Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D
Lampiran 1. Hasil identifikasi Simplisia kulit batang Tanjung( Mimusopsi cortex)
Lampiran 2. Gambar Simplisia Kulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex)
Lampiran 3. Perhitungan Kadar Air Simplisia Kulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No. Berat sampel (g) Volume awal (ml) Volume akhir (ml) 1. 5,003 1,80 2,20 2. 5,026 2,20 2,60 3. 5,035 2,60 3,00 % Kadar air = 100% x sampel berat − awal volume akhir volume
1. Kadar air = % 7,99 100% x
5,003 1,80 - 2,20
=
2. Kadar air = % 7,95 100% x
5,026 2,20 - 2,60
=
3. Kadar air = % ,94
7 100% x 5,035
2,60 - 3,00 =
% Rata-rata kadar air = % 7,96
3 % 7,94 % 7,95 % 7,99 =
Lampiran 4. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Air Simplisia Kulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No. Berat sampel (g) Berat sari (g) 1. 5,008 0,014 2. 5,014 0,014 3. 5,007 0,017 berat sari (g) 100
% Kadar sari larut dalam air = x x 100%
berat sampel (g)
20
0,014 100
1. Kadar sari larut dalam air = x x 100% = 1,40% 5,008
20 0,014 100
2. Kadar sari larut dalam air = x x 100% = 1,40% 5,014
20 0,017 100
3. Kadar sari larut dalam air = x x 100% = 1,70% 5,007
20
- 1,40% 1,40% 1,70%
% Rata-rata kadar sari larut dalam air = =
1 , 50 %
3
3 3,09% 2,19% 2,29% =
5,012 0,022
2
% 52 ,
= % Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =
5,007 0.031
20 100 x
3. Kadar sari larut dalam etanol = 3,09% 100% x
=
20 100 x
Lampiran 5. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Etanol SimplisiaKulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No. Berat sampel (g) Berat sari (g) 1. 5,008 0,023 2. 5,012 0,022 3. 5,007 0,031 % Kadar sari larut dalam etanol = 100% x
2. Kadar sari larut dalam etanol = 2,19% 100% x
=
5,008 0,023
20 100 x
1. Kadar sari larut dalam etanol = 2,29% 100% x
(g) sari berat
20 100 x (g) sampel berat
Lampiran 6. Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia Kulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No. Berat sampel (g) Berat abu (g) 1. 2,0062 0,0729 2. 2,0041 0,0907 3. 2,0032 0,0851 berat abu (g)
% Kadar abu total = x 100% berat sampel (g)
0,0729
1. Kadar abu total = x 100% = 3,63% 2,0062 0,0907 x 100% = 4,52%
2. Kadar abu total = 2,0041 0,0851
3. Kadar abu total = x 100% = 4,24% 2,0032
- 3,63% 4,52% 4,24%
% Rata-rata kadar abu total = =
4 , 13 %
3
Lampiran 7. Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Simplisia kulit batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No. Berat sampel (g) Berat abu (g) 1. 2,0047 0,0028 2. 2,0033 0,0025 3. 2,0109 0,0024 % Kadar abu tidak larut dalam asam = 100% x (g) sampel berat
(g) abu berat
1. Kadar abu tidak larut dalam asam = % 100% 13 , x 2,0062 0,0028
=
2. Kadar abu tidak larut dalam asam = %
100% 12 , x 2,0041
0,0025 =
3. Kadar abu tidak larut dalam asam = % 100% 11 , x 2,0032 0,0024
= % Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =
3 % % 11 , % 12 ,
13 ,
=0,12%
Lampiran 8. Rendemen Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung
Berat simplisia kering = 200 g Berat ekstrak =22,683 g Rendemen =
%
, =
% =11,84%
Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sel pada hemositometer
Jumlah sel total (A + B + C + D) = 300 sel Jumlah sel/ml :
∑ + ∑ + ∑ + ∑ ×
∑ / =
4
= 75 x 10 sel/ml Volume Panenan Sel :
= /
= 1,33 ml di tambahkan media kultur hingga 10 ml untuk 1 plate.
Lampiran 10. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi
Larutan Uji Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung( Mimusopsi cortex) No.Absorbansi Kontrol Sel (a)
Absorbansi kontrol Media (b)
1 0,730 0,159 2 0,695 0,159
3 0,786 0,166
Rata-Rata 0,737 0,161
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
Kadar Absorbansi (c) Rata-Rata (c) % sel Hidup % sel Hidup Rata-rata
1
2
3
1
2
3
500 0,312 0,276 0,322 0,303 26,79 21,82 25,16 24,59
250 0,274 0,292 0,394 0,320 20,14 24,81 36,77 27,24
125 0,440 0,368 0,392 0,400 49,21 38,99 36,45 41,55
62,5 0,564 0,457 0,566 0,529 70,93 55,60 64,52 63,68
31,25 0,634 0,624 0,624 0,627 83,19 82,59 73,87 79,88
Lampiran 11. Perhitungan nilai IC
50 Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung ( Mimusopsi cortex) menggunakan analisa Probit SPSS 17.0 Warnings Relative Median Potency Estimates are not displayed because there is no grouping variable in the model.
Data Information N of Cases Valid
5 Rejected Missing LOG Transform Cannot be Done Number of Responses > Number of Subjects Control Group
Convergence Information Number of Optimal Solution a Iterations Found PROBIT
Parameter Estimates
95% Confidence Interval Parameter Estimate Std. Error Z Sig. Lower Bound Upper Bound
PRO konsentrasi ekstrak -1.344 .145 -9.246 .000 -1.629 -1.059
a BIT Intercept 2.758 .310 8.897 .000 2.448 3.068Chi-Square Tests a Chi-Square df Sig. b PROBIT Pearson Goodness-of-Fit 5.450 3 .142 Test a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases.
b. Since the significance level is less than .150, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.
Cell Counts and Residuals
Number konsentrasi ekstrakNumber of Subjects Observed Responses
Expected Responses Residual Probability PR OBI T
1 2.699 100 25 19.241 5.759 .192 2 2.398 100 28 32.115 -4.115 .321 3 2.097 100 41 47.610 -6.610 .476 4 1.796 100 64 63.481 .519 .635 5 1.495 100 81 77.312 3.688 .773
Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak) b Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound PROBIT a .010 6072.094 1679.021 185641.373 3.783 3.225 5.269 .020 3806.257 1211.955 78216.743 3.580 3.083 4.893
.030 2830.104 984.510 45246.108 3.452 2.993 4.656 .040 2264.590 841.428 29995.396 3.355 2.925 4.477 .050 1889.035 740.123 21481.855 3.276 2.869 4.332 .060 1618.868 663.260 16175.865 3.209 2.822 4.209 .070 1413.972 602.219 12618.805 3.150 2.780 4.101 .080 1252.618 552.140 10106.818 3.098 2.742 4.005 .090 1121.917 510.040 8262.126 3.050 2.708 3.917 .100 1013.695 473.971 6865.520 3.006 2.676 3.837 .150 666.063 348.268 3203.909 2.824 2.542 3.506 .200 477.041 270.511 1761.881 2.679 2.432 3.246 .250 358.256 215.807 1064.521 2.554 2.334 3.027 .300 277.021 174.124 685.077 2.443 2.241 2.836 .350 218.285 140.501 462.567 2.339 2.148 2.665 .400 174.109 112.226 325.454 2.241 2.050 2.512 .450 139.898 87.876 237.999 2.146 1.944 2.377 .500 112.800 66.927 180.530 2.052 1.826 2.257 .550 90.950 49.378 141.356 1.959 1.694 2.150
.600 73.079 35.269 113.325 1.864 1.547 2.054 .650 58.290 24.377 92.142 1.766 1.387 1.964 .700 45.931 16.254 75.290 1.662 1.211 1.877 .750 35.516 10.369 61.280 1.550 1.016 1.787 .800 26.672 6.227 49.189 1.426 .794 1.692 .850 19.103 3.409 38.376 1.281 .533 1.584 .900 12.552 1.586 28.292 1.099 .200 1.452 .910 11.341 1.317 26.306 1.055 .120 1.420 .920 10.158 1.076 24.314 1.007 .032 1.386 .930 8.999 .861 22.304 .954 -.065 1.348 .940 7.860 .672 20.262 .895 -.173 1.307 .950 6.736 .505 18.167 .828 -.296 1.259 .960 5.619 .362 15.988 .750 -.442 1.204 .970 4.496 .240 13.671 .653 -.620 1.136 .980 3.343 .139 11.112 .524 -.858 1.046 .990 2.095 .058 8.026 .321 -1.234 .904 a. A heterogeneity factor is used.
b. Logarithm base = 10.
Lampiran 12. Bagan Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung ( Mimusopsi cortex)
200 g serbuk simplisia Ditambahkan etanol 96%, biarkan selama 5 hari sambil sesekali diaduk Disaring
Maserat Ampas Dicuci kembali dengan etanol 96% Dibiarkan 2 hari ditempat gelap dan
Sejuk Dienaptuangkan Disaring
Maserat Ampas Dipekatkan dengan rotary evaporator
Ekstrak etanol
Lampiran 13. Bagan Pembuatan Media RPMI RPMISachet
2 g Hepes 2 g NaHCO
3 Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N) Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan Ditampung dalam botol steril Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 8 C Media RPMI
Lampiran 14. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK) Fetal Bovine Fungizone
Penisilin- RPMI ad
Serum (FBS) (amphotericin
Streptomisin 100%
(10%)
B) (0,5%)
(1%) Dicampur Diberi identitas pada botol MK Disimpan pada suhu 2 – 8 C
Media Kultur Lengkap (MK)
Lampiran 15. Bagan Penumbuhan Sel T47D
Sel T47D Diambil dari tangki nitrogen atau freezer
Diambil beberapa tetes Dimasukkan kedalam konikel yg berisi RPMI Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit Dibuang supernatan Ditambahkan 4 ml MK RPMI Di resuspensi hingga homogen Dimasukkan ke dalam flask Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask Dihomogenkan Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted Diberi identitas pada flask Disimpan dalam inkubator CO
2 Sel T47D
Lampiran 16. Bagan Panen Sel T47D
Sel T47D, alat, dan bahan Dipersiapkan dan dikondisikan Diamati apakah sel telah konfluen 80% Dibuang MK dari flask dengan mikropipet Dicuci sel 2x dengan PBS Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25% Diinkubasi dalam inkubator CO
2 selama 5 menit
Ditambahkan 4 ml MK Di resuspensi dengan mikropipet Diamati sel dibawah mikroskop inverted Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol Ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel PanenT47D
Lampiran 17. Bagan Penghitungan SelT47D
Kultur Sel T47D Diambil 10µl panenan sel Dipipetkan kedalam hemositometer Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel T47D
Lampiran 18. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanol Ditimbang sebanyak 5 mg Dimasukkan kedalam polytube Dilarutkan dalam 50 µl DMSO Di vortex Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, dan 31,25 µg/ml
Larutan Uji
Lampiran 19. Bagan Pengujian Sitotoksik
Sel T47D Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
4
kepadatan 1 x 10 Diinkubasi selama 24 jam Dibuang medium Ditambahkan medium baru Ditambahkan larutan uji Diinkubasi selama 24 jam Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam Dicuci dengan PBS Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml) Diinkubasi selama 4-6 jam Ditambahkan SDS (sebagai stopper) Dibungkus dengan aluminium foil Dibiarkan selama 1 malam Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Absorbansi Dihitung % sel hidup Dihitung IC dengan analisa probit menggunakan
50 SPSS 17
Nilai IC
50
Lampiran 20. Gambar Sel T47Dyang telah konfluen (dilihat di bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Lampiran 21. Gambar Sel T47Ddalam kamar hitung (dilihat di bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Lampiran 22. Gambar morfologi sel kanker (dilihat dengan mikroskop
inverted dengan perbesaran 10x10) setelah pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendahKonsentrasi ekstrak 500 µg/ml Konsentrasi ekstrak 250 µg/ml Konsentrasi ekstrak 125 µg/ml Konsentrasi ekstrak 62,5 µg/ml
Konsentrasi ekstrak 31,25 µg/ml
Lampiran 23. Gambar Microplate -96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji
Lampiran 24. Gambar Mikroskop Inverted, Elisa Reader, dan Inkubator CO
2
Glosarium
Analisis Probit Jenisregresidigunakan untuk menganalisisvariabel responbinomial.
Apoptosis Mekanismyang merupakan salah satu jenis
yang sudah tidak diperlukan oleh tubuh.
Brine-Shrimp Lethality Salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang Bioassay bersifat sitotoksik. Metode ini menggunakan larva Artemia salina leach sebagai hewan coba.
Cell Line (Sel kultur) Sel yang digunakan dalam penelitian yang
dikembangkan dan ditumbuhkan/berploriferasi pada media kutur secara in vitro. Sel kultur dapat diambil dari jaringan asal ataupun memperbanyak sel yang sudah ada.
Continous Cell Line Sekelompokselmorfologisseragam yangdapat
diperbanyaksecara in vitrountukwaktu yang tidak tertentu.
FBS(Fetal Bovine Serum yang umumnya digunakansebagai suplemen Serum): untukmedium pertumbuhanbasal dalamkultur sel Hemositometer Perangkat yang awalnya dirancang untuk
penghitungan sel darah. Sekarang juga digunakan untuk menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya.
Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
) buffer, yang berisi kedua kelompok terionisasi positif dan negatif, dimana kelompok amina sekunder dan tersier memberikan muatan positif dan muatan negatif yang ditawarkan oleh sulfonat dan gugus asam karboksilat.
Kanker Istilah yang digunakanuntuk penyakitdi manasel-sel
abnormalmembelahtanpa kontroldan mampumenyerang jaringan lain. Sel-sel kankerdapat menyebarke bagian lain daritubuh melaluidarah dan sistemgetah bening (National Cancer Institute)
Kemoterapi Penggunaan zat
Dalam penggunaan modernnya, istilah ini hampir
( chemotherapy)
merujuk secara eksklusif kepada obat sitostatik yang digunakan untuk merawat
Mitokondria tempat berlangsungnya fungsi
berupa
PBS(Phospate Buffer Larutan buffer yang biasa digunakan dalam Saline) penelitian biologi. Ini adalah berbasis air garam
larutan yang mengandung natrium klorida, natrium fosfat, dan, dalam beberapa formulasi, klorida kalium dan fosfat kalium. Gugus fosfat buffer membantu mempertahankan pH yang konstan. Konsentrasi osmolaritas dan ion dari solusi biasanya cocok dengan tubuh manusia (isotonik).
Fase
Proliferasi
tanpa hambatan
Media Roswell Park Salah satu media yang banyak digunakan untuk
menumbuhkan sel mamalia, terutama sel suspensi,
MemorialInstitute (RPMI) contohnya sel limfosit manusia. Selain itu, media ini
juga dapat digunakan untuk menumbuhkan sel hybrid. Media ini berwarna merah karena adanya phenol red sebagai indikator pH untuk mendeteksi terjadinya perubahan pH akibat metabolisme sel. Jika sisa metabolisme sudah terakumulasi di media, maka warna media akan berubah menjadi kuning. Hal ini menandakan bahwa sel harus dikultur di media baru agar sel tidak mati akibat sisa metabolisme tersebut. Selain itu, RPMI 1640 mengandungCaCl2,Ca(NO3)2.4H2O, KCl,MgSOz7H2O, NaCl, NaHCO, Na2HPO4.7H2O , glukosa, Glutathione, phenol red, berbagai asam amino (L-aspargie, L-Cystine, tirosin, valin, dan sebagainya), serta vitamin (biotin, pantotenat, kolin)
Sel T47D Continous cell line yang diisolasi dari jaringan
tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun.
Sitotoksik Zat/obat yang merusak dan membunuh sel normal
dan sel kanker, serta digunakan untuk menghambat pertumbuhan tumor malignan.
Subkultur Pemindahan sel, jaringan atau organ dari media lama
ke media baru, baik media itu sama maupun berlainan dengan media semula, dengan tujuan memperoleh pertumbuhan baru ataupun perkembangan dari inokulum.
Uji Sitotoksik Salah satu pengembangan metode untuk
memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel.
Viabilitas sel Jumlah sel-sel yang mampu berkembang dalam medium kultur.