidence Interval
Lower
Bound per Bound
-.16
.16
-.29
.03
-.55
-.23
-.43
-.11
-.51
-.20
-.16
.16
-.29
.03
-.55
-.23
-.44
-.12
-.52
-.20
-.03
.29
-.03
.29
-.42
-.10
-.31
.01
-.39
-.07
.23
.55
.23
.55
.10
.42
-.05
.27
-.13
.19
.11
.43
.12
.44
-.01
.31
-.27
.05
-.24
.08
.20
.51
.20
.52
.07
.39
-.19
.13
5
.082
.002
-.126*
-.387*
-.274*
-.355*
-.002
-.128*
-.389*
-.276*
-.357*
.126*
.128*
-.261*
-.148*
-.229*
.387*
.389*
.261*
.113*
.031
.274*
.276*
.148*
-.113*
-.082
.355*
.357*
.229*
-.031
.082
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
25
5
5
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.546
.967
.021
.000
.000
.000
.967
.020
.000
.000
.000
.021
.020
.000
.009
.000
.000
.000
.000
.035
.522
.000
.000
.009
.035
.111
.000
.000
.000
.522
.111
-.08
-.10
-.23
-.49
-.38
-.46
-.11
-.23
-.49
-.38
-.46
.02
.02
-.36
-.25
-.33
.28
.29
.16
.01
-.07
.17
.17
.04
-.22
-.19
.25
.25
.13
-.13
-.02
he mean difference is significant at the 0.05 level.
Homogeneous Subsets
Abdorbansi Zat
y HSDa
Kadar Daun Afrika
250
500
125
31,25
15,625
62,25
N
3
3
3
3
3
3
1
.15
.15
.28
.148
ns for groups in homogeneous subsets are displayed.
es Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
77
Subset for alpha = 0.05
2
3
.28
.43
.076
.43
.51
.54
.238
.24
.11
-.02
-.28
-.17
-.25
.10
-.02
-.29
-.17
-.25
.23
.23
-.16
-.04
-.13
.49
.49
.36
.22
.13
.38
.38
.25
-.01
.02
.46
.46
.33
.07
.19
Lampiran 18. Uji Statistik ANOVA Pada Sel Vero
Descriptives
Abdorbansi Zat
Confidence Interval for
Mean
Minimum
wer Bound per Bound
N
Mean
. Deviation
d. Error
Maximum
500
4
12325
.053307
026653
03843
.20807
.093
.203
250
4
12175
.051078
025539
04047
.20303
.091
.198
125
4
54550
.221938
110969
19235
.89865
.215
.684
62,25
4
65275
.296894
148447
18032
1.12518
.208
.822
31,25
4
66850
.301676
150838
18847
1.14853
.216
.821
15,625
4
64250
.310879
155439
14782
1.13718
.208
.884
Total
24
45904
.322202
065769
32299
.59510
.091
.884
ANOVA
Abdorbansi Zat
Sum of Squares
df
Mean Square
F
ween Groups
1.396
5
.279
in Groups
.992
18
.055
2.388
23
l
Sig.
5.069
.004
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable: Abdorbansi Zat
adar Daun Afrika
y HSD
Kadar
Daun n Difference
Afrika
(I-J)
.001500
.422250
5
.529500*
5
.545250*
25
.519250
.001500
.423750
5
.531000*
5
.546750*
25
.520750
.422250
.423750
5
.107250
5
.123000
25
.097000
78
Confidence Interval
d. Error
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
Sig.
000
163
049
040
055
000
160
048
040
054
163
160
986
974
991
wer Bound
.52592
.94967
1.05692
1.07267
1.04667
.52892
.95117
1.05842
1.07417
1.04817
.10517
.10367
.63467
.65042
.62442
er Bound
52892
0517
00208
01783
00817
52592
0367
00358
01933
00667
94967
95117
42017
40442
43042
5
5
25
5
5
25
25
5
5
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
25
5
5
he mean difference is significant at the 0.05 level.
529500*
531000*
.107250
.015750
.010250
545250*
546750*
.123000
.015750
.026000
.519250
.520750
.097000
.010250
.026000
.001500
.422250*
.529500*
.545250*
.519250*
.001500
.423750*
.531000*
.546750*
.520750*
422250*
423750*
.107250
.123000
.097000
529500*
531000*
.107250
.015750
.010250
545250*
546750*
.123000
.015750
.026000
519250*
520750*
.097000
.010250
.026000
79
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
049
048
986
000
000
040
040
974
000
000
055
054
991
000
000
993
020
005
004
006
993
020
005
004
006
020
020
526
468
566
005
005
526
925
951
004
004
468
925
877
006
006
566
951
877
00208
00358
.42017
.54317
.51717
01783
01933
.40442
.51167
.50142
.00817
.00667
.43042
.53767
.55342
.34717
.77092
.87817
.89392
.86792
.35017
.77242
.87967
.89542
.86942
07358
07508
.45592
.47167
.44567
18083
18233
.24142
.36442
.33842
19658
19808
.22567
.33292
.32267
17058
17208
.25167
.35892
.37467
05692
05842
63467
51167
53767
07267
07417
65042
54317
55342
04667
04817
62442
51717
50142
5017
07358
18083
19658
17058
4717
07508
18233
19808
17208
77092
77242
24142
22567
25167
87817
87967
45592
3292
5892
89392
89542
47167
6442
7467
86792
86942
44567
3842
2267
Homogeneous Subsets
Abdorbansi Zat
ar Daun Afrika
N
y HSDa
25
5
5
4
4
4
4
4
4
ns for groups in homogeneous subsets are displayed.
es Harmonic Mean Sample Size = 4,000.
80
Subset for alpha = 0.05
1
2
.12175
.12325
.54550
.54550
.64250
.64250
.65275
.66850
.054
.974
Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media RPMI
RPMI Sachet
2 g Hepes
2g
Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril
Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)
Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 80 C
Media RPMI
81
Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media M199
M199 Sachet
2 g Hepes
2g
Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril
Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)
Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 80 C
Media M199
82
Lampiran 21. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK RPMI)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizone
(amphoteri
cin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomis
in (1%)
RPMI ad
100%
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK RPMI
Disimpan pada suhu 2 – 80C
Media Kultur
Lengkap (MK RPMI)
83
Lampiran 22. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK M199)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizone
(amphoterici
n B) (0,5%)
PenisilinStreptomis
in (1%)
M199 ad
100%
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK
M199
Disimpan pada suhu 2 – 80C
Media Kultur
Lengkap (MK M199)
84
Lampiran 23. Bagan Penumbuhan Sel HeLa dan Vero
Sel HeLa dan
Diambil dari tangki nitrogen atau freezer
Diambil beberapa tetes
Dimasukkan kedalam konikel yg berisi
RPMI/M199
Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatan
Ditambahkan 4 ml MK RPMI
Di resuspensi hingga homogen
Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask
Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel HeLa dan
85
Lampiran 24. Bagan Panen Sel HeLa dan Vero
Sel HeLa dan Vero,
alat, dan bahan
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80%
Dibuang MK dari flask dengan mikropipet
Dicuci sel 2x dengan PBS
Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%
Diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
Ditambahkan 4 ml MK
Di resuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
Ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen
HeLa dan Vero
86
Lampiran 25. Bagan Penghitungan Sel HeLa dan Vero
Kultur Sel
HeLa dan
V
Diambil 10µl panenan sel
Dipipetkan kedalam hemositometer
Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel
HeLa dan
Vero
87
Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanol
Ditimbang sebanyak 5 mg
Dimasukkan kedalam polytube
Dilarutkan dalam 50 µl DMSO
Di vortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh
konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml,
125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml, 15,625 µg/ml
Larutan Uji
88
Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik
Sel HeLa dan
Vero
Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
kepadatan 1 x 104
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru
Ditambahkan larutan uji
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml)
Diinkubasi selama 4-6 jam
Ditambahkan SDS (sebagai stopper)
Dibungkus dengan aluminium foil
Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Absorban
Dihitung % sel hidup
Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan
SPSS
Nilai IC50
89
58
Lampiran 2. Ethical clearance
59
Lampiran 3. Karakteristik tumbuhan daun Afrika
Tumbuhan Afrika
Daun Afrika
60
Lampiran 4. Gambar Sel HeLa yang telah konfluen (perbesaran 10x10)
61
Lampiran 5. Gambar Sel Vero yang telah konfluen (perbesaran 10x10)
62
Lampiran 6. Gambar Sel HeLa dalam kamar hitung (perbesaran 10x10)
63
Lampiran 7. Gambar Sel Vero dalam kamar hitung (perbesaran 10x10)
64
Lampiran 8. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa (perbesaran 10x10)
setelah pemberian ekstrak
Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml
65
Lampiran 9. Gambar morfologi sel normal Vero (perbesaran 10x10) setelah
pemberian ekstrak
Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml
66
Lampiran 10. Gambar ELISA Reader, Mikroskop Inverted
Keterangan : Elisa Reader
Keterangan : Mikroskop Inverted
67
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel pada hemositometer
Jumlah Sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel
Jumlah sel/ml :
∑sel/mL =
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D
× 104
4
∑sel/ml =
219
4
= 54,75 x 104 sel/ml
Volume Panenan Sel HeLa :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/ml
Volume panenan sel Hela =
1×10 6
54,75×10 4
= 1,2 ml di tambahkan media kultur hingga
10 ml untuk 1 plate.
Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel
Jumlah sel/ml :
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D
× 104
4
357
∑sel/ml =
4
∑sel/mL =
= 89,25 x 104 sel/ml
68
Volume Panenan Sel Vero :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/ml
Volume panenan sel =
1 × 106
89,25 × 104
= 1,2 ml di tambahkan media kultur
hingga 10 ml untuk 1 plate.
69
Lampiran 12. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap Sel Hela
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,678
0,678
0,669
0,675
Absorbansi kontrol
Media (b)
0,078
0,080
0,108
0,089
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Kadar
Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media
×100%
Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media
Absorbansi
1
2
3
Ratarata
(c)
c-b
a-b
%
Hidup
%
Mati
500
0,135 0,159
0,163 0,152
0,064 0,586 11
89
250
0,114 0,122
0,215 0,150
0,062 0,586 11
89
125
0,275 0,317
0,243 0,278
0,190 0,586 32
68
62,5
0,602 0,493
0,522 0,539
0,450 0,586 77
23
31,25
0,330 0,400
0,548 0,426
0,337 0,586 58
42
15,625 0,507 0,509
0,507 0,508
0,419 0,586 71
29
70
Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap Sel Vero
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,914
0,874
0,892
0,893
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,058
0,057
0,056
0,057
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media
× 100%
1
2
3
RataRata
(c)
500
0,102
0,095
0,093
0,123
0,066 0,836
8
92
250
0,095
0,091
0,103
0,122
0,065 0,836
8
92
125
0,620
0,684
0,663
0,546
0,489 0,836
58
42
62,5
0,795
0,786
0,822
0,653
0,596 0,836
71
29
31,25
0,821
0,816
0,821
0,669
0,612 0,836
73
27
15,625 0,849
0,884
0,629
0,643
0,586 0,836
70
30
Kadar
Absorbansi
71
c-b
a-b
%
Hidup
%
Mati
Lampiran 14. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) Sel HeLa menggunakan analisa Probit SPSS
22.0
Confidence Limits
Probability
5% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
stimate
wer Bound
LOGITa
400.132 826.709
.010
.020 553.677 544.053
.030 303.433 423.246
.040 688.011 352.629
.050 322.997 305.020
.060 081.889 270.145
.070 10.993 243.164
.080 83.673 221.464
.090 85.227 203.495
.100 06.884 188.274
.150 74.593 136.023
.200 60.491 103.508
.250 92.968
79.664
.300 48.475
60.194
.350 17.021
43.106
.400 93.653
27.831
.450 75.642
15.268
.500 61.357
6.893
.550 49.771
2.612
.600 40.199
.862
.650 32.171
.252
.700 25.356
.064
.750 19.510
.014
.800 14.452
.002
.850 10.050
.000
.900 6.203
.000
.910 5.494
.000
.920 4.804
.000
.930 4.133
.000
.940 3.480
.000
.950 2.846
.000
.960 2.230
.000
.970 1.634
.000
.980 1.059
.000
.990 .509
.000
heterogeneity factor is used.
ogarithm base = 10.
Upper Bound
95% Confidence Limits for
log(konsentrasi ekstrak)b
Estimate
wer Bound per Bound
294928872902.620
3.869
2.917
14.131
0602380241.128
766230411.043
60812094.903
7994947.324
1488908.535
151497.558
711010.173
89937.836
00634.782
5578.026
222.112
29.914
0.746
4.764
781
824
974
798
468
63
13
33
19
52
50
81
93
72
04
69
36
57
6
7
3.551
3.362
3.227
3.122
3.034
2.960
2.894
2.836
2.783
2.574
2.416
2.285
2.172
2.068
1.972
1.879
1.788
1.697
1.604
1.507
1.404
1.290
1.160
1.002
.793
.740
.682
.616
.542
.454
.348
.213
.025
-.294
2.736
2.627
2.547
2.484
2.432
2.386
2.345
2.309
2.275
2.134
2.015
1.901
1.780
1.635
1.445
1.184
.838
.417
-.065
-.599
-1.192
-1.858
-2.632
-3.578
-4.844
-5.163
-5.517
-5.913
-6.367
-6.899
-7.543
-8.365
-9.514
11.459
12.188
11.040
10.219
9.576
9.046
8.593
8.198
7.846
7.528
6.271
5.337
4.581
3.944
3.399
2.943
2.585
2.324
2.139
2.002
1.891
1.794
1.701
1.606
1.499
1.366
1.334
1.299
1.259
1.215
1.163
1.102
1.024
.916
.735
72
Lampiran 15. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) Sel Vero menggunakan analisa Probit SPSS
22.0
Confidence Limits
95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for
log(konsentrasi ekstrak)b
Probability
stimate
Lower
Bound
Upper Bound
stimate
Lower
Bound er Bound
GITa
7057.890
756.125 30386537118505080000000000.000
3.849
2.879 25.483
3552.467 517.894
7069538606477302000000.000
3.551
2.714
21.849
2367.534 412.462
50518930414233264000.000
3.374
2.615
19.703
1769.898 349.447
1465848446021061630.000
3.248
2.543
18.166
1409.008
306.247
91608645245120256.000
3.149
2.486
16.962
1167.178
993.700
863.108
761.204
679.442
432.549
307.879
232.501
181.923
145.587
118.191
96.776
79.561
65.408
53.557
43.478
34.794
27.225
20.560
14.634
274.170
249.067
228.672
211.632
197.080
146.156
113.537
89.031
68.518
49.877
32.117
16.062
5.188
1.012
.134
.013
.001
.000
.000
.000
9297288845063562.000
1318055024317724.000
238574069440648.340
52028555277888.690
13139977714697.951
56281906272.025
953406895.387
33998793.479
1941602.392
156145.740
17038.974
2670.166
682.012
288.442
170.534
119.598
90.985
71.764
57.115
44.796
3.067
2.997
2.936
2.882
2.832
2.636
2.488
2.366
2.260
2.163
2.073
1.986
1.901
1.816
1.729
1.638
1.542
1.435
1.313
1.165
2.438
2.396
2.359
2.326
2.295
2.165
2.055
1.950
1.836
1.698
1.507
1.206
.715
.005
-.872
-1.872
-2.985
-4.239
-5.694
-7.469
15.968
15.120
14.378
13.716
13.119
10.750
8.979
7.531
6.288
5.194
4.231
3.427
2.834
2.460
2.232
2.078
1.959
1.856
1.757
1.651
73
9.316
8.316
7.334
6.370
5.423
4.492
3.576
2.674
1.782
.897
heterogeneity factor is used.
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
.000
33.442
31.177
28.884
26.545
24.138
21.629
18.972
16.088
12.825
8.794
ogarithm base = 10.
74
.969
.920
.865
.804
.734
.652
.553
.427
.251
-.047
-9.840
0.438
-11.100
-11.843
-12.692
-13.686
-14.890
-16.428
-18.574
-22.208
1.524
1.494
1.461
1.424
1.383
1.335
1.278
1.207
1.108
.944
Lampiran 16. Perhitungan nilai Indeks Selektivitas
Indeks Selektivitas =
=
IC50 Sel Vero
IC50 Sel Hela
79,561 µg/mL
61,357 µg/mL
= 1,29
75
Lampiran 17. Uji Statistik ANOVA Pada Sel HeLa
Descriptives
Abdorbansi Zat
500
250
125
62,25
31,25
15,625
Total
N
Mean
3
3
3
3
3
3
18
.15
.15
.28
.54
.43
.51
.34
Deviation
.015
.056
.037
.056
.111
.001
.170
td. Error
.009
.032
.021
.033
.064
.001
.040
Confidence Interval for
Mean
Minimum
wer Bound per Bound
.11
.19
0.135
.01
.29
0.114
.19
.37
0.243
.40
.68
0.493
.15
.70
0.33
.50
.51
0.507
.26
.43
0.114
Maximum
0.163
0.215
0.317
0.602
0.548
0.509
0.602
ANOVA
Abdorbansi Zat
een Groups
n Groups
Sum of Squares
.450
.041
.491
Df
5
12
17
Mean Square
.090
.003
F
26.568
Sig.
.000
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable: Abdorbansi Zat
(I) Kadar Daun Afrika
y HSD
5
5
25
) Kadar
an Difference
Daun
(I-J)
Afrika
.002
-.126
5
-.387*
5
-.274*
25
-.355*
-.002
-.128
5
-.389*
5
-.276*
25
-.357*
.126
.128
5
-.261*
5
-.148
25
-.229*
.387*
.389*
.261*
5
.113
25
.031
.274*
.276*
.148
5
-.113
25
-.082
.355*
.357*
.229*
5
-.031
76
d. Error
Sig.
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.000
.158
.000
.001
.000
.000
.148
.000
.001
.000
.158
.148
.002
.076
.004
.000
.000
.002
.238
.983
.001
.001
.076
.238
.546
.000
.000
.004
.983
Confidence Interval
Lower
Bound per Bound
-.16
.16
-.29
.03
-.55
-.23
-.43
-.11
-.51
-.20
-.16
.16
-.29
.03
-.55
-.23
-.44
-.12
-.52
-.20
-.03
.29
-.03
.29
-.42
-.10
-.31
.01
-.39
-.07
.23
.55
.23
.55
.10
.42
-.05
.27
-.13
.19
.11
.43
.12
.44
-.01
.31
-.27
.05
-.24
.08
.20
.51
.20
.52
.07
.39
-.19
.13
5
.082
.002
-.126*
-.387*
-.274*
-.355*
-.002
-.128*
-.389*
-.276*
-.357*
.126*
.128*
-.261*
-.148*
-.229*
.387*
.389*
.261*
.113*
.031
.274*
.276*
.148*
-.113*
-.082
.355*
.357*
.229*
-.031
.082
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
25
5
5
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.048
.546
.967
.021
.000
.000
.000
.967
.020
.000
.000
.000
.021
.020
.000
.009
.000
.000
.000
.000
.035
.522
.000
.000
.009
.035
.111
.000
.000
.000
.522
.111
-.08
-.10
-.23
-.49
-.38
-.46
-.11
-.23
-.49
-.38
-.46
.02
.02
-.36
-.25
-.33
.28
.29
.16
.01
-.07
.17
.17
.04
-.22
-.19
.25
.25
.13
-.13
-.02
he mean difference is significant at the 0.05 level.
Homogeneous Subsets
Abdorbansi Zat
y HSDa
Kadar Daun Afrika
250
500
125
31,25
15,625
62,25
N
3
3
3
3
3
3
1
.15
.15
.28
.148
ns for groups in homogeneous subsets are displayed.
es Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
77
Subset for alpha = 0.05
2
3
.28
.43
.076
.43
.51
.54
.238
.24
.11
-.02
-.28
-.17
-.25
.10
-.02
-.29
-.17
-.25
.23
.23
-.16
-.04
-.13
.49
.49
.36
.22
.13
.38
.38
.25
-.01
.02
.46
.46
.33
.07
.19
Lampiran 18. Uji Statistik ANOVA Pada Sel Vero
Descriptives
Abdorbansi Zat
Confidence Interval for
Mean
Minimum
wer Bound per Bound
N
Mean
. Deviation
d. Error
Maximum
500
4
12325
.053307
026653
03843
.20807
.093
.203
250
4
12175
.051078
025539
04047
.20303
.091
.198
125
4
54550
.221938
110969
19235
.89865
.215
.684
62,25
4
65275
.296894
148447
18032
1.12518
.208
.822
31,25
4
66850
.301676
150838
18847
1.14853
.216
.821
15,625
4
64250
.310879
155439
14782
1.13718
.208
.884
Total
24
45904
.322202
065769
32299
.59510
.091
.884
ANOVA
Abdorbansi Zat
Sum of Squares
df
Mean Square
F
ween Groups
1.396
5
.279
in Groups
.992
18
.055
2.388
23
l
Sig.
5.069
.004
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable: Abdorbansi Zat
adar Daun Afrika
y HSD
Kadar
Daun n Difference
Afrika
(I-J)
.001500
.422250
5
.529500*
5
.545250*
25
.519250
.001500
.423750
5
.531000*
5
.546750*
25
.520750
.422250
.423750
5
.107250
5
.123000
25
.097000
78
Confidence Interval
d. Error
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
Sig.
000
163
049
040
055
000
160
048
040
054
163
160
986
974
991
wer Bound
.52592
.94967
1.05692
1.07267
1.04667
.52892
.95117
1.05842
1.07417
1.04817
.10517
.10367
.63467
.65042
.62442
er Bound
52892
0517
00208
01783
00817
52592
0367
00358
01933
00667
94967
95117
42017
40442
43042
5
5
25
5
5
25
25
5
5
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
5
5
25
25
5
5
he mean difference is significant at the 0.05 level.
529500*
531000*
.107250
.015750
.010250
545250*
546750*
.123000
.015750
.026000
.519250
.520750
.097000
.010250
.026000
.001500
.422250*
.529500*
.545250*
.519250*
.001500
.423750*
.531000*
.546750*
.520750*
422250*
423750*
.107250
.123000
.097000
529500*
531000*
.107250
.015750
.010250
545250*
546750*
.123000
.015750
.026000
519250*
520750*
.097000
.010250
.026000
79
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
165959
049
048
986
000
000
040
040
974
000
000
055
054
991
000
000
993
020
005
004
006
993
020
005
004
006
020
020
526
468
566
005
005
526
925
951
004
004
468
925
877
006
006
566
951
877
00208
00358
.42017
.54317
.51717
01783
01933
.40442
.51167
.50142
.00817
.00667
.43042
.53767
.55342
.34717
.77092
.87817
.89392
.86792
.35017
.77242
.87967
.89542
.86942
07358
07508
.45592
.47167
.44567
18083
18233
.24142
.36442
.33842
19658
19808
.22567
.33292
.32267
17058
17208
.25167
.35892
.37467
05692
05842
63467
51167
53767
07267
07417
65042
54317
55342
04667
04817
62442
51717
50142
5017
07358
18083
19658
17058
4717
07508
18233
19808
17208
77092
77242
24142
22567
25167
87817
87967
45592
3292
5892
89392
89542
47167
6442
7467
86792
86942
44567
3842
2267
Homogeneous Subsets
Abdorbansi Zat
ar Daun Afrika
N
y HSDa
25
5
5
4
4
4
4
4
4
ns for groups in homogeneous subsets are displayed.
es Harmonic Mean Sample Size = 4,000.
80
Subset for alpha = 0.05
1
2
.12175
.12325
.54550
.54550
.64250
.64250
.65275
.66850
.054
.974
Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media RPMI
RPMI Sachet
2 g Hepes
2g
Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril
Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)
Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 80 C
Media RPMI
81
Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media M199
M199 Sachet
2 g Hepes
2g
Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril
Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)
Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 80 C
Media M199
82
Lampiran 21. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK RPMI)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizone
(amphoteri
cin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomis
in (1%)
RPMI ad
100%
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK RPMI
Disimpan pada suhu 2 – 80C
Media Kultur
Lengkap (MK RPMI)
83
Lampiran 22. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK M199)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizone
(amphoterici
n B) (0,5%)
PenisilinStreptomis
in (1%)
M199 ad
100%
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK
M199
Disimpan pada suhu 2 – 80C
Media Kultur
Lengkap (MK M199)
84
Lampiran 23. Bagan Penumbuhan Sel HeLa dan Vero
Sel HeLa dan
Diambil dari tangki nitrogen atau freezer
Diambil beberapa tetes
Dimasukkan kedalam konikel yg berisi
RPMI/M199
Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatan
Ditambahkan 4 ml MK RPMI
Di resuspensi hingga homogen
Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask
Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel HeLa dan
85
Lampiran 24. Bagan Panen Sel HeLa dan Vero
Sel HeLa dan Vero,
alat, dan bahan
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80%
Dibuang MK dari flask dengan mikropipet
Dicuci sel 2x dengan PBS
Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%
Diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
Ditambahkan 4 ml MK
Di resuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
Ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen
HeLa dan Vero
86
Lampiran 25. Bagan Penghitungan Sel HeLa dan Vero
Kultur Sel
HeLa dan
V
Diambil 10µl panenan sel
Dipipetkan kedalam hemositometer
Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel
HeLa dan
Vero
87
Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanol
Ditimbang sebanyak 5 mg
Dimasukkan kedalam polytube
Dilarutkan dalam 50 µl DMSO
Di vortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh
konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml,
125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml, 15,625 µg/ml
Larutan Uji
88
Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik
Sel HeLa dan
Vero
Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
kepadatan 1 x 104
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru
Ditambahkan larutan uji
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml)
Diinkubasi selama 4-6 jam
Ditambahkan SDS (sebagai stopper)
Dibungkus dengan aluminium foil
Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Absorban
Dihitung % sel hidup
Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan
SPSS
Nilai IC50
89